عرضی، کوالانسی، ،تثبیت، Vmax، یونی، انفعالات

بین آنزیم و ماده یا سطح مورد استفاده برای تثبیت ،جلوی بازشدن ساختار درهم پیچیده مولکول پروتئین را می گیرد و درنتیجه ،پایداری افزایش می یابد (14) .
روش تثبیت آنزیم به علت سهولت بازیابی و احیای کاتالیست ،امکان عملیات پیوسته ،و سادگی تلخیص محصولات مورد توجه است .اما معمولا کارایی زیست کاتالیستی ضعیف آنزیم تثبیت شده ،سبب کاهش پیشبرد استفاده از فرآیندهای زیستی نسبت به فرآیندهای شیمیایی شده است .بهبود کارایی زیست کاتالیستی با ساخت ساختارهایی به عنوان حامل هایی برای تثبیت آنزیم امکا ن پذیر است (42) و (12) .
1-9-1-اهداف تثبیت آنزیم:
هدف از تثبیت آنزیم ،افزایش مقاومت آنزیم در شرایط شدید درجه حرارت ،pH ،حلال های آلی ،بازیافت و استفاده مجدد از آنزیم است .با وجود این مزایا ،کاربرد صنعتی آن به دلیل هزینه های بستر ،محدودیت های انتقال جرم ،نگرش سنتی ،تغییر در خواص (عملکرد اختصاصی) ،از بین رفتن فعالیت در طی تثبیت ،محدود شده است (19) .
1-9-2-اثرات تثبیت آنزیم روی پارامترهای سنتیکی :
ازمطالعه سنتیکی هیدرولیز لاکتوز توسط لاکتاز ،Km و Vmax برای آنزیم تثبیت شده و آزاد به صورت زیر می باشد:

همان طور که دیده می شود Vmax کمتر از Km تحت تاثیر تثبیت قرار می گیرد .به علت محصور بودن آنزیم تثبیت شده مقدار Km آن در مقایسه با آنزیم محلول بالاتر است .طبیعی است هنگام توصیف پارامترهای کنتیکی یک آنزیم ،km که مستقل از غلظت آنزیم است و Vmax که وابسته به آن می باشد معمولا به عنوان واحدها یا کاتال های فعالیت در میلی گرم پروتئین بیان می شوند .بنابراینKm بر تمایل آنزیم به سوبسترای آن و این که چگونه سرعت واکنش با افزایش [S] به حد اشباع می رسد ،دلالت دارد .لذا در اصطلاح عملی مقدارکم Km نشانگر این است که آنزیم در سطوح پائین سوبسترا کارایی موثر ( به عبارتی v بالا) و در سطوح بالای سوبسترا حالت معکوس دارد .دو آنزیم با یک مقدار Vmax ولی مقادیر کاملاٌ متفاوتKm کارایی بسیار متفاوتی در حین پروسس دارند .از این طریق می توان به وجود سوبستر ای مناسب بر ای هرآنزیمی پی برد . زیرا هرچهKm کوچکتر باشد ،سوبسترا بر ای آنزیم مناسب تر است .بطورکلی سوبسترایی مناسب تر است که نسبت Vm/Km آن کوچکتر باشد. جهت تعیین ثوابت سینتیکی آنزیم ،نیاز به بررسی رفتار سینتیکی آن می باشیم (59) .
1-9-3-مزایای آنزیم های تثبیت شده :
آنزیم ها کاتالیزورهای چندکاره ای هستندکه در زمینه های مختلفی نظیرصنایع غذایی،داروسازی ،شیمی و…به طور گسترده ای به کار گرفته می شوند .برای گسترش کاربرد آن ها در آزمایشگاها و صنایع و نیز برای اطمینان از استفاده مجدد آن ها در تولید ،نیاز به افزایش پایداری آنزیم است .تثبیت می تواند موضوع ناپایداری آنزیم را حل کند .برخی از مزایای آنزیم های تثبیت شده عبارت انداز : پایداری بیشتر آنزیم ،امکان اسفاده چند باره ازیک منبع آنزیمی و جداسازی آسان آن از مخلوط واکنش است .آنزیم ها ترکیبات نسبتا ناپایداری هستند که هزینه خالص سازی آن ها بالاست و زمانی که به صورت محلول در واکنش استفاده می شوند بازیافت آن ها از مخلوط واکنش بسیار مشکل خواهد بود .مشکل اصلی آن ها ، حساس و شکننده بودن آن ها نسبت به شرایط سخت محیطی است که منجر به این امر می شود که نیمه عمر عملکردی آنزیم کاهش یابد .بهترین و موفق ترین روش برای غلبه براین مشکل ،تثبیت آنزیم است (6) .
1-10-روش های تثبیت آنزیم:
اغلب روش های تثبیت به پنج دسته تقسیم می شوند که هرکدام مزایا و معایب خود را دارند:
1-تثبیت با جذب غیر کوالانسی
2-تثبیت از طریق فعل و انفعالات یونی
3-تثبیت با اتصالات کوالانسی
4-تثبیت به وسیله اتصال عرضی آنزیم ها
5-تثبیت به وسیله به دام انداختن در یک ژل پلیمری یا کپسول
1-10-1-تثبیت با جذب غیر کوالانسی:
جذب آنزیم بر روی حامل ها می توانند بوسیله انواع مختلفی از فعل و انفعالات انجام گیرد .آنزیم های دارای سطوح لیپوفیل بالا اتصال خوبی با یک حامل هیدروفوب ایجاد می کنند .نیروهای واندروالسی و تغییرات آنتروپی ،تثبیت آنزیم بر روی حامل را تضمین می کند .باقیمانده های قندی آنزیم های گلیکوزیله شده می تواند جذب از طریق پیوندهای هیدروژنی را اطمینان بخشند .و مناطق سطحی هیدروفیلیک زیادی از آنزیم با حامل هیدروفیل واکنش می دهند(50) .
مزیت تثبیت بوسیله تاثیرات آنتروپی یا پیوندهای هیدروژنی این است که آنزیم پیش تیمار نشده و از نظر شیمیایی تغییر نمی یابد .هم چنین امکان استفاده از آنزیم خام در این نوع تثبیت ها وجود دارد .تغییر شرایط تثبیت به مقدار زیادی نتایج را تغییر می دهد و در نتیجه می تواند دستکاری مستقیم آنزیم را ممکن سازد.عیب مهم تثبیت توسط جذب سطحی این است که آنزیم تمایل به نشت از حامل را هنگام استفاده در محیط های آبی دارد .که اگر حلال های آلی استفاده شود ،به دلیل ماندگاری ذاتی آنزیم ها در چنین محیط هایی ،این موضوع حائز اهمیت نیست(21) .
1-10-2-تثبیت از طریق فعل و انفعالات یونی :
بسته به pH و نقطه ایزوالکتریک محلول ،ممکن است سطح آنزیم دارای بار باشد .با به کارگیری سیستم های مدل سازی می توان توزیع و بار سطحی آنزیم ها را تعیین نمود هر مبدل یونی می تواند از طریق واکنش های قطبی و یونی به عنوان یک حامل در تثبیت آنزیم ها عمل کند .بسته به بار اصلی آنزیم ،مبدل های یونی به صورت منفی (نظیر کربوکسیلات) یا مثبت (گروه های آمینی پروتون دار) باردار می شوند .فعالیت و قابلیت عملکردانتخابی آنزیم ها بسته به pH و دمای به کار رفته درتثبیت متفاوت می باشد که این امر بدلیل یونیزاسیون آنزیم حین فرآیند تثبیت است .مثالی از این نوع ،تثبیت آنزیم بنزآلدئیدلیاز می باشد ؛از طریق کمپلکس ایمیدازول و نیکل متصل به پلی وینیل پیرولیدون به عنوان ماتریکس تثبیت شده و می تواند چندین بار برای تشکیل بنزوئین مورد استفاده قرار گیرد (22) .

شکل 1-3-آنزیم بنزآلدئید لیاز به همراه زنجیره اش از طریق حامل اصلاح شده با نیکل تثبیت شده و تشکیل بنزوئین را کاتالیز می کند .
1-10-3-تثبیت با اتصالات کوالانسی:
پیوند کوالانسی آنزیم به حامل دارای این مزیت است که آنزیم به صورت محکمی ثابت شده و بدین ترتیب امکان شستشوی آن در محیط آب دار به حداقل رسیده و آلودگی پروتئینی محصول روی نمی دهد .در قالب یک قانون کلی ،تثبیت کوالانسی بایستی هنگام کار در محلول آب دار و زمانی که عوامل دناتوره کننده وجود دارند ترجیح داده می شود .دلیل آن تشکیل چندین پیوند کوالانسی بین آنزیم و حامل و کاهش انعطاف پذیری و ارتعاشات حرارتی حامل و هم چنین ممانعت از باز شدن پروتئین و دناتوراسیون می باشد(19) و (34) .
مزیت دیگر ،به طور کلی آنزیم های تثبیت شده به صورت کووالانسی را می توان در هر محیطی به کار برد در حالی که آنزیم های جذب شده بایستی در حلال های آلی یا در واکنش دهنده های هیدروفوبیک خالص جهت ممانعت از شسته شدن مورد استفاده قرار داد .عیب آشکار پیوند کوالانسی این است که آنزیم به لحاظ شیمیایی دچار تغییر گشته و هم چنین تثبیت یکنواخت و منظمی برای همه مولکول های آنزیم رخ نمی -دهد .علی رغم اینکه اتصال چند نقطه ای آنزیم ها می تواند سبب پیوند محکم آن ها به حامل گردد .این عامل محدود کننده تنها برای آنزیم های مونومری نمی باشد بلکه انواع مولتی مری را نیز شامل می شود (34) .
1-10-4-تثبیت بوسیله اتصال عرضی آنزیم ها:
یک مورد پرکاربرداز اتصال کووالانسی ،اتصال عرضی آنزیم ها با به کارگیری عواملی نظیر گلوتارآلدئید می باشد .به جای تثبیت یک آنزیم به یک حامل ،آنزیم ها خود به عنوان یک حامل عمل می کنند .مرحله نخست ،تهیه کریستال ها یا توده های آنزیمی به شکل خشک شده به روش پاششی می باشد .با این روش آنزیم های موجود در محلول را نیز می توان اتصال عرضی نمود .در این روش آنزیم تثبیت شده فاقد حامل بوده و همانند آنزیم خالص فاقد مزایا و معایب مرتبط با حامل ها می باشد .افزودن ترسیب دهنده هایی نظیر استن ،سولفات آمونیوم ،اتانول و یا 1 و 2 دی متوکسی اتان در پی یک عامل اتصال عرضی دهنده نظیر گلوتارآلدئید



قیمت: 11200 تومان

Author:

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *