تاثیر غلظت¬های هورمونی و ریزنمونه بر کال¬زایی، باززایی و کشت سوسپانسیون رازیانه

دانشگاه آزاد اسلامی
واحد دامغان
پایان نامه کارشناسی ارشد
دانشکده کشاورزی
موضوع پایان نامه :
تاثیر غلظتهای هورمونی و ریزنمونه بر کالزایی، باززایی و کشت سوسپانسیون رازیانه
دانشجو :
مهرداد اصغری
استاد راهنما :
دکتر حسین عباسپور
استاد مشاور :
دکتر سکینه سعیدی سار
1393

چکیده :
تأثیر هورمونی و ریزنمونه بر کالزایی، باززایی و کشت سوسپانسیون سلولی در رازیانه
(Foeniuculum vulgare)
مقدمه: گیاه رازیانه (Foeniuculum vulgare) گیاهی علفی، پایا، معطر از خانواده چتریان است که در مناطق مختلف ایران مورد استفاده خوراکی و دارویی قرار میگیرد. با توجه به اهمیت ترکیبات این گیاه در صنایع دارویی و غذایی هدف در این پژوهش بهینه سازی کشت بافت این گیاه تحت تیمارهای هورمونی و افزایش متابولیتهای ثانویه مورد بررسی قرار گرفت. به منظور بررسی تأثیر تیمارهای هورمونی بر کالزایی و باززایی در گیاه رازیانه، سه ریزنمونه ( برگ، هیپوکوتیل، ریشه) انتخاب شد. بذر گیاه رازیانه در گام اول استریل شد در گام بعدی به محیط کشت MS پایه تحت شرایط کاملا استریل منتقل شد. بذور مورد نظر در اتاقک رشد در دمای 23 درجه سانتیگراد با 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی قرار داده شد و بعد از گذشت 21 روز که گیاه به ارتفاع حدود 10 سانتی متر رسید، ریز نمونه ها به منظور پرتوانی به محیط کشت دارای هورمون BAP 0.5 و 1 میلیگرم برلیتر منتقل شدند. القای کالوس با کشت ریزنمونهها روی محیط MS با 16 تیمار هورمونی شامل هورمون 2,4-D به همراه BAP و NAA به همرا Kin انجام شد. اندازه کالوس، وزن کالوس و درصد کالزایی در هر یک از تیمارهای بهکار رفته اندازهگیری شد. با در نظر گرفتن صفات فوق هورمونی 2 و 4 میلیگرم در لیتر 2,4-D به همراه 0.5 میلیگرم در لیتر BAP بهترین ترکیبهای هورمونی و نیز هیپوکوتیل و ریشه بهترین ریزنمونهها شناخته شدند. در مرحله باززایی کالوس محیط ½ MS بدون هورمون بهترین محیط باززایی را نشان داد. به منظور مطالعه تولید عصاره در فاز کشت سوسپانسیون سلولی بهترین تیمار در فاز کالزایی انتخاب شد و کالوس به محیط سوسپانسیون سلولی MS مایع شامل 2,4-D (2 و 4 میلیگرم در لیتر) به همراه BAP (0.5 میلیگرم در لیتر) منتقل و در شرایط تاریکی در دمای 24 درجه سانتیگراد روی شیکر با 120 دور دردقیقه قرار داده شدند. بعد از 2 هفته طیف نگاری جرمی انجام شد که تولید موادی همچون آلفا-پینن و لیمونن در محیط کشت بافت گزارش شد.
فهرست مطالب
TOC o “1-3” u فصل اول: مقدمه 11
1-1- مقدمه12
1 -2- جایگاه اقتصادی گیاهان دارویی در جهان و ایران 13
1-3- ضرورت توجه به پرورش گیاهان دارویی 14
1-4-گیاه شناسی رازیانه 14
1-5- اندام دارویی …… ……… …… ……………………………………16
1-6- نیازهای اکولوژیکی ……………………………………… …16
1-7- پراکنش جغرافیایی ……… …… …………………………………… 16
1-8- آفات و بیماریها … …… … … … ……… ………………………..18
1-9- مهمترین خاصیت درمانی و داروهای ساخته شده ………………..……………………….18
1-10- پیاز رازیانه ………………………………………… . 19
1-11- دانه رازیانه ……… ……………………………………………… 20
1-12- نقش کشت بافت در تکثیر گیاهان … …………………………………………….21
1-13- تاریخچه کشت بافت 23
1-14- مراحل تکنیک کشت بافت 24
1-15- انواع ترکیبات محیط کشت 26
1-16- ویتامین ها 26
1-17- اسیدهای آمینه 27
1-18- تنظیم کننده های رشد 27
1-19- سایتوکنین 28
1-20- اسید جیبرلیک 28
1-21- آگار و دیگر مواد تولیدکننده ژل 28
1-22- ترکیبات مورد استفاده در ضدعفونی مواد گیاهی 29
1-23- استفاده از آنتی بیوتیک ها در رفع آلودگی های درون بافتی 29
1-24- ضدعفونی محیط کشت 30
1-25- قهوه ای شدن بافت های گیاهی 30
1-26- روش های ریزازدیادی 32
1-27- جنین زایی غیر جنسی 32
1-28- کشت مرسیتم 33
1-29- باززایی 34
1-30- باززایی گیاهان کشت شده 34
1-31- مراحل ریزازدیادی از طریق کشت درون شیشه ای 35
1-32- استقرار در محیط کشت 35
1-33- ایجاد شاخساره و پرآوری و تکثیر انبوه از طریق کشت های متوالی 35
1-34- ریشه زایی گیاهچه های تولیدشده 35
1-35- تولید متابولیت های ثانویه در گیاهان در شرایط درون شیشه ای 36
1-36- روش کشت کالوس 36
1-37- روش کشت سوسپانسیون سلولی 37
1-38- اهداف تحقیق 38
فصل دوم: مروری بر منابع 39
2-1- سوابق استفاده از رازیانه در کشت بافت 40
2-2- تحقیقات کشت بافت بر روی گیاهان دیگر 43
فصل سوم: محل انجام آزمایش 46
3-1- مواد شیمیایی 47
3-2- تهیه بذر47
3-3- محیط کشت، ترکیبات و چگونگی آماده سازی آن . . 47
3-4- تهیه محلول مادری MS(غلظت x10) ……… …………… …………………… 47
3-5- مراحل سترون سازی51
3-5-1- سترون سازی بذرها51
3-5-2- سترون سازی محیط و وسایل کار 52
3-5-3- تولید گیاهان سترون جهت تیمارهای مختلف 52
3-6- کشت گیاه در محیط های تیماری به منظور کال زایی 54
3-7- باززایی57
3-8- کشت سوسپانسیون سلولی در محیط کشت MS مایع 58
3-9- جداسازی ترکیبات فرار 58
3-10- آنالیز آماری 59
فصل چهارم: نتایج و بحث
60
4-1- نتایج کالوس سازی ریزنمونه های گیاه رازیانه در محیط کشت حاوی ترکیبات هورمونی مختلف 61
4-2- نتایج باززایی ریزنمونه های گیاه رازیانه در محیط کشت حاوی ترکیبات هورمونی مختلف 65
4-3- نتایج حاصل از اثر غلظت های مختلف هورمون BAP بر اندازه ساقه و ریشه و تعداد برگ در گیاه رازیانه 70
4-4- بررسی ترکیبات شیمیایی گیاه رازیانه تحت تاثیر تیمارهای مختلف هورمونی از طریق
کشت سوسپانسیون سلولی 74………………………………………………………………………….
4-5- مقایسه درصد سطوح ترکیبات شیمیایی مشترک حاصل از کشت سوسپانسیونی گیاه رازیانه در تیمارهای مختلف هورمونی
75
4-6- اشکال طیف گاز کروماتورگراف در اسانس گیاه رازیانه تیمارشده با ترکیبات هورمونی مختلف…………………….77
فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری کلی
81
بحث 82
پیشنهادات86
منابع 87

چکیده انگلیسی 98……………………………………………………………… ………………….

فهرست شکل ها
عنوان شکلصفحه
شکل 1-4- مراحل رشد جنین های جنسی و غیرجنسی…………………………………………………….……….29
شکل 4-1- کالوسهای بوجود آمده در محیط کشتهای غلظت 4میلی گرم بر لیتر و 1 میلی گرم بر لیتر…………………………………………………………………………………………………………………60
فهرست جدول ها
عنوان جدول صفحه
جدول 1-1- . مقايسه مقدار توليد برخي ترکيبات دارويي حاصل از کشت سوسپانسيون سلولي با گياه كامل…………….33
جدول 3-1- ترکيب و غلظت‌هاي هورموني مورد استفاده در القاء و رشد کالوس در محيط ……………….MS51
جدول 3-2- ترکيب و غلظت‌هاي هورموني مورد استفاده در باززایی رازیانه در محيط MS2/1…………..……54
جدول 4-1- نتایج تجزیه واریانس حاصل از بررسی تاثیر ریزنمونه، ترکیبات هورمونی محیط‌کشت و اثرات متقابل این فاکتورها بر میزان کالوس‌زایی…………..……………………………………………………… 58
جدول 4-2- نتایج مقایسه میانگین حاصل از بررسی تاثیر ترکیبات مختلف هورمونی بر میزان درصد کالوس‌زایی به روش آزمون LSD در سطح پنج درصد……………………..………………………………………… 58
جدول 4-3- نتایج مقایسه میانگین حاصل از بررسی تاثیرریزنمونه‌های رازیانه بر میزان درصد کالوس‌زایی به روش آزمون LSD در سطح پنج درصد …………..…………………………………………………..60
جدول 4-4- نتایج مقایسه میانگین حاصل از بررسی اثرات متقابل ریزنمونه در ترکیبات مختلف هورمونی بر میزان کالوس‌زایی به روش آزمون LSD در سطح پنج درصد ……………………………………………………………………………………………… 61
HYPERLINK l “_Toc302924107” جدول HYPERLINK l “_Toc302924106” 4-5- نتایج تجزیه واریانس حاصل از بررسی تاثیر ریزنمونه، ترکیبات هورمونی محیط‌کشت و اثرات متقابل این فاکتورها بر میزان باززایی……………………………………………………………………………………………………………………………………………….63

جدول 4-6- نتایج مقایسه میانگین حاصل از بررسی تاثیر ترکیبات مختلف هورمونی بر میزان درصد باززایی به روش آزمون LSD در سطح پنج درصد ………………………………………………………………………………………………………………….63جدول 4-7- نتایج مقایسه میانگین حاصل از بررسی تاثیرریزنمونه‌های رازیانه بر میزان درصد باززایی به روش آزمون LSD در سطح پنج درصد65… ………………………………………………………………
جدول4-8- نتایج مقایسه میانگین حاصل از بررسی اثرات متقابل ریزنمونه در ترکیبات مختلف هورمونی بر میزان باززایی به روش آزمون LSD در سطح پنج درصد ………………………………….. … …….. 66
جدول4-9- نتایج تجزیه واریانس اثر غلظت های مختلف هورمون BAP بر صفات اندازه ساقه و ریشه و تعداد برگ در گیاه رازیانه ………………………………………………………………………………………………………. ………………………………………………….68
جدول4-10- مقایسه میانگین اثر غلظت های مختلف هورمون BAP بر صفات اندازه ساقه و ریشه و تعداد برگ در گیاه رازیانه ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….69
جدول 4-11- ترکیبات شیمیایی حاصل از اسانس گیاه رازیانه……………………………………………………………………………………….71

TOC h z c “شکل”
فهرست نمودارها
عنوان نمودار صفحه
نمودار4-1- تاثیر ترکیبات مختلف هورمونی بر میزان درصد کالوس‌زایی………………..…………… ……..59
نمودار4-2- تاثیرریزنمونه‌های رازیانه بر میزان درصد کالوس‌زایی61
نمودار4-3- اثرات متقابل ریزنمونه در ترکیبات مختلف هورمونی بر میزان کالوس‌زایی 62
نمودار4-4- تاثیر ترکیبات مختلف هورمونی بر میزان درصد باززایی64
نمودار4-5- تاثیرریزنمونه‌های رازیانه بر میزان درصد باززایی……………………………………………………………………………….. 65
نمودار4-6- اثرات متقابل ریزنمونه در ترکیبات مختلف هورمونی بر میزان باززایی…. …………………………………………………..67
نمودار4-7- اثر غلظت های مختلف هورمون BAP بر میزان اندازه ساقه گیاه رازیانه69
نمودار4-8- اثر غلظت های مختلف هورمون BAP بر میزان اندازه ریشه گیاه رازیانه 70
نمودار4-9- اثر غلظت های مختلف هورمون BAP بر تعداد برگ ایجاد شده در گیاه رازیانه……………………………………..70
نمودار 4-10- مقایسه درصد سطوح ترکیب شیمیایی (E,E) 2,4-Decadienal در گیاه رازیانه تیمار شده با غلظت های هورمونی مختلف…………………………………………………………………………………………………………………………………72
نمودار 4-11 مقایسه درصد سطوح ترکیب شیمیایی D-(+)-fenchone در گیاه رازیانه تیمار شده با غلظت های هورمونی مختلف………………………………………………………………………………………………………………………………….73

فصل اول
مقدمه
مقدمه
گل ها و گياهان، خاموش ترين موجودات و در عين حال گوياترين مظهر قدرت و عظمت آفرينش هستد. هر برگي از اين موجودات زيبا، كتاب بزرگي در وصف توحيد است. گلها و گياهان نه تنها با الوان و اشكال بديع و بیبديل خود سفرهي طبيعت را زينت میبخشند بلكه آن را چنان سرشاري از نيروي حياتي ميسازند كه هيچ بساطي را ياراي رقابت با آن نيست (امیدبیگی، 1377 .( با آن كه امروزه درمان بيماريها بيشتر از طريق مصرف داروهايي صورت ميگيرد كه منشأ صنعتي دارند و اختصاصاً در آزمايشگاهها تهيه ميشوند ولي مصرف بعضي از آنها زيانهايي به بدن ميرساند و عوارض جانبي بسياري از آنها ثابت شده است. در اوايل قرن حاضر پيشرفت علم شيمي و كشف سيستمهاي پيچيدهي سنتز ارگانيك منجر به توسعهي صنعت داروسازي و جايگزيني شيمي درماني شد. بدين طريق پزشكي مدرن توانست بسياري از بيماريها غيرقابل علاج و غالباً مرگآور را درمان كند. با وجود اين گياهان دارويي و داروهايي كه از آنها تهيه ميشدند هرگز به طور كامل كنار گذاشته نشدند. طبق گزارش سازمان بهداشت جهانی امروزه بيش از 80 درصد مردم جهان (نزديك به 5 ميليارد نفر)، براي درمان بيماريها هنوز از داروهاي گياهي استفاده ميكنند. تقريبا يك چهارم داروهاي تهيه شدهي دنيا منشأ گياهي داشته كه يا مستقيماً از گياهان عصارهگيري شده و يا براساس تركيب گياهي، سنتز شدهاند. واژه گياهان دارويي تنها به تسكين دهنده آلام اطلاق نميشود بلكه اين گياهان در زير گروه غذا به عنوان طعم دهندهها، نوشيدنيها، شيرين كنندهها، رنگ طبيعي بوده همچنين به عنوان

Author:

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *