تاثیر غلظت¬های هورمونی و ریزنمونه بر کال¬زایی، باززایی و کشت سوسپانسیون رازیانه

دانشگاه آزاد اسلامی
واحد دامغان
پایان نامه کارشناسی ارشد
دانشکده کشاورزی
موضوع پایان نامه :
تاثیر غلظتهای هورمونی و ریزنمونه بر کالزایی، باززایی و کشت سوسپانسیون رازیانه
دانشجو :
مهرداد اصغری
استاد راهنما :
دکتر حسین عباسپور
استاد مشاور :
دکتر سکینه سعیدی سار
1393

چکیده :
تأثیر هورمونی و ریزنمونه بر کالزایی، باززایی و کشت سوسپانسیون سلولی در رازیانه
(Foeniuculum vulgare)
مقدمه: گیاه رازیانه (Foeniuculum vulgare) گیاهی علفی، پایا، معطر از خانواده چتریان است که در مناطق مختلف ایران مورد استفاده خوراکی و دارویی قرار میگیرد. با توجه به اهمیت ترکیبات این گیاه در صنایع دارویی و غذایی هدف در این پژوهش بهینه سازی کشت بافت این گیاه تحت تیمارهای هورمونی و افزایش متابولیتهای ثانویه مورد بررسی قرار گرفت. به منظور بررسی تأثیر تیمارهای هورمونی بر کالزایی و باززایی در گیاه رازیانه، سه ریزنمونه ( برگ، هیپوکوتیل، ریشه) انتخاب شد. بذر گیاه رازیانه در گام اول استریل شد در گام بعدی به محیط کشت MS پایه تحت شرایط کاملا استریل منتقل شد. بذور مورد نظر در اتاقک رشد در دمای 23 درجه سانتیگراد با 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی قرار داده شد و بعد از گذشت 21 روز که گیاه به ارتفاع حدود 10 سانتی متر رسید، ریز نمونه ها به منظور پرتوانی به محیط کشت دارای هورمون BAP 0.5 و 1 میلیگرم برلیتر منتقل شدند. القای کالوس با کشت ریزنمونهها روی محیط MS با 16 تیمار هورمونی شامل هورمون 2,4-D به همراه BAP و NAA به همرا Kin انجام شد. اندازه کالوس، وزن کالوس و درصد کالزایی در هر یک از تیمارهای بهکار رفته اندازهگیری شد. با در نظر گرفتن صفات فوق هورمونی 2 و 4 میلیگرم در لیتر 2,4-D به همراه 0.5 میلیگرم در لیتر BAP بهترین ترکیبهای هورمونی و نیز هیپوکوتیل و ریشه بهترین ریزنمونهها شناخته شدند. در مرحله باززایی کالوس محیط ½ MS بدون هورمون بهترین محیط باززایی را نشان داد. به منظور مطالعه تولید عصاره در فاز کشت سوسپانسیون سلولی بهترین تیمار در فاز کالزایی انتخاب شد و کالوس به محیط سوسپانسیون سلولی MS مایع شامل 2,4-D (2 و 4 میلیگرم در لیتر) به همراه BAP (0.5 میلیگرم در لیتر) منتقل و در شرایط تاریکی در دمای 24 درجه سانتیگراد روی شیکر با 120 دور دردقیقه قرار داده شدند. بعد از 2 هفته طیف نگاری جرمی انجام شد که تولید موادی همچون آلفا-پینن و لیمونن در محیط کشت بافت گزارش شد.
فهرست مطالب
TOC \o “1-3” \u فصل اول: مقدمه 11
1-1- مقدمه12
1 -2- جایگاه اقتصادی گیاهان دارویی در جهان و ایران 13
1-3- ضرورت توجه به پرورش گیاهان دارویی 14
1-4-گیاه شناسی رازیانه 14
1-5- اندام دارویی …… ……… …… ……………………………………16
1-6- نیازهای اکولوژیکی ……………………………………… …16
1-7- پراکنش جغرافیایی ……… …… …………………………………… 16
1-8- آفات و بیماریها … …… … … … ……… ………………………..18
1-9- مهمترین خاصیت درمانی و داروهای ساخته شده ………………..……………………….18
1-10- پیاز رازیانه ………………………………………… . 19
1-11- دانه رازیانه ……… ……………………………………………… 20
1-12- نقش کشت بافت در تکثیر گیاهان … …………………………………………….21
1-13- تاریخچه کشت بافت 23
1-14- مراحل تکنیک کشت بافت 24
1-15- انواع ترکیبات محیط کشت 26
1-16- ویتامین ها 26
1-17- اسیدهای آمینه 27
1-18- تنظیم کننده های رشد 27
1-19- سایتوکنین 28
1-20- اسید جیبرلیک 28
1-21- آگار و دیگر مواد تولیدکننده ژل 28
1-22- ترکیبات مورد استفاده در ضدعفونی مواد گیاهی 29
1-23- استفاده از آنتی بیوتیک ها در رفع آلودگی های درون بافتی 29
1-24- ضدعفونی محیط کشت 30
1-25- قهوه ای شدن بافت های گیاهی 30
1-26- روش های ریزازدیادی 32
1-27- جنین زایی غیر جنسی 32
1-28- کشت مرسیتم 33
1-29- باززایی 34
1-30- باززایی گیاهان کشت شده 34
1-31- مراحل ریزازدیادی از طریق کشت درون شیشه ای 35
1-32- استقرار در محیط کشت 35
1-33- ایجاد شاخساره و پرآوری و تکثیر انبوه از طریق کشت های متوالی 35
1-34- ریشه زایی گیاهچه های تولیدشده 35
1-35- تولید متابولیت های ثانویه در گیاهان در شرایط درون شیشه ای 36
1-36- روش کشت کالوس 36
1-37- روش کشت سوسپانسیون سلولی 37
1-38- اهداف تحقیق 38
فصل دوم: مروری بر منابع 39
2-1- سوابق استفاده از رازیانه در کشت بافت 40
2-2- تحقیقات کشت بافت بر روی گیاهان دیگر 43
فصل سوم: محل انجام آزمایش 46
3-1- مواد شیمیایی 47
3-2- تهیه بذر47
3-3- محیط کشت، ترکیبات و چگونگی آماده سازی آن . . 47
3-4- تهیه محلول مادری MS(غلظت x10) ……… …………… …………………… 47
3-5- مراحل سترون سازی51
3-5-1- سترون سازی بذرها51
3-5-2- سترون سازی محیط و وسایل کار 52
3-5-3- تولید گیاهان سترون جهت تیمارهای مختلف 52
3-6- کشت گیاه در محیط های تیماری به منظور کال زایی 54
3-7- باززایی57
3-8- کشت سوسپانسیون سلولی در محیط کشت MS مایع 58
3-9- جداسازی ترکیبات فرار 58
3-10- آنالیز آماری 59
فصل چهارم: نتایج و بحث
60
4-1- نتایج کالوس سازی ریزنمونه های گیاه رازیانه در محیط کشت حاوی ترکیبات هورمونی مختلف 61
4-2- نتایج باززایی ریزنمونه های گیاه رازیانه در محیط کشت حاوی ترکیبات هورمونی مختلف 65
4-3- نتایج حاصل از اثر غلظت های مختلف هورمون BAP بر اندازه ساقه و ریشه و تعداد برگ در گیاه رازیانه 70
4-4- بررسی ترکیبات شیمیایی گیاه رازیانه تحت تاثیر تیمارهای مختلف هورمونی از طریق
کشت سوسپانسیون سلولی 74………………………………………………………………………….
4-5- مقایسه درصد سطوح ترکیبات شیمیایی مشترک حاصل از کشت سوسپانسیونی گیاه رازیانه در تیمارهای مختلف هورمونی
75
4-6- اشکال طیف گاز کروماتورگراف در اسانس گیاه رازیانه تیمارشده با ترکیبات هورمونی مختلف…………………….77
فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری کلی
81
بحث 82
پیشنهادات86
منابع 87

چکیده انگلیسی 98……………………………………………………………… ………………….

فهرست شکل ها
عنوان شکلصفحه
شکل 1-4- مراحل رشد جنین های جنسی و غیرجنسی…………………………………………………….……….29
شکل 4-1- کالوسهای بوجود آمده در محیط کشتهای غلظت 4میلی گرم بر لیتر و 1 میلی گرم بر لیتر…………………………………………………………………………………………………………………60
فهرست جدول ها
عنوان جدول صفحه
جدول 1-1- . مقایسه مقدار تولید برخی ترکیبات دارویی حاصل از کشت سوسپانسیون سلولی با گیاه کامل…………….33
جدول 3-1- ترکیب و غلظت‌های هورمونی مورد استفاده در القاء و رشد کالوس در محیط ……………….MS51
جدول 3-2- ترکیب و غلظت‌های هورمونی مورد استفاده در باززایی رازیانه در محیط MS2/1…………..……54
جدول 4-1- نتایج تجزیه واریانس حاصل از بررسی تاثیر ریزنمونه، ترکیبات هورمونی محیط‌کشت و اثرات متقابل این فاکتورها بر میزان کالوس‌زایی…………..……………………………………………………… 58
جدول 4-2- نتایج مقایسه میانگین حاصل از بررسی تاثیر ترکیبات مختلف هورمونی بر میزان درصد کالوس‌زایی به روش آزمون LSD در سطح پنج درصد……………………..………………………………………… 58
جدول 4-3- نتایج مقایسه میانگین حاصل از بررسی تاثیرریزنمونه‌های رازیانه بر میزان درصد کالوس‌زایی به روش آزمون LSD در سطح پنج درصد …………..…………………………………………………..60
جدول 4-4- نتایج مقایسه میانگین حاصل از بررسی اثرات متقابل ریزنمونه در ترکیبات مختلف هورمونی بر میزان کالوس‌زایی به روش آزمون LSD در سطح پنج درصد ……………………………………………………………………………………………… 61
HYPERLINK \l “_Toc302924107” جدول HYPERLINK \l “_Toc302924106” 4-5- نتایج تجزیه واریانس حاصل از بررسی تاثیر ریزنمونه، ترکیبات هورمونی محیط‌کشت و اثرات متقابل این فاکتورها بر میزان باززایی……………………………………………………………………………………………………………………………………………….63

جدول 4-6- نتایج مقایسه میانگین حاصل از بررسی تاثیر ترکیبات مختلف هورمونی بر میزان درصد باززایی به روش آزمون LSD در سطح پنج درصد ………………………………………………………………………………………………………………….63جدول 4-7- نتایج مقایسه میانگین حاصل از بررسی تاثیرریزنمونه‌های رازیانه بر میزان درصد باززایی به روش آزمون LSD در سطح پنج درصد65… ………………………………………………………………
جدول4-8- نتایج مقایسه میانگین حاصل از بررسی اثرات متقابل ریزنمونه در ترکیبات مختلف هورمونی بر میزان باززایی به روش آزمون LSD در سطح پنج درصد ………………………………….. … …….. 66
جدول4-9- نتایج تجزیه واریانس اثر غلظت های مختلف هورمون BAP بر صفات اندازه ساقه و ریشه و تعداد برگ در گیاه رازیانه ………………………………………………………………………………………………………. ………………………………………………….68
جدول4-10- مقایسه میانگین اثر غلظت های مختلف هورمون BAP بر صفات اندازه ساقه و ریشه و تعداد برگ در گیاه رازیانه ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….69
جدول 4-11- ترکیبات شیمیایی حاصل از اسانس گیاه رازیانه……………………………………………………………………………………….71

TOC \h \z \c “شکل”
فهرست نمودارها
عنوان نمودار صفحه
نمودار4-1- تاثیر ترکیبات مختلف هورمونی بر میزان درصد کالوس‌زایی………………..…………… ……..59
نمودار4-2- تاثیرریزنمونه‌های رازیانه بر میزان درصد کالوس‌زایی61
نمودار4-3- اثرات متقابل ریزنمونه در ترکیبات مختلف هورمونی بر میزان کالوس‌زایی 62
نمودار4-4- تاثیر ترکیبات مختلف هورمونی بر میزان درصد باززایی64
نمودار4-5- تاثیرریزنمونه‌های رازیانه بر میزان درصد باززایی……………………………………………………………………………….. 65
نمودار4-6- اثرات متقابل ریزنمونه در ترکیبات مختلف هورمونی بر میزان باززایی…. …………………………………………………..67
نمودار4-7- اثر غلظت های مختلف هورمون BAP بر میزان اندازه ساقه گیاه رازیانه69
نمودار4-8- اثر غلظت های مختلف هورمون BAP بر میزان اندازه ریشه گیاه رازیانه 70
نمودار4-9- اثر غلظت های مختلف هورمون BAP بر تعداد برگ ایجاد شده در گیاه رازیانه……………………………………..70
نمودار 4-10- مقایسه درصد سطوح ترکیب شیمیایی (E,E) 2,4-Decadienal در گیاه رازیانه تیمار شده با غلظت های هورمونی مختلف…………………………………………………………………………………………………………………………………72
نمودار 4-11 مقایسه درصد سطوح ترکیب شیمیایی D-(+)-fenchone در گیاه رازیانه تیمار شده با غلظت های هورمونی مختلف………………………………………………………………………………………………………………………………….73

فصل اول
مقدمه
مقدمه
گل ها و گیاهان، خاموش ترین موجودات و در عین حال گویاترین مظهر قدرت و عظمت آفرینش هستد. هر برگی از این موجودات زیبا، کتاب بزرگی در وصف توحید است. گلها و گیاهان نه تنها با الوان و اشکال بدیع و بیبدیل خود سفرهی طبیعت را زینت میبخشند بلکه آن را چنان سرشاری از نیروی حیاتی میسازند که هیچ بساطی را یارای رقابت با آن نیست (امیدبیگی، 1377 .( با آن که امروزه درمان بیماریها بیشتر از طریق مصرف داروهایی صورت میگیرد که منشأ صنعتی دارند و اختصاصاً در آزمایشگاهها تهیه میشوند ولی مصرف بعضی از آنها زیانهایی به بدن میرساند و عوارض جانبی بسیاری از آنها ثابت شده است. در اوایل قرن حاضر پیشرفت علم شیمی و کشف سیستمهای پیچیدهی سنتز ارگانیک منجر به توسعهی صنعت داروسازی و جایگزینی شیمی درمانی شد. بدین طریق پزشکی مدرن توانست بسیاری از بیماریها غیرقابل علاج و غالباً مرگآور را درمان کند. با وجود این گیاهان دارویی و داروهایی که از آنها تهیه میشدند هرگز به طور کامل کنار گذاشته نشدند. طبق گزارش سازمان بهداشت جهانی امروزه بیش از 80 درصد مردم جهان (نزدیک به 5 میلیارد نفر)، برای درمان بیماریها هنوز از داروهای گیاهی استفاده میکنند. تقریبا یک چهارم داروهای تهیه شدهی دنیا منشأ گیاهی داشته که یا مستقیماً از گیاهان عصارهگیری شده و یا براساس ترکیب گیاهی، سنتز شدهاند. واژه گیاهان دارویی تنها به تسکین دهنده آلام اطلاق نمیشود بلکه این گیاهان در زیر گروه غذا به عنوان طعم دهندهها، نوشیدنیها، شیرین کنندهها، رنگ طبیعی بوده همچنین به عنوان ماده اولیه محصولات آرایشی و بهداشتی نیز مورد استفاده قرار می گیرند (امیدبیگی، 1376).
درواقع گیاهانی که حداقل دارای صفات زیر باشند،گیاه دارویی نامیده میشوند:
1- در پیکر این گیاهان مواد ویژه ای به عنوان مواد مؤثر یا متابولیتهای ثانویه ساخته و ذخیره میشوند که برای مداوای برخی از بیماریها مورد استفاده قرار میگیرند. مواد مذکور طی فرآیندهای ویژه و پیچیده بیوشیمیایی و به مقدار بسیار کم (به طور معمول کمتر از یک درصد وزن خشک گیاه)، ساخته میشوند.
2- اغلب ممکن است اندام ویژهای چون ریشه، برگها، ساقه، گل، میوه و غیره بیشترین مواد مؤثر را داشته باشند، بنابراین همیشه نمیتوان کل اندام گیاه را منبع ماده دارویی ویژهای دانست.
3- اندام گیاهی برداشت شده، آماده سازی و فرآوری میشوند، یعنی تحت تأثیر عملیات ویژهای مانند جداسازی، خرد شدن، خشک کردن، تخمیر و غیره قرار گرفته و سپس استفاده میشوند. به طور معمول این اندامها به صورت سنتی و فقط با خشک کردن به عنوان کالای عطاری عرضه میشوند.
جایگاه اقتصادی گیاهان دارویی در جهان و ایران
رویکرد روز افزون استفاده از گیاهان دارویی و فرآوردههای حاصله از آن نقش این گیاهان را در چرخه اقتصاد جهانی پررنگتر کرده است. طوریکه مصرف روبه تزاید آن تنها به کشورهای در حال توسعه اختصاص نداشته، بلکه یکی از فاکتورهای مهم بهداشتی کشورهای پیشرفته نیز محسوب میگردد. در جهان 130 میلیون تن گیاه دارویی سالانه خرید و فروش میشود و حدود یک میلیون کارخانه دارویی در چند سال اخیر افزایش یافته است. طبق برآوردهای صورت گرفته در سالهای اخیر، ارزش بازارهای جهانی داروهای گیاهی که شامل گیاهان دارویی و فرآوردههای آنها است، رشد قابل توجهی داشته است. بخش اعظم بازار گیاهان دارویی دنیا، به تولید و عرضه متابولیتهای ثانویه مشتق از این گیاهان مربوط میشود. متابولیتهای ثانویه معمولاً از ارزش افزوده بسیار بالایی برخوردارند به طوریکه ارزش فروش برخی از این ترکیبات مانند شیکونین ، دیجیتوکسین و عطرهای همچون روغن جاسمین ، از چند دلار تا چند هزار دلار به ازای هر کیلوگرم تغییر می کند. همچنین قیمت هر گرم از داروهای ضد سرطان گیاهی مانند وین بلاستین ، وینکریستین ، آجمالیسین و تاکسول به چند هزار دلار میرسد. تاکسول یکی ازترکیبات دارویی است که از پوست درخت سرخدار به دست میآید و در درمان سرطانهای سینه و تخمدان مورد استفاده قرار میگیرد. ورود دارو بودجه زیادی را به خود تخصیص میدهد این در حالی است که ایران با داشتن خصوصیات اکولوژیکی و اقلیمی متنوع، یکی از کشوهای کم نظیر در تولید گیاهان مختلف میتواند باشد به طوری که ایران از 13 اقلیم موجود در جهان، 11 اقلیم را به خود اختصاص داده است. و به تقریب 8000 گونه گیاهی که معادل 2 برابر فلور کل اروپا است ازدیگر ویژگیهای کشورمان می باشد، که این بانک ژن اهمیت اقتصادی زیادی دارد. برای مثال کشور فلیپین حجم عظیمی از درآمد خود را از فروش گیاهان دارویی و گیاهان وحشی به دیگر کشورها بدست میآورد (میرجلیلی، 1382). بنابراین، اگرچه در زمینه توسعه صنعت گیاهان دارویی در ابتدای راه هستیم، ولی میتوانیم با برنامهریزی صحیح، بخش قابل توجهی از بازارهای جهانی را به خود اختصاص دهیم. شاید در ابتدای کار نتوانیم با کشورهایی که محصولات خود را به تولید انبوه رسانده اند، رقابت نماییم، اما به لحاظ تنوع گونهای و تولید طبیعی گونههایی دارویی رقبای چندانی در جهان نداریم و در مواردی حتی بیرقیب هستیم. همه اینها منوط به این نکته است که داراییهای کشور را بشناسیم و بتوانیم از آنها استفاده بهینه نماییم. در این صورت حتی می توان تا 5 درصد از تولید ناخالص ملی را از این طریق تأمین نمود (امیری،2006).
1-3- ضرورت توجه به پرورش گیاهان دارویی
با ظهور داروهای شیمیایی و بیولوژیک، نقش و اهمیت گیاهان دارویی در تأمین سلامت بشر، در معرض فراموشی قرار گرفت .اما با گذشت زمان، استقبال از گیاهان دارویی با رشد قابل توجهی روبرو شده است. به نظر میرسد مردم جهان از یک سری نارساییهای طب مدرن خسته شده اند و به طور روز افزون به سمت داروهای گیاهی روی میآورند به همین دلیل، امروزه حدود 50 درصد داروهای تولید شده در جهان منشاء طبیعی دارند که با تغییراتی به عنوان دارو مورد استفاده قرار میگیرند که نیمی از این مقدار از منابع معدنی، حیوانی و باکتریایی بهدست میآید و نیمی دیگر منشاء گیاهی دارد. برای مثال، تمام هورمونهای مصرفی گیاهی هستند و از گیاهان مختلفی نظیر سیب زمینی مکزیکی، شنبلیله و غیره به دست میآیند. هم چنیین ترکیباتی مثل وین بلاستین و وین کریستین که از داروهای ضد سرطان هستند از گیاه بدست میآیند و یا گلیکوزیدهای قلبی از جمله این گروه داروها محسوب میشوند (قاسمی دهکردی و طالب، 1380). گیاهان دارویی به دلیل ماهیت طبیعی و وجود ترکیبات همولوگ دارویی در کنار هم، با بدن سازگاری بهتری دارند و معمولا فاقد عوارض ناخواسته هستند لذا به خصوص در موارد مصرف طولانی و در بیماریهای مزمن، بسیار مناسب میباشند. به عنوان مثال، گیاهان دارویی در بسیاری از اختلالات اعصاب و روان به عنوان بهترین انتخاب خواهند بود.
ایرانیان از دیرباز و حتی پیش از دیگران در زمینه گیاهان دارویی و کاربرد درمانی آنها از دانش پیشرفتهای برخوردار بوده است. نمونه بارز آن کتاب باستانی اوستاست. در یکی از پنج کتاب تشکیل دهنده اوستا( که در مجموع دست کم 2500 سال پیشینه دارد)، بخش های پرشماری به گیاه درمانی، معرفی گیاهان دارویی و کاربرد آنها اختصاص یافته است. در قرن هشتم و نهم میلادی، اطباء ایرانی رونق خاصی به طبابت ایران و جهان بخشیدند بهطوریکه با پیدا شدن دانشمندان و نوابغی نظیر ابوعلی سینا و محمد زکریای رازی با انشار کتابهای معروف خود (قانون و الحاوی) پیشرفتهای زیادی نصیب ملت ایران و جهان گردید. این پیشرفتها همچنین در قرون بعد نیز ادامه یافت. در قرن 13 میلادی، ابن بیطار، اختصاصات متجاوز از 1400 گیاه را که خود شخصاً می شناخت را در کتابش شرح داد (دوازده امامی، 1386).
1-4- گیاه شناسی رازیانه:
رازیانه گیاهی است علفی، معطر و چند ساله از تیره چتریانUmbelliferae با نام علمی Foeniculum vulgare که ارتفاع آن حدود 2 متر، ساقههای آن قائم، استوانه ای، منشعب و سبز رنگ است. ریشه غدهای، دوکی شکل و مستقیم، برگهای این گیاه متناوب با پهنک منقسم به قطعات نازک و نخی شکل، گلها زرد رنگ و مجتمع کوچک و منظم به صورت چتر مرکب است. شاخکهای چترهای آن بلند و شامل پایههای نامساوی است؛ به طوریکه تعداد آنها به 15 نیز میرسد. پهنای گل آذین چتری آن در حدود 15 سانتی متر است. گلهای این گیاه عسل دهندههای خوبی محسوب میشوند. میوه آن کوچک، دو فندقه به طول 6 تا 12 و عرض2 تا 4 میلی متر و دارای بوی معطر است)کمالی و همکاران،1380).

فرمانرو: گیاهان
دسته: گیاهان گلداررده: دولپهای
راسته: آپیالس
تیره: چتریان
سرده: رازیانه
گونه: F.vulgare
نام علمی: Foeniculum vulgare
1-5- اندام داروئی:
تمام اجزای رازیانه قابل استفاده است. از آن جمله شکوفهها و دانههای آنرا بلافاصله بعد از رسیدن و برگهای آنرا در تیرماه چیده و در سایه خشک میکنند و همچنین ریشه رازیانه را میتوان در اواخر پائیز برداشت نموده و خشک کرد.(سیکوتی و همکاران، 2008)
1-6- نیازهای اکولوژیکی:
رازیانه بیشتر بر روی شیبهای صخرهای و کوهستانی خشک، آهکی، آفتابگیر، قابل نفوذ و فاقد رطوبت زیاد میروید.
1-7- پراکنش جغرافیائی:
رازیانه گیاهی است مدیترانه ای، هوای گرم برای رشد و نمو آن مطلوب می باشد. به طور کلی کشت این گیاه در مناطق با هوای گرم (تابستان طولانی و زمستان بیش از اندازه سرد نداشته باشد) موفقیت آمیز است (دامژانویک و همکاران، 2005). این گیاه بومی نواحی مدیترانه و آسیا بوده، امروزه در جنوب فرانسه ، ایتالیا و سایر نقاط جهان کشت میشود. در ایران رازیانه به صورت خودرو در مناطقی مثل شمال، تهران، کرمان، کردستان، اصفهان و … می توان یافت و در اکثر نقاط ایران قابل کشت است. جوانه زنی بذور در دمای 6-8 درجه سانتیگراد انجام میگیرد ولی درجه حرارت مطلوب برای جوانه زنی 16-65 درجه سانتی گراد میباشد. pH مناسب برای این گیاه 8/4 تا 8 است. خاکهای لومی رسی با مواد و عناصر غذائی و ترکیبات هوموسی کافی خاکهای مناسبی برای رویش این گیاه می باشد. دمای مطلوب در طول رویش و در طول زمان تشکیل میوه 20-22 درجه سانتی گراد است. در زمستانهای طولانی و بسیار سرد ریشههای گیاه دچار سرمازدگی میشوند. آبیاری در مراحلی از رشد، رویش اولیه، مرحله تشکیل ساقه و مرحله نمو گلها، تأثیر قابل توجهی بر کمیت و کیفیت مواد مؤثره این گیاه دارد.(باقری و همکاران، 1376)
در شکل زیر قسمتهای آنالیز میکرسکپی پودر رازیانه نشان داده شده است .

Tracheids Vittae Endosperm Endocarp Mesocarp
گرد رازیانه را از میوه های خشک شده گیاهی به نام فینکولوم ولگا را از تیره چتریان بدست می آورند . گردی است سبز مایل به زرد با بوی تند شبیه بوی انتول (معطر) ، مزه آن ابتدا تند و کمی شیرین سپس تلخ و کافوری می شود . در زیر میکرسکوپ شامل قسمتهای زیر می باشد :
الف- تکه هائی از پارانشیم حفره ای (سلولهای دندانه ای شکل) از قسمت مزوکارب ، زیاد و اختصاصی می باشد.
ب- تکه هائی از اپیدرم پوشش داخلی با سلولهای کف پوشش مانند همراه با پارانشیم تحتانی که در طرف راست تصویر قرار دارد و باقیمانده هائی از لوله های روغنی (تکه هائی از لوله های ترشحی شیزوشس که اطراف آن را سلولهای مخاطی احاطه نموده است) ، زیاد و اختصاصی می باشد.
پ- تکه هائی از بافت کلانشیم نزدیک آوندهای هدایت کننده با دیواره های سلولی قرمز مایل به قهوه ای زیاد و اختصاصی می باشد.
ت- قطرات زرد رنگ روغنی ، زیاد و اختصاصی نمی باشد.
ث- تکه هائی از اندوسپرم همراه با بلورهای ریز ستاره ای شکل اکسالات کلسیم ، شفاف ، دیواره های سلولی ضخیم ، خیلی زیاد ولی اختصاصی نبوده و چون در دانه های دیگر گیاهان چتریان نیز دیده میشود.
ج- تکه های شکسته شده از فیبرهای اسکرانشیم شده از کارپوفور (1) کم و اختصاصی نمی باشد.
توجه : این گرد باید فاقد تارو آوندهای بیش از 10 میلی میگرون قطر باشد. امکان مخلوط با گرد زیره نیز مشاهده است. (یاسن و همکاران، 2009)
1-8 – آفات و بیماریها:
رازیانه یک گیاه شته دوست می باشد و در شرایط مناسب به گیاه حمله می کند. آفات در طول رویش ممکن است خسارات سنگینی به رازیانه وارد کنند. خسارت عموماً از جانب سنهای لکه دار(Cygaeus) که متعلق به خانواده میریده(Miridae) هستند وارد می شود. همچنین یکی دیگر از آفات مهم رازیانه شته است. این حشرات با مکیدن شیره گیاه سبب ضعف آن و کاهش عملکرد می گردند برای مبارزه با سنها می توان از سم دیتریفون(Ditrifon). و یا وفاتوکس (Wefatox) برای مبارزه با شته ها می توان از شکارگرهای طبیعی مثل کفشدوزکها و یا سموم شیمیائی سیستماتیک مثل متاسیتوکس استفاده شود)داس و همکاران 2008)
1-9- مهمترین خاصیت درمانی و داروهای ساخته شده:
تسکین دردهای قاعدگی و ضد سرفه از مهمترین خواص داروئی این گیاه است که فرآورده های تولید شده از رازیانه نیز با خواص فراوان دارویی، التیام بخش بسیاری از بیماری ها از جمله سرفه و سرماخوردگی است. رازیانه، نوعی گیاه دارویی است که مصارف مختلفی دارد . تمام بخش های مختلف این گیاه یعنی دانه، برگ و ریشه آن خوراکی است، ولی روغن حاصل از دانه های رازیانه، سمی بوده و حتی مصرف کم آن، می تواند منجر به ایجاد دانه های پوستی، مشکلات تنفسی وحالت تهوع گردد. این گیاه دارای طعم تند، تلخ و شیرین است و کمی به طعم نعنا شبیه است. مصرف رازیانه باعث افزایش شیرمادر و نیز کاهش وزن می شود. قابل توجه: مصرف بیش از اندازه این گیاه، ممکن است منجر به تشنج عضلانی و حتی توهم شود. رازیانه حاوی مقادیر فراوانی ویتامین و مواد معدنی است: فیبر، منگنز، پتاسیم، منیزیم، کلسیم، آهن، ویتامین C ، B3 و غیره ویتامین C موجود در پیاز رازیانه، ضد باکتری بوده و برای سیستم ایمنی بدن بسیار مفید است. علاوه برآن، این بخش از گیاه، دارای فیبر فراوانی بوده که برای کاهش کلسترول ، مفید است و از ابتلا به سرطان روده پیشگیری می کند. رازیانه همچنین دارای مقدار فراوانی پتاسیم است که باعث کاهش فشارخون می شود و به این ترتیب فرد، دچار حمله قلبی نمی شود.این گیاه دارویی،سموم بدن راپاک می کند و بیماری التهاب دهان رااز بین می برد و برای درمان سرماخوردگی و نیز سرفه، به خاطر خاصیت خلط آورش، مفید است. بخار حاصل از جوشاندن برگ های این گیاه در آب، بیماری آسم و برونشیت را تسکین می دهد.مصرف دانه های رازیانه، باعث تسکین دل درد می شود و عمل هضم را آسان تر می کند، کرم روده کودکان را از بین می برد، باعث تقویت چشم می شود، حساسیت های چشم را از بین می برد و دارای خواص فراوانی برای کبد، طحال و مثانه است.(سیپوریدیس و تومیریدیس، 2003)
تمام بخش ‌های مختلف این گیاه یعنی دانه، برگ و ریشه آن خوراکی است، ولی روغن حاصل از دانه‌ های رازیانه، سمی بوده و حتی مصرف کم آن، می‌ تواند منجر به ایجاد دانه ‌های پوستی، مشکلات تنفسی و حالت تهوع گردد.
اما توجه داشته باشید که مصرف بیش از اندازه این گیاه، ممکن است منجر به تشنج عضلانی و حتی توهم شود.
1-10- پیاز رازیانه
رازیانه حاوی مقادیر فراوانی ویتامین، مواد معدنی و فیبر است. منگنز، پتاسیم، منیزیم، کلسیم، آهن، ویتامین Cو B3 از این موارد می باشند.
این بخش از گیاه، دارای فیبر فراوانی بوده که برای کاهش کلسترول، مفید است و از ابتلا به سرطان روده پیشگیری می ‌کند .رازیانه همچنین دارای مقدار فراوانی پتاسیم است که باعث کاهش فشارخون می‌ شود و به این ترتیب برای افرادی که دچار حمله قلبی می‌ شوند، مفید است.
این گیاه دارویی، سموم بدن را پاک می ‌کند و بیماری‌ التهاب دهان را از بین می ‌برد و برای درمان سرماخوردگی و نیز سرفه، به خاطر خاصیت خلط‌ آورش، مفید است.(کوبوریس و واسیلاکاکیس، 2006)
1-11- دانه رازیانه
بخار حاصل از جوشاندن برگ‌ های این گیاه در آب، بیماری آسم و برونشیت را تسکین می ‌دهد. مصرف دانه‌ های رازیانه، باعث تسکین دل درد می‌ شود، عمل هضم را آسان ‌تر می ‌کند، کرم روده کودکان را از بین می ‌برد، باعث تقویت چشم می ‌شود، حساسیت ‌های چشم را از بین می‌برد و دارای خواص فراوانی برای کبد، طحال و مثانه است.(باقری و همکاران،1376 و دانشور حسینی،1387)

1-12- نقش کشت بافت در تکثیر گیاهان
کشت بافت سلول گیاهی، روشی است برای تکثیر گیاهان که از طریق آن میتوان تعداد زیادی گیاه تولید کرد. کشت بافت گیاهی گستره وسیعی را در بر میگیرد که شامل کشت پروتوپلاست، سلول، بافت و اندام گیاهی است. کشت بافت همچنین پیش نیاز مهندسی ژنتیک است زیرا از سلول تغییر یافته باید بتوان یک گیاه کامل به وجود آورد. کشت بافت بر مبنای سه توانایی اصلی گیاه استوار است :
*قدرت باززایی یا توانایی ارثی یک سلول گیاهی برای رشد و تبدیل شدن به گیاه کامل در صورت فراهم بودن شرایط محیطی و محرکهای مناسب، اگر چه به لحاظ تئوری توانایی باززایی در تمام سلولهای گیاهی وجود دارد ولی سلولهای مریستمی بهترین سلولهایی هستند که قادر به بروز این قدرت میباشند.
*عدم تمایز یا قابلیت برگشت سلولهای بالغ گیاهی به شرایط مریستمی و تولید یک نقطه رشد جدید که با تمایز مجدد یا قدرت سازماندهی و تشکیل اندام جدید ادامه مییابد.
* شایستگی یا قابلیت درون زاد یک سلول یا بافت مشخص، به رشد در مسیری ویژه (کانلی و تیان ، 2007 و تانگ و همکاران ، 2001).
کشت بافت به عنوان یک روش کاربردی در پیشرفت‌های کشاورزی نقش بارزی داشته است. مثلاً کشت تخمک منجر به تلاقی‌های بین گونه‌ها و حتی جنس‌های مختلف شده است و ریزازدیادی به افزایش سریع جمیعت از یک گیاه برتر منتهی گردیده است. از طرف دیگر، کشت بافت به تنهایی نمی‌تواند پیشرفت‌های سریع مورد نیاز برای اصلاح و بهبود محصولات را فراهم آورد. با این وجود، کشت‌بافت همراه با ژنتیک مولکولی، قابلیت بیشتری برای بهبود سریع محصولات را فراهم می‌آورد. در همان حال که تکنیک‌های ژنتیک مولکولی DNA ژن‌ها را دست‌ورزی می‌نماید، کشت سلول و بافت برای مهندسی ژنتیک ضروری خواهد بود زیرا اطلاعات ژنتیکی خارجی DNA به یک گیاه کامل وارد نمی‌شود بلکه به یک سلول وارد می‌شود. فناوری درون شیشه‌ای واسطه‌ای برای تبدیل تک سلول تغییریافته به یک گیاه کامل می‌باشد (توحید‌فر و کاویانی، 1389).
ریزازدیادی به عنوان یکی از روش های نوین افزایش انبوه گیاهان به ویژه پایههای درختان میوه در چند دهه اخیر بیشتر مورد توجه بوده است. پایههای رویشی تولیدی غالبا عاری از آلودگی ، دارای خلوص ژنتیکی و از نظر اقتصادی مقرون به صرفه هستند که برای تولید و احداث باغات یکدست و متراکم استفاده میشوند. استفاده از دورگههای بین گونهای به خصوص برای درختان میوه هستهدار در کشورهای پیشرفته بیشتر معمول شده است. از آنجایی که اساس احداث باغهای مکانیزه بر تولید نهالهای رویشی و یکسان استوار است لذا بررسی روشهای تکثیر رویشی مناسب به خصوص ریز ازدیادی برای تولید انبوه پایهها حائز اهمیت است. (سولوسوگلا، 2002)
اهمیت استفاده از روش کشت بافت گیاهی برای تکثیر گیاهان دارویی در حال افزایش بوده و این روش برای تکثیر بسیاری از گیاهان دارویی استفاده می شود. از جمله مزایای مهم تکثیر از طریق کشت بافت نسبت به روشهای دیگر، ایجاد گیاهان سالم، تکثیر در طول سال، احتیاج به مکان کم و هزینه کمتر است. در مراحل مختلف کشت بافت گیاهی جهت رسیدن به هدف، ممکن است از دما، نور، نوع ریزنمونه، زمان و یا محیط کشتهای مختلف با ترکیبات متفاوت استفاده شود. همچنین مدیریت آلودگی و مواد بازدارنده نیز از مسایل مهم کشت بافت است. بنابراین بدست آوردن بهترین روش برای هر گیاه از اهداف آزمایشات در این علم می باشد و این امر با تغییر فاکتورهای موثر در کشت بافت امکان پذیر میگردد. بهبود حتی چند درصدی در تولید گیاهچه در هر بار کشت میتواند در مقیاس سال برای تولید کننده از اهمیت اقتصادی زیادی برخوردار باشد.(شریفی و همکاران، 1389)
1-13- تاریخچه کشت بافت
در طول قرن 19، ایده تولید کالوس از قطعات ساقه و انتهای ریشه به واقعیت پیوست. کالوس عبارت است از یک توده سلولی از سلولهای در حال تقسیم فعال که تمایز نیافتهاند. بعد کالوس از جوانهها، قطعات ریشه و شاخساره نیز تهیه شد. برای اولین بار هامبرلت در سال 1902 واژه کشت بافت سلول را بکار برد. او تلاش کرد که سلولهای گیاهی جدا شده را بطور درون شیشهای بر روی یک محیط غذایی مصنوعی حاوی محلول Knop (شامل پپتین، آسپارژین، و ساکاروز) کشت کند. واژه کشت بافت میتواند برای هر کشت چند سلولی بر روی محیط غذایی بکار برده شود (شریفی و همکاران، 1388). تکنولوژی کشت بافت گیاهی، کاربردهای متفاوت و فراوانی دارد از آن جمله میتوان از ریزازدیادی که اساس صنعت تولید انبوه گیاهان است نام برد. پیشرفت مطالعه جنبههای متفاوت رشد و تمایز گیاهان در دهه 1960 و 1970 بسیار سریع بوده است. به کمک تکنیک کشت گیاهان مطالعه و تحقیق در زمینههای مختلف از جمله مورفولوژی، فیزیولوژی، بیوشیمی، بیولوژی مولکولی و مهندسی ژنتیک فراهم شده است. تکثیر سریع ارکیده از طریق کشت کورم اولیه توسط مورل (1960) منجر به تاسیس اولین صنعت تکثیر سریع ارکیده بر اساس کشت بافت شد. کشت بافت گیاهی یا کشت درون شیشهای عبارت است از رشد سلول، بافت و یا اندام گیاهی در یک محیط غذایی مصنوعی استریل که به صورت جامد یا مایع تهیه میشود، این تکنیک به عنوان یکی از شاخههای زیست فناوری، کاربرد گسترده ای در کشاورزی دارد. در کشت بافت، قسمتی از گیاه به نام قلمه یا ریزنمونه که ممکن است بخشی از ساقه، برگ، جوانه و یا یک سلول باشد، در محیط کنترل شده کشت میشود. در این نوع کشت، شرایط به گونهای است که عاری از هرگونه میکروارگانیسم بوده و رژیم متعادلی از مواد شیمیایی و آلی مورد نیاز رشد گیاه فراهم است. در واقع در کشت درون شیشهای محیط کشت بستری برای رشد گیاه است و ترکیبی از مواد شیمیایی و آلی در یک ژل مغذی یا محیط مایع برای رشد سلولها و بافتها میباشد (شریفی و همکاران، 1389).
1-14- مراحل تکنیک کشت بافت
از زمان تهیه ریز نمونه تا به دست آوردن گیاه جدید مراحلی وجود دارد که ابتدا شامل چهار مرحله شروع و برقراری کشت ، تکثیر ، ریشه دهی و انتقال به خاک بود (موراشیگ ، 1974) . بعدا دبرگ و مین یک مرحله به نام مرحله صفر یعنی مرحله انتخاب گیاه مادری و آماده سازی را ارائه نمودند. در نهایت امروزه برای ریز ازدیادی مراحل زیر را در نظر می گیرند که شامل پنج مرحله ی آمادگی ، آغازی ، تکثیر ، ریشه دهی و انتقال است. در هر یک از این مراحل ، شرایط باید به گونه ای فراهم گردد که امکان دستکاری رشد گیاه در جهت مورد علاقه فراهم گردد. اکثر این عوامل هم آنهایی هستند که رشد و نمو طبیعی گیاهان را تنظیم می کنند. در مرحله صفر یا همان آمادگی هدف به دست آوردن گیاهانی است که به آب و مواد غذایی و شرایط محیطی نظیر نور و درجه حرارت و.. دسترسی داشته و از نظر سلامتی مشکلی نداشته باشند و بتوان از آنها جهت تهیه ریز نمونه استفاده کرد. در مرحله بعدی نیز که مرحله آغازی نام دارد هدف انجام کشت های بدون آلودگی است که ریز نمونه در محیط کشت مستقر می شود.
مرحلهی صفر: مرحله پیش ازدیادی یا انتخاب و پیش تیمار گیاهان مناسب
در این مرحله گیاهان مادری که در شرایط گلخانه ای با کمترین میزان آلودگی هستند انتخاب می شوند. قبل از جمع آوری نمونههای گیاهی برای به حداقل رساندن میزان آلودگی باید گیاهان مادری با قارچ کشها و حشرهکشها سمپاشی شوند تا میزان آلودگی در کشت درون شیشه ای به حداقل برسد، کاهش آلودگی باعث رشد بهتر و تکثیر سریع تر نمونهها در محیط کشت میشود. کنترل آلودگیها به طور معمول با پیش تیمار گیاهان مادری شروع میشود.(دبرگ و مین، 1981)
مرحله ی 1 : مرحله ضد عفونی سطحی و استقرار ریز نمونهها از درخت مادری
اولین مرحله در ریز ازدیادی ضد عفونی سطحی ریز نمونهها می باشد. وقتی نمونهای سالم در شرایط استریل قرار میگیرد، میتواند به سرعت تکثیر شود. این مرحله حساسترین مرحله در ریز ازدیادی است چرا که اغلب نمونهها در این مرحله در بیشتر موارد به علت آلودگیهای میکروبی از بین میروند. در این مرحله ریز نمونهها که به صورت قطعات کوچک تقسیم شده اند با مواد شیمیایی مانند هیپوکلریت سدیم و اتیل الکل ضدعفونی سطحی و بعد از آن چندین بار با آب مقطر استریل آبشویی میکنند. بعد از یک دوره کوتاه 3 تا 5 روزه آلودگی ریزنمونهها در محیط کشت مشخص میشود و نمونههای آلوده حذف شده و نمونههای سالم واکشت میشوند. در مرحله ضد عفونی ریز نمونهها باید دقت شود غلظت مواد ضدعفونی و مدت زمان استفاده از آنها به اندازهای نباشد که به بافت ریز نمونهها صدمه زده و مرگ سلولی را سبب شده و باعث قهوهای شدن و از بین رفتن آنها شود. (جورج، 2008 )
مرحله 2: تکثیر و پرآوری ریز نمونهها
این مرحله که فاز تکثیر است، گیاهچههای حاصل از استقرار در محیط کشت مخصوص تکثیر میشوند. هدف اولیه در این مرحله تکثیر ریز نمونهها بدون از دست دادن ثبات ژنتیکی آنها است. واکشت نمونهها که می توانند به صورت، جوانههای جانبی و انتهایی، جنینهای سوماتیکی و دیگر ارگانها باشند، در محیط مخصوص تکثیر باعث افزایش تعداد نمونهها میشود. گاهی اوقات ضروری است که شاخههای تکثیر شده به محیط کشت دیگری برای طویل شدن منتقل شوند . طی واکشتهای متوالی مقدار مورد نیاز از اندام گیاهی تولید میشود. (موراشیگ ، 1974)
مرحله 3: ریشه دهی زیر شاخهها
شاخههای به دست آمده از مرحله دوم، در این مرحله برای تکمیل فرایند ریز ازدیادی باید ریشهدار شوند. بیشتر گیاهان در مرحله ریشه دهی نیاز به محیط کشتی با نصف عناصر ماکرو دارند. در این مرحله معمولا از تنظیم کنندههای رشد متفاوت از مرحله پرآوری استفاده میشود. برای موفقیت مرحله سازگاری و انتقال به خاک ، گیاهچههای دارای ساختمان ریشه مناسب و قوی ضروری است. این مرحله نیاز به کار زیاد دارد و غالبا گران است. بطوری که محاسبه شده که حدود 35 تا 75 % از کل هزینههای تولید را شامل میشود.(جورج، 1993)
مرحله 4: مرحله سازگاری به شرایط طبیعی
این مرحله آخرین مرحله از کشت درون شیشه ای است که نمونههای تکثیر شده برای انتقال به گلخانه آماده میشوند. نمونههای تکثیر شده در شرایط درون شیشهای ، تمایل به رشد انفرادی و انجام عمل فتوسنتز دارند. نمونهها به تدریج از شرایطی با رطوبت زیاد به رطوبت کم و از شدت نور به شدت نور زیاد و دمای محیطی متغیر منتقل میشوند. اگر نمونهها در محیط کشت جامد باشند، قبل از انتقال باید آگار چسبیده به اندامهای گیاهچه به آرامی توسط آب شسته شود و سپس در خاک مناسب در گلدانهای کوچک کشت شوند. نمونهها به تدریج میتوانند بعد از 3 تا 6 روز به محیط جدید با شرایط نوری طبیعی وارد شوند و بعد از آن گیاهان به مخلوط ماسه، پیت و یا کمپوست منتقل میشوند و به تدریج سازگار میگردند. آبیاری مرتب نمونهها (روزهای اول انتقال به خاک با نصف غلظت محیط کشت) و مبارزه با عوامل بیماری زا و آفات از ضروریات انتقال موفق است (جورج، 1993؛.اهلووالا، 2002).



قیمت: 11200 تومان

Leave a Reply

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *