سلول، پرولین، پروتئینهای، پروتئوم، پروتئینها، شوری

ب به عنوان مخزن کربن و نیتروژن نیز میباشد. همچنین پرولین حفاظت گیاه را در برابر صدمات رادیکالهای آزاد انجام میدهد (ماتیسیک و همکاران، 2002). کاهش مصرف پرولین برای سنتز پروتئین در طی تنش ممکن است دلیل احتمالی تجمع پرولین باشد (ستوارت، 1972).
یافتهها نشان میدهد که نقش اولیه پرولین در تحمل تنش اسمزی منحصرا به عنوان یک تنظیم کننده پتانسیل اسمزی نیست، بلکه این مولکول به سلول کمک میکند تا بر تنش اکسیداتیو نیز غلبه کند. از دیگر خواص پرولین، حفاظت آنزیمها از تجزیه شدن (راجنداراکومار و همکاران، 1994). تنظیم اسید سیتوسیلیک (ونکمپ، 1989)، حذف رادیکالهای آزاد (اشرف و فولاند، 2007)، پایداری ساختار دیواره سلولی و پروتئین‌ها (سرینیواز و بالاسوبرامانیان، 1995)، برقراری تعادل در نسبت NADHNAD+ (آلیا و سارادهی، 1991) و فعال سازی منبع انرژی (کوهل و همکاران، 1998) است.
مورانت-مانسیو و همکاران (2004) اظهار داشتند در سه گیاه چاودار، تریتیکاله هگزاپلوئید و Triticum dicoccum farrum با افزایش میزان شوری، محتوای پرولین آزاد در برگ و ریشه اختلاف معنی داری با شاهد نشان دادند. آهنگ صعودی میزان پرولین با افزایش شوری در ریشه شبیه به برگ بود ولی از نظر کمیت میزان تجمع این ماده در برگ چندین برابر ریشه بود. با این وجود، با توجه به مقدار کم این ماده در بافتهای گیاهی، سهم پرولین در تنظیم پتانسیل اسمزی نسبت به سایر اسمولیتهای آلی کمتر بود. پوستینی و همکاران (2007) نیز افزایش پرولین بر اثر شوری را در گندم گزارش کردند، اما این افزایش در رقم حساس به مراتب بیشتر از رقم مقاوم به شوری بود و نتیجه گرفتند که پرولین نمی تواند نقش حفاظتی در مقابل تنش شوری داشته باشد. سيلوريا و همکاران (2003) گزارش كردند تغييرات افزایش غلظت پرولين در ارقام گندم حساس به شوري بيشتر است و اين تغييرات در مراحل مختلف رشد و در اندامهاي هوايي و ريشه متفاوت از يكديگر ميباشد. افزايش غلظت پرولين برگها با افزايش فعاليت آنزيم پروتئاز، تجمع اسيد آمينهها و آمونيوم و كاهش ميزان كلروفيل برگ و پروتئين همراه است. ميقاني و ابراهيم زاده (1381) گزارش نمودهاند در گياه گندم، رقم قدس (حساس به شوری) تحت تنش شوري غلظت پرولين نسبت به گیاهان بدون تنش به 9/2 برابر رسیده. همچنين افزايش غلظت پرولين و كاهش فعاليت آنزيم پرولين دهيدروژناز در برگ گندم قدس (حساس به شوری) بيشتر از گندم بولاني (مقاوم به شوری) بود. توانايي توليد آنتي اكسيدان سلول گياهي تحريك شده است. توليد پرولين و ساير سازگار كنندهها با مصرف مقدار زيادي از كربن حاصل از فرآيند فتوسنتز همراه بوده و بدين دليل كاهش رشد گياه را در پي خواهد داشت .علی و همکاران (2008) گزارش نمودند که مقدار پرولین در گیاهان متحمل بیشتر از گیاهان حساس تجمع مییابد. آنها علت رشد بهتر گیاهانی که پرولین بیشتری تجمع میدهند را تعدیل پتانسیل اسمزی میدانند که در نتیجه آن فشار تورگر سلول و پتانسیل آب برگ افزایش مییابد. همچنین گزارشهای فراوانی به این نتیجه رسیدهاند که کاربرد پرولین به صورت محلول پاشی برگی بر روی گیاهان تحت تنش شوری باعث افزایش تحمل آنها میشود (کلوسن، 2005؛ علی و همکاران، 2007).
بعضی از گزارشها نیز از وجود یک رابطه همبستگی بالا بین تجمع پرولین با افزایش تحمل به شوری حکایت میکنند (احمد و همکاران، 2010). تجمع پرولین تحت تنش شوری در گیاهان فراوانی (از هر دو گروه هالوفیت ها و گلوفیت ها) مانند ذرت (سیسک و کاکرلر، 2002)، سورگوم (دلاسردا و همکاران، 2005)، توت (هاریناسوت و همکاران، 2003) و آفتابگردان (شهباز و همکاران، 2010) مشاهده شده است. با این وجود همیشه رابطه مثبتی بین افزایش شوری و مقدار پرولین وجود ندارد. در گیاهانی مانند گوجه فرنگی (عزیز و همکاران، 1998)، سویا (موفتاه و میشل، 1987)، لوبیا (اشرف، 1989)، برنج (لوتس و همکاران، 1999) و نخود فرنگی (سانچز و همکاران، 1998) نتایج کاملا متفاوتی از نظر میزان تجمع پرولین تحت تنش شوری گزارش شده است. در این گیاهان با افزایش میزان شوری نه تنها مقدار پرولین بیشتر نمیشود بلکه کاهش نیز مییابد.
1-2-2-4- اثر شوری بر تشکیل رادیکالهای آزاد در گیاهتنش شوری، کم آبی را بر گیاه تحمیل میکند زیرا اسمز بر پهنه وسیعی از فعالیتهای متابولیکی موثر است (مونس، 2002). این کمبود آب منجر به تشکیل گونههای فعال اکسیژن (ROS) مثل سوپراکسید، هیدروژن پراکسید، رادیکال هیدروکسیل (هالیول و گوتریج، 1985) و اکسیژن منفرد (الستنر، 1987) میشود. این گونههای فعال اکسیژن از طریق آسیب اکسیداتیو به لیپیدها (وایز و نیلور،1987)، پروتئینها و اسیدهای نوکلئیک (ایملای و لین، 1988) متابولیسم طبیعی سلول را تخریب میکنند.
اولین اثر تنش شوری نتیجه عدم تعادل یونی و تنش هیپراسموتیک میباشد که به دنبال آن تنش اکسیداتیو اتفاق افتاده، تثبیت Co2 محدود میشود. در نتیجه احیای کربن در سیکل کلوین کاهش پیدا کرده اکسیده شدن NADP+ (گیرنده الکترون فتوسنتزی) کم میشود. وقتی که فردوکسین در طول انتقال الکترون فتوسنتزی از فتوسیستم یک به اکسیژن، به شکل رادیکال سوپر اکسید کاهش مییابد، واکنشی به نام واکنشMehler انجام میشود که هدف واکنش رادیکالهای اکسیژن میباشد (کائو و همکاران، 2003).
1-2-3- نشانگرهای پروتئینی و پروتئومیکاستفاده از نشانگرهای پروتئینی در اواسط قرن بیستم متداول گردید. مبنای کار این نشانگرها تنوع در پروتئینها میباشد. از جمله نشانگرهای پروتئینی میتوان به پروتئینهای ذخیرهای مثل زئین، گلیادین و گلوتنین اشاره کرد. یکی دیگر از انواع نشانگرهای پروتئینی ایزوزیمها هستند که فرمهای مختلف الکتروفورزی یک آنزیم را نشان میدهند. این نوع از نشانگرهای پروتئینی تغییرات در سطح فرآوردههای ژنی را به صورت هم بارز نشان میدهند. از مزایای این نشانگرها میتوان به کم هزینه بودن، تجزیه سریع دادههای حاصل از آن و چند شکلی بالای آنها در مقایسه با اکثر نشانگرهای مورفولوژیکی اشاره نمود. اگرچه این نشانگرها برخی از معایب نشانگرهای مورفولوژیکی را برطرف کردند ولی آنها نیز دارای معایبی مانند محدودیت تعداد و چند شکلی کم در بین ارقام اهلی در مقایسه با نشانگرهای DNA، پوشش ژنومی ضعیف و توزیع غیرتصادفی در ژنوم میباشند. علاوه بر این برخی از ایزوزیمها وابسته به اندام، بافت و یا مرحله رشدی گیاه بوده و تحت تأثیر تغییرات پس از ترجمه نیز قرار میگیرند. یکی از روشهای بررسی الگوهای پروتئینی مبتنی بر الکتروفورز SDS-PAGE میباشد که یک روش کم هزینه، سریع و تکرارپذیر در مطالعه پروتئینها است. در این روش سدیم دو دسیل سولفات (SDS) که یک شوینده آنیونی است با اتصال به پروتئینها بار طبیعی آنها را میپوشاند و بار منفی تقریباً مشابهی در این مولکولها ظاهر میسازد. بنابراین حرکت نمونهها بر اساس وزن مولکولی آن‌ها صورت میگیرد. بیشترین مورد استفاده از این سیستم تعیین وزن مولکولی پپتیدها است که با استفاده از پروتئینهای استاندارد با وزن مولکولی مشخصی میتوان وزن مولکولی پلیپپتید مجهول را تخمین زد (نقوی و همکاران، 1384). پیشرفتهایی که در زمینۀ الکتروفورز دو بعدی با قدرت تفکیک زیاد پدید آمده و تجزیه و تحلیل هم زمان هزاران پروتئین را میسر ساخته، موجب شده که نشانگرهای پروتئین جایگاه از دست رفته خود را دوباره بازیابند و به عنوان فناوری پیشتاز در عرصۀ نشانگرهای مولکولی مطرح شوند (نقوی و همکاران، 1384). پروتئومیک با فراهم ساختن دید گستردهای از پروتئینهای بیان شده در بخشهای مختلف گیاهی و شرایط محیطی مختلف، جایگاه خاصی را در مطالعات مختلف به خصوص تحقیقات مربوط به تنشهای محیطی برای خود باز کرده است (ویلکینز و همکاران، 1996). تأثیرپذیری نشانگرها از محیط که به طور معمول به عنوان یکی از محدودیتها و نمات منفی نشانگرهای مولکولی یاد میشود در مورد این نشانگرها تبدیل به برتری شده است (نقوی و همکاران، 1384).
پروتئومیک یک روش مبتنی بر تکنیک الکتروفورز دوبعدی است. هر پروتئین یک نقطۀ ایزوالکتریک دارد که در آن بار مثبت و منفی پروتیئن با هم برابر میشود. در الکتروفورز بعد اول از این خاصیت بهره میگیرند. ژل بعد اول را به بعد دوم که همان الکتروفورز SDS-PAGE معمولی است منتقل میکنند. در الکتروفورز بعد دوم حرکت پروتئینها در میدان الکتریکی بر اساس وزن مولکولی صورت میگیرد. با بهبود سیستمهای الکتروفورز دوبعدی، تشخیص و تعیین تعداد پروتئینها با استفاده از نرم افزارهای قوی کامپیوتری، طیف سنجی جرمی و بیوانفورماتیک، استفاده از این نشانگرهای پروتئینی چشمانداز روشنی را در پیش روی خود دارد (لیبلر، 2002).
پروتئومیک رهیافت قدرتمندی برای مطالعه تغییرات بیان پروتئینهای مختلف در پاسخ به تنشهای زیستی و غیرزیستی است (زینگ و همکاران، 2002). امروزه با توجه به پیشرفت روز افزون زیست فناوری علاوه بر ژنومیک و پروتئومیک علوم دیگری نظیر ترانسکریپتومیک و متابولومیک نیز بوجود آمده است (رابیلود و چوالت، 2002). با تکمیل پروژه ژنوم انسان مشخص شد که مکانیسم مولکولی رفتار سلولها در شرایط مختلف را نمیتوان از روی توالی ژنها پیشگویی کرد. رفتار سلولی و تمام فعالیتهایی که در سلول انجام می شود بر عهده پروتئینهاست. در واقع برای ارتباط ژنوم با رفتار سلولها باید پروتئینهای سلولی را شناسایی کرد. به کلیه پروتئینهایی که در یک سلول در یک زمان مشخص بیان میشوند، پروتئوم آن سلول گفته میشود و این پروتئوم است که فاصله بین ژنوم و مکانیسم مولکولی رفتار سلول را پر میکند. برخلاف ژنوم برای هر موجود زنده نمیتوان یک پروتئوم واحد تعریف کرد. پروتئوم سلولهای مختلف با یکدیگر متفاوتاند یعنی سلولها علاوه بر پروتئینهای ضروری که در همه انواع سلولها بیان میشوند، دارای یک سری پروتئینهای اختصاصی نیز هستند. از این رو بهتر است پروتئوم را برای هر یک از انواع سلولها تعریف نمود. با این حال پروتئوم یک نوع سلول نیز همیشه ثابت نیست. سلول در برابر شرایط مختلف محیطی و پیامهایی که از سلولهای اطراف دریافت میکند، پروتئینهای مختلفی را بیان میکند. به عبارت دیگر هر سلول تحت شرایط مختلف پروتئومهای متفاوتی دارد. بنابراین برای شناسایی سازوکارهای مولکولی رفتار سلولی و واکنشهای زیستی، لازم است پروتئینهایی که در یک سلول بیان میشود، تغییرات آنها در شرایط مختلف، عملکرد آنها و همچنین برهمکنشهای بین پروتئینهای مختلف در یک سلول، بررسی شوند. به مجموعه این بررسیها، نقشهبرداری پروتئوم یا پروتئومیک اطلاق میشود. نقشهبرداری پروتئوم یا مطالعه پروتئوم به سادگی مطالعه ژنوم نیست، زیرا پروتئینها را نمیتوان همانند DNA به روشی مشابه PCR تکثیر نمود. همچنین توالیهای پلی پپتیدی نمیتوانند به توالیهای اسید آمینهای مکمل خود متصل شوند. بنابراین برای مطالعهی پروتئوم باید از ابزار و روشهای ویژهای استفاده نمود. در پروتئومیک نه تنها کلیه پروتئینهایی که در یک سلول در یک شرایط مشخص بیان میشوند، بلکه عملکرد و رفتار آنها، برهمکنش بین پروتئینهای مختلف، آرایشهایی که پس از ترجمه بر روی پروتئینها ایجاد میشود و نیمه عمر آنها در سلول نیز مورد بررسی قرار میگیرد (رابیلود و چوالت، 2002). در واقع پروتئومیک از سه بخش تشکیل شده است:
مشخص کردن کلیه پروتئینهایی که در سلول بیان میشوند:
در این بخش، کلیه پروتئینهای سلول تحت یک شرایط معین (مانند حالت استراحت، رشد، تمایز، بیماری، تاثیر دارو و …) مشخص میشود. به این ترتیب میتوان پروتئینهایی که در شرایط مختلف بیان میشوند یا میزان بیان آنها تغییر می کند را شناسایی کرد و به عملکرد آنها پیبرد.
نقشهبرداری برهمکنشهای بین پروتئینی:
پروتئینها در سلول به صورت منفرد عمل نمیکنند و اغلب تاثیر خود را با همکاری پروتئینهای دیگر و برهمکنش با آنها اعمال میکنند. نمونه بارز برهمکنشهای پروتئینی در مسیر انتقال پیام و مسیرهای بیوسنتزی مشاهده میشود. با شناسایی این برهمکنشها، به طور کارآمدتری میتوان عمل کرد و رفتار پروتئینها را مشخص کرد.
نقشهبرداری آرایشهای پروتئینی:
اغلب پروتئینها پس از ترجمه متحمل آرایشهای مختلفی مانند گلیکوزیله شدن، متیله شدن، استیله شدن، فسفریله شدن و … میشوند. این آرایشها بر فعالیت و عملکرد پروتئینها، همچنین ساختار فضایی، پایداری و نیمه عمر آنها تاثیر میگذارد. شناسایی این آرایشها، تاثیر آنها بر عملکرد پروتئینها و شرایطی که منجر به این آرایشها میشود، به شناخت رفتار و عملکرد پروتئینها کمک میکند. برای مشخص کردن پروتئینهایی که در سلول بیان میشود از کتابخانههای cDNA برای انواع مختلف سلولهای بدن استفاده شده است. اما برای مطالعه پروتئوم سلولها نمیتوان از کتابخانههای cDNA استفاده کرد. کتابخانههای cDNA فقط بیانگر کلیه mRNAهای بیان شده در یک سلول (ترانسکریپتوم) میباشد. ولی ترانسکریپتوم یک سلول مساوی با پروتئوم سلول نیست، زیرا بیان ژنها در سطح ترجمه نیز تنظیم میشود و ممکن است از روی یک ژن یک نوع mRNA ساخته شود ولی بدلیل تنظیم در سطح ترجمه، هرگز یک نوع پروتئین بیان نشود. همچنین میزان پروتئینهای مختلف در سلول تحت کنترل سیستم پروتئولیز نیز میباشد که با بررسی ترانسکریپتوم نمیتوان آن را مشخص کرد (تلن، 2007).
برای مشخص کردن پروتئینهایی که در سلول بیان میشوند از روشهای زیر استفاده میشود:
الف) الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید (PAGE) و یا SDS-PAGE
این روش در سال 1970 توسط لاملی ابداع شد. در آن دوران با این روش مطالعات علوم زیستی انجام شد و به طور وسیع از SDS-PAGE برای تفکیک پروتیئنها بر اساس اندازه استفاده گردید که دلیل آن می تواند سهولت کاربرد، تکرار پذیری، هزینه و مصرف مواد تقریبا کم آن باشد. گرچه کاربرد این روش آسان است ولی قدرت تفکیک آن تا حدی کم است. تجزیه با طیف سنجی جرمی MS نشان داده است که هر نوار پروتئینی SDS-PAGE از چند پروتئین به هم پیچیده و حتی در برخی موارد بیش از

Author:

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *