(سایت مرجع پژوهش علمی ) - \"”(سایت مرجع تحقیق علمی )”\"

او که یادش آرامش بخش دلهاست.
قدردان شما هستم ،
پدر و مادر عزیزم که همیشه حامی و پشتیبان من بوده اید،
معلمان و اساتید بزرگوارم در تمامی مقاطع تحصیلی به خاطر حرف حرفی که به من آموختید،
اساتید راهنما جناب آقای دکتر حسین ذوالقرنین و سرکار خانم دکتر نسرین سخایی که صبورانه و دلسوزانه با من همراه بوده اید،
سرکار خانمها دکتر بیتا ارچنگی و دکتر سهیلا مطرودی که زحمت داوری پایان نامه ام را پذیرفته اید،
دکترمحمد رنجبر و تیم غواصی ،
کارشناسان آزمایشگاه آقای دکتر زارعی (دانشگاه جندی شاپور)،آقای رضا پناه (آزمایشگاه میکروبیولوژی بیمارستان ولی عصر خرمشهر)،آقای گراوند،خانم جلیلیان و خانم حمیدی (دانشگاه علوم و فنون دریایی خرمشهر)،
خانواده و دوستان عزیزم و تمامی کسانی که ذره ای در حق من لطف کرده اند.
2222574803000
تقدیم اثر
خداوندا هر چه دارم از توست
از من بپذیر این اندک را .
تقدیم به پدر مهربان
و
مادر صبورم
و
دختر عزیزم
چکیده
اسفنج ها ی دریایی جانوران پرسلولیمتصل به بستر دریامی باشند ودر محیط های قطبی تا معتدل استوایی یافت می شوندآنها فیلترکننده آب دریاهستند. باکتری و میکروارگانیسم های فراوانی با اسفنج ها زندگی همزیست دارند. اسفنج توانایی تولید ترکیبات زیست فعالی را دارند و احتمالا نتیجه تعامل میکروارگانیسم با اسفنج است که دارای خاصیت ضد پاتوژن های انسانی می باشد. دراین تحقیق یک گونه اسفنج دریایی از جزیره هرمز خلیج فارس تهیه گردیددر شناسایی ژنتیکی مشخص شد که گونه اسفنجمتعلق بهsp.Callyslpongia ازگونه هایاسفنجخلیج فارس می باشد. با یک روش عصاره گیری از اسفنج خشک شده (D)، اسفنج منجمد شده(F)و عصاره الکلی اسفنج(E)و اثرضد باکتری و ضد قارچی عصاره ها بر باکتری گرم مثبت Shigella sp.,Staphylococcusaureus، باکتری گرم منفیEscherichia coli، دو گونه قارچAspergillusFlavis, Penicilliumsp. و مخمرCandidaalbicansبررسیشد. نتیجه موثر بودن عصاره نوعDاسفنجCallyslpongiasp.بر باکتری Staphylococcusaureus باایجادحداکثر قطر هاله عدم رشد میکروبی 9 میلی متری اثر کشندگی خوب وبر Shigellasp. قطر 4 میلی متری اثر کشندگی نسبتا خوب را نشان داد. عصاره اسفنج گونه sp.Callyslpongiaبر هیچ یک از قارچ ها و مخمر خاصیت مهار کنندگی رشد را نشان نداده است.
کلید واژه: اسفنج sp.Callyslpongia ، عصاره ضد باکتری ، عصاره ضد قارچ ،خلیج فارس.
فهرست مطالب
عنوان صفحه
TOC o "1-1" h z t "فهرست1;1" فصلاول : مقدمهوکلیات1-1 مقدمه PAGEREF _Toc417219902 h 21-2 معرفیاسفنج PAGEREF _Toc417219903 h 21-3 اسفنجومیکروارگانیسمهایهمزیست PAGEREF _Toc417219904 h 21-4 اهمیتکاربردارگانیسمهایدریایی PAGEREF _Toc417219905 h 31-5 اسفنجهایدریاییمنابعغنیازترکیباتفعالزیستی PAGEREF _Toc417219906 h 41-6 تنوعمتابولیتهایثانویهاسفنجدریایی PAGEREF _Toc417219907 h 41-7نقشترکیباتطبیعیدریاییدرزندگیانسان PAGEREF _Toc417219908 h 41-8 متابولیتهایفعالزیستیاسفنجدریاییباخواصدارویی PAGEREF _Toc417219909 h 51-8-1 متابولیتهایاسفنجدریاییباخواصضدپاتوژنی PAGEREF _Toc417219910 h 51-8-2 متابولیتهایاسفنجدریاییباخواصضدسرطانی PAGEREF _Toc417219911 h 61-8-3 متابولیتهایاسفنجدریاییباخواصآنتیبیوتیکی PAGEREF _Toc417219912 h 61-9 ترکیباتفعالزیستیاسفنجدریاییدرمرحلهکاربردبالینی PAGEREF _Toc417219913 h 61-10اهمیتمسئله PAGEREF _Toc417219914 h 71-11اهدافتحقیق: PAGEREF _Toc417219915 h 7فصلدوم : مروریبرپیشینهیپژوهش2-1خاصیتضدمیکروبیباکتریهایهمزیستاسفنجدریایی PAGEREF _Toc417219919 h 92-2 خاصیتضدباکتریعصارهاسفنجدریایی PAGEREF _Toc417219920 h 92-3 عصارهمتانولیضدباکتریاییوضدقارچیاسفنجHaliclona sp. PAGEREF _Toc417219921 h 92-4 عصارهمتانولیضدباکتریاییوضدقارچیاسفنج Sigmadocia pumila PAGEREF _Toc417219922 h 102-5 عصارهمتانولیضدباکتریاییوضدقارچیاسفنجZygomycale sp. PAGEREF _Toc417219923 h 102-6 بررسیاثرضدقارچیچهارنوععصارهازنهگونهاسفنجدریایی PAGEREF _Toc417219924 h 112-7 خواصضدباکتریاییعصارهاسفنجAxinella sinoxeaازجزیرهلارکخلیجفارس PAGEREF _Toc417219925 h 11فصلسوم : موادوروشها3-1 نمونهبرداری PAGEREF _Toc417219929 h 133-2 تهیهعصارهاسفنجدریایی PAGEREF _Toc417219930 h 143-2-1 تهیهعصارهاسفنجخشکشده PAGEREF _Toc417219931 h 143-3-2 تهیهعصارهالکلیاسفنج PAGEREF _Toc417219932 h 163-3 تهیهمیکروبوقارچهایبیماریزایانسان PAGEREF _Toc417219933 h 173-4کشتمیکروبوقارچ PAGEREF _Toc417219934 h 183-5 استخراج DNAوشناساییمولکولیاسفنجگونهcallyspongia sp. PAGEREF _Toc417219935 h 183-5-1 استخراجDNA PAGEREF _Toc417219936 h 183-5-2 بررسیکیفیتDNA PAGEREF _Toc417219937 h 193-5-3 PCR PAGEREF _Toc417219938 h 203-6 سنجشمیکروبی PAGEREF _Toc417219939 h 203-6-1آزمونحساسیتآنتیبیوتیککربیبایر PAGEREF _Toc417219940 h 203-6-2 بررسیاثرضدمیکروبیعصارهاسفنج . Callyslpongia spخشکشده PAGEREF _Toc417219941 h 203-7-3 بررسیاثرضدمیکروبیعصارهالکلیاسفنجCallyslpongia sp. PAGEREF _Toc417219942 h 213-6-4 بررسیاثرضدمیکروبیعصارهاسفنجمنجمدشدهCallyslpongia sp. PAGEREF _Toc417219943 h 213-6-5 (Minimum Inihibitory Concentration)MICو ) MBC (Minimum Bacteria Concentration PAGEREF _Toc417219944 h 213-7کدورتسنجیمحیطکشتمیکروبیمایع PAGEREF _Toc417219945 h 223-7-1تهیهسوسپانسیونمیکروبی 5/0 مکفارلند PAGEREF _Toc417219946 h 223-8-1رقتمهارکنندههایرشدمیکروبی PAGEREF _Toc417219947 h 223-8-2 دستگاهاسکتروفتومتری PAGEREF _Toc417219948 h 223-8 رقیقسازیعصارهاسفنجCallyslpongiasp.خشکشدهوسنجشMIC PAGEREF _Toc417219949 h 233-8-1رقیقسازی PAGEREF _Toc417219950 h 233-8-2MIC(Minimum Inihibitory Concentration) PAGEREF _Toc417219951 h 253-9 شمارشومحاسبهکلنیباکتری PAGEREF _Toc417219952 h 253 –10 کشتقارچی PAGEREF _Toc417219953 h 263-11عصارهالکلیغلیظشده PAGEREF _Toc417219955 h 26کلیهجدولونمودارهابانرمافزارMicrosoft Office Excel 2007طراحیورسمشدهاند. PAGEREF _Toc417219956 h 26فصلچهارم : نتایج4-2 خاصیتباکتریواستاتیکیوباکتریوسیدالیعصارهاسفنجCallyslpongiasp. PAGEREF _Toc417219959 h 294-3 بررسیقطرهالهعدمرشدباکتریبراثرتلقیحعصارهاسفنج Callyslpongia spدرمحیطکشتمیکروبی PAGEREF _Toc417219960 h 314-4 کدورتسنجیمحیطکشتدررقتهایمتفاوت PAGEREF _Toc417219961 h 324-5شمارشباکتریهایزنده PAGEREF _Toc417219962 h 334-6 نمودارمقایسهحداکثرقطرهالههایممانعتازرشدمیکروبیعصارهاسفنجدریایی. Callyslpongia sp PAGEREF _Toc417219963 h 344-7 غلیظسازیعصارهالکلیاسفنجدریاییsp.Callyslpongia PAGEREF _Toc417219964 h 354-8بررسیاثرضدقارچیعصارهاسفنجCallyslpongia sp. PAGEREF _Toc417219965 h 38فصلپنجم : بحثونتیجهگیری5-1 شناساییمولکولیگونهاسفنجCallyslpongia sp PAGEREF _Toc417219968 h 405-2 قطرهالهممانعتازرشدعصارهاسفنجCallyslpongiasp. PAGEREF _Toc417219969 h 405-3 (MIC( Minimum Inihibitory Concentration و(Minimum Bacteria Concentration)MBC PAGEREF _Toc417219970 h 405-4عصارهالکلیغلیظشده PAGEREF _Toc417219971 h 415-5 نتیجهگیریکلی PAGEREF _Toc417219972 h 425-6 پیشنهادات PAGEREF _Toc417219973 h 43منابعومآخذ PAGEREF _Toc417219974 h 44
فهرست جداول
عنوان صفحه
TOC o "1-1" h z t "جدول;1" جدول 2-1ترکیباتفعالزیستیودرصدفراوانیآنهادرعصارهاسفنجدریاییZygomycale sp. PAGEREF _Toc417220080 h 10جدول 4-1 قطرهالهعدمرشدمیکروبباتلقیحعصارههایمتفاوتاسفنجCallyslpongia sp. برحسبمیلیمتر PAGEREF _Toc417220081 h 32جدول 4-2 مقدارجذبنوریدرمحیطکشت PAGEREF _Toc417220082 h 33جدول 4-3 شمارشمیکروبیبهروشمحاسبهاستاندار PAGEREF _Toc417220083 h 34جدول4-4 جذبنوریعصارهA1غلیظشدهاسفنجدریاییsp.Callyslpongia PAGEREF _Toc417220084 h 36جدول 4-5 عصارهA2غلیظشدهاسفنجدریاییsp.Callyslpongia PAGEREF _Toc417220085 h 36جدول4-6 عصارهA3غلیظشدهاسفنجدریاییsp.Callyslpongia PAGEREF _Toc417220086 h 36
فهرست تصویر و نمودارها
عنوان صفحه
TOC o "1-1" h z t "اشکال;1"تصویر 3-1 محلنمونهبرداری PAGEREF _Toc417220140 h 13تصویر3-2 اسفنجدریاییCallyslpongia sp. ازجزیرههرمزخلیجفارس PAGEREF _Toc417220141 h 14تصویر 3-3 اسفنجخیسشدهدرحلالوفازمیانیایجادشده PAGEREF _Toc417220142 h 15تصویر3-4 محلولعصارهگیریبعدازفیلترکردنباکاغذصافیواتمنشماره 1 PAGEREF _Toc417220143 h 15تصویر 3-5 دستگاهروتاریHeidolph مدلLaboreta 4011digital PAGEREF _Toc417220144 h 15تصویر3-6 عصارهاسفنچبعدازتبخیرحلالبااستفادهازدستگاهروتاری PAGEREF _Toc417220146 h 16تصویر3-7محیطکشتاستافیلوکوکوساورئوس PAGEREF _Toc417220147 h 17تصویر 3-8 محیطکشتاشریشاکلای PAGEREF _Toc417220148 h 17تصویر 3-9 محیطکشتشیگلا PAGEREF _Toc417220149 h 17تصویر 3-10 اسفنجپودرشدهبااستفادهازنیتروژنمایع PAGEREF _Toc417220150 h 19تصویر 3-11 مقایسهمحلولهایمیکروبی 5/0 مکفارلندوکلریدباریم PAGEREF _Toc417220151 h 22تصویر3-12رقتهایمختلفعصارهاسفنجCallyslpongia sp. PAGEREF _Toc417220152 h 24تصویر 3-13 دستگاهاسپکتروفتومتریمدلUnico uv-1200 PAGEREF _Toc417220153 h 24تصویر3-14کلنیهایایجادشدهدرمحیطکشتمیکروبی PAGEREF _Toc417220154 h 26تصویرشماره 4-1مارکرco1 PAGEREF _Toc417220155 h 28تصویرشماره4-2 محدودهیباندهایPCR PAGEREF _Toc417220156 h 28تصویر 4-3خاصیتباکتریواستاتیکیعصارهE بر S.aureus PAGEREF _Toc417220157 h 29تصویر 4-4 خاصیتباکتریوسیدیعصارهالکلیبرمیکروبShiglla sp. PAGEREF _Toc417220158 h 29تصویر 4-5 خاصیتباکتریوسیدیعصارهالکلیبرمیکروبE.coli PAGEREF _Toc417220159 h 30تصویر 4-6 محیطکشتCandida albicanc PAGEREF _Toc417220161 h 30تصویر 4-7 محیطکشتPinicillum sp. PAGEREF _Toc417220162 h 30تصویر 4-8 محیطکشتAspergillus PAGEREF _Toc417220163 h 31نمودار4-1 حداکثرقطرهالهممانعتازرشدمیکروبیعصارهاسفنجCallyslpongia sp. PAGEREF _Toc417220165 h 35نمودار 4-2 مقدار MICباکتریاشریشاکلای PAGEREF _Toc417220167 h 37نمودار 4-3 مقدار MICباکتریشیگلا PAGEREF _Toc417220168 h 37نمودار 4-4 مقدارMICباکتریاستافیلوکوکوساورئوس PAGEREF _Toc417220169 h 38
فصل اولمقدمه و کلیات
-18859546228000
1-1 مقدمه1-2 معرفی اسفنجاسفنج های دریایی متعلق به سلسله یAnimaliشاخه ی Porifera زیر شاخه ی Celdulariaکه دارای ردههایCaleareaوGlassspongeوDemospongiaeمی باشندتا کنون بیش از هشت تا ده هزار گونه اسفنج دریایی شناسایی شده اند (Dhinakaranand Lipton, 2012).
اسفنج ها جانوران پرسلولی بدون ریشه متصل به بستر دریاها و فاقد لایه یا اندامک بافتی هستندآنهاجانورانی هستند که در محیط های دریایی از قطبی تا معتدل و استوایی یافت می شوند البته در نواحی قطبی در صخره های مرجانی فراوان تر می باشند. این موجودات با فیلتر کردن آب دریا از باکتری و میکروارگانیسم های دریایی تغذیه میکنند همچنین برخی از میکروارگانیسم ها با اسفنج زندگی همزیستی دارندو تا 40 درصد زیست توده ی اسفنج را در بر می گیرند که ممکن است تراکم آنهابه بیش از 2تا 3 برابر تعداد باکتری هایی که در حجم مشخصی از آب دریاموجود باشند برسند.اسفنج ها حجم زیادی از آب را با روند صافی خواری از سیستم عروقی وکانالی منحصر به فردخود پمپ می کننداز طریق فاگوسیتوز باکتریو مواد مغذی را از ستون آب جذب می کنند.از آنجایی که آب دریا به طور متوسط محتوی 1تا 5×106باکتری در میلی لیتر می باشد، مشکلات گرفتگی منافذ سیستم کانالی، فرم های بیوفیلم و فولینگ بر سطح اسفنج وجود ندارند(Thakur et al., 2003).
اسفنج ها مرفولوژیک و مکانیسم دفاع سلولی خاص ندارند و کمتر با میکروب بیماریزا آلوده می شوند (Newbold et al., 1999 ) به همین دلیل موفق ترین جانوران بنتیک از 800 میلیون سال پیش تاکنون می باشند (Dhinakaran and Lipton,2012).
1-3 اسفنج و میکروارگانیسم های همزیست اسفنج ها میزبان تعداد زیادی از 26 شاخه باکتری کشف شده در مطالعات اخیر می باشند.میکروب هامی توانند 50 تا 60 در صد زیست توده اسفنج میزبان را در اختیار گیرند و از این طریق در به دست آوردن مواد غذایی،سوخت وساز،تثبیت اسکلت اسفنج،پردازش مواد زاید و تولید متابولیست ثانویه نقش مهمی راایفا کنند. شواهد اخیر نشان داده اند که مواد فعال زیستی نتیجه تعامل مشترک بین اسفنج و میکروارگانیسم همزیست آنها می باشند(Zeng et al., 2013). باکتری هایی که بر سطح اسفنج ها زندگی می کنند از لحاظ دسترسی به مواد غذایی و محیط زندگی با هم در رقابت هستند. تولید متابولیت های ثانویه بوسیله ی باکتری های همزیست اسفنج بیشتر از تولیدباکتری های پلانکتونی است.چندین ترکیب با خواص درمانی مشخص و بالقوه از اسفنج ها بدست آمده که شباهت قابلتوجهی با متابولیت های میکروارگانیسم های مرتبط با آنها دارند از این رو باکتری های همزیست اسفنج یک منبع بسیار فعال برای تولید آنتی بیوتیک ها محسوب می شوند (Devi et al., 2010 ).
1-4 اهمیت کاربرد ارگانیسم های دریایی افزایش کاربردآنتی بیوتیک های خاص در پزشکی،دامپزشکی،کشاورزی، وجود مشکلات فراوان در بیماری های مشترک انسان و دام،مقاومت استافیلوکوکوس اورئوس به متی سیلین(MRSA)، مقاومت استافیلوکوکوس پنومونیه به پنی سیلین،مقاومت انتروکوکوس و مایکوباکتریوم توبرکلوزیس به وانکومایسین وهمچنین باکتری هایی عامل عفونیت بیمارستانی که حداقل 70 درصد از آنها به یکی از داروها ی درمانی مقاوم می باشند.از این رو در حال حاضر بیش از هر زمان دیگر نیاز به یافتن کلاس های جدید آنتی بیوتیکی جهت مبارزه با مقاومت دارویی (MDR)سویه های خاص با هدف منابع درمانی دریایی مورد توجه قرار گرفته است (Devi et al., 2010).
آلودگی های قارچی شیوع جهانی پیدا کرده و آمار مرگ و میر بالاییداشته است.برخی مطالعات نشان داده که مصرف داروهای ضد قارچی و ضد ویروسی توانایی سیستم ایمنی بدن را کاهش دادهو نیزمصرف داروهای ضد قارچی به دلیل اثرات جانبی محدوده شده اند. با وجود مقاوم شدن سویه های قارچی به تریازول(Triazol) بایستی ترکیبات جدیدتر و قوی تری جهت مهار رشد قارچ های بیماریزا و البته بدون اثرات جانبی استخراج شوند.(Joseph and Sujatha, 2011)
ارگانسیم های دریایی منابع غنی از متابولیت های ثانویه هستند ساختار ترکیبات جدید شیمیایی و فعالیت بیولوژیکی منحصر به فرد دارند. تاکنون افزون بر 15000 ترکیب مختلف از موجودات دریایی استخراج شده (Dhinakaran and Lipton, 2012)که بیش از 5000 نوع ترکیب و 800 آنتی بیوتیک جدید از 500 گونه ی اسفنج دریایی کشف شده است (Darah et al., 2011).
1-5اسفنج های دریایی منابع غنی از ترکیبات فعال زیستیازآنجایی که اسفنج ها دارای سیستم دفاعی کمی هستندو از نظر اکولوژی شیمیایی جهت دفع حیوان مهاجم توسعه ی کمی یافته است جهت بقاء گونه ی خود به توانایی آنها برای مقابله و تضعیف موجودات مزاحم زیستی ، مهار میکروب های بیماری زا و ارگانیسم های آلوده کننده ی دیگر بستگی دارد. (Newboldetal., 1999).
تحقیقات نشان داده که متابولیت های ثانویه ی اسفنج احتمالا نقش مهمی در دفاع اسفنج علیه برخی خطرات زیستی دارند (Newbold et al.,1999).درنتایج تحقیق دیگر بیان شده که تولید متابولیت های ثانویه اسفنج در حفظ زیست محیطی آنها در برابر مهاجمان،شکارچیان و دیگر رقبا نقش تعیین کننده ایدارند(Devi et al., 2010).در واقع اسفنج ها بیشترین تولید کننده ی ترکیبات جدید هستند که هر ساله بیش از 200 متابولیت از آن ها گزارش می شود علاوه بر این بیشتر ترکیبات مشتق شده از اسفنج مانندترکیبات ضد سرطانی و ضد التهابی در آزمایش های بالینی و پیش بالینی (Jonson et al.,2012). از رده ی Demospongiae می باشد (Dhinakaran and Lipton et al.,2012).
1-6 تنوع متابولیت های ثانویه اسفنج دریایی طیف وسیع متابولیت های ثانویه ازجمله مشتقات آمینواسیدها،نوکلئوزیدها، ماکرولیدها، پورفیرین ها، ترپنوئیدها، آلیفاتیک ها، اسیدپراکسیدها استرول ها، مواد زیست فعال استخراج شده ازاسفنج دریایی بوده و مشتقات ترپن ها،استرول ها،پپتیدهایحلقوی،آلکالوئیدها،اسیدهایچرب، پروکسیدهاوآمینواسیدها (اکثرأ هالوژنی می باشند ) از میکروارگانیسم های همزیست با اسفنج دریایی استخراج شده (Joseph and Sujatha, 2011 ) که در مواردخاص مربوط به بیوتکنولوژی مواد دارویی (با خاصیت ضدسرطانی،ضد باکتریایی،ضد قارچی،ضد ویروسی،ضدالتهابی)گسترش فراوانی یافته اند(Johnson et al., 2012).1-7نقش ترکیبات طبیعی دریایی در زندگی انساندر حال حاضر ترکیبات طبیعی نقش بسیار زیادی در علوم پزشکی و دارویی ایفا می کنند. در این میان ترکیبات طبیعی با منشاء دریایی در سال های اخیر بسیار حائز اهمیت می باشند. به نظر می رسد وجود ترکیباتی با ساختار استروژنی و اتم های هیدروژن دار (به دلیل محیط زیست جاندران دریایی در آب چنین ساختارهایی شکل می گیرند) این ویژگی آن ها را از سایر ترکیبات طبیعی متمایز می نماید(خاکشور و همکاران، 1391) .
شروع اولین مطالعات دارویی اسفنج ها سال 1950 با استخراج نوکلئوزیدهای spongothymidine وspongouridine از اسفنج دریاییCryptoethya crypta بوده که این نوکلئوزیدها پایه سنتز اولین عاملهای ضد سرطانی دریایی Ara-Cو ضد ویروسیAra-Aبوده اند. Ara-C برای درمان بیماری های لوسمی و لنفومی انسان کاربرد بالینی پیدا دارند (Dhinakaran and Lipton, 2102).
Nigrelli و همکاران در سال 1959 اولین گزارش عصاره ضد میکروبی اسفنج را ارائه کردند. بعداز آن شمار زیادی از گزارشات در زمینه استخراج عصاره ضد میکروبی از اسفنج دریایی به دست آمد امادراین میان بررسی هایی در مورد میکروارگانیسم های بیماری زای انسانوجود نداشته است (Newbold et al.,1999).
به دلیل افزایش بیماری های خطرناک از قبیل سل،ایدز،مالاریا و سرطان ها ایده ی کشف مواد جدید از موجودات دریایی و به طور خاص اسفنج ها اوج گرفت(Dhinakaran and Lipton, 2012).
1-8 متابولیت های فعال زیستی اسفنج دریایی با خواص دارویی1-8-1 متابولیت های اسفنج دریایی با خواص ضد پاتوژنی تحقیقات نشان داده استعصاره ی اسفنجHalicloa exigusعلیه قارچ هایAspergillus, Candida albicans , Cryptococcus neofromans, fumigatesوCandida
parapsiloisاثر ضد قارچی، عصاره ی اسفنج هایAmphimedon viridi وNeopetrosia sp.اثرضد لشمانیایی ،عصاره ی اسفنج هایChondrosia reticulate ,Halichondria sp.
وAxinyssa sp. خاصیت ضد سل،عصاره ی اسفنج Phakelliaventilabrum خاصیت ضد مالاریایی، عصاره ی اسفنجTopsentia sp.خاصیت قوی همولیتیک کننده اریتروسیت های خون تازه ی خوک و عصاره ی اسفنج Myrmekioderma styxخاصیت بارز هموگلوتینه کردن را داشته اند (Dhinakaran and Lipton,2012).
״Bugniو همکاران در سال 2004،همچنین Lu و همکاران در سال 2007از اسفنج Acanthella cavernosa در فلیپین یک سریKalihinol استخراج کردند که توانایی مهار باکتری سنتز کننده ی فولات (فولیک اسید) را دارند.( Joseph andSujatha, 2011)״
1-8-2 متابولیت های اسفنج دریایی با خواص ضد سرطانیدر سازمان ملی سرطان NCI (National Standards Institute)بیش از 90 ترکیب سیتوتوکسیک ضد تومور جدیدجهت بررسی اثر مثبت در بخش سلول های توموری بر حیوانات آزمایشگاهی مورد توجه قرار گرفت. مشکل بزرگ تولید داروها از موجودات دریایی جداسازی و خالص سازی خیلی اندک ماده زیست فعال طبیعی می باشد (Joseph and .Sujatha, 2011).
״ TuckerوAnil در سال2000 به اثر ضدباکتری باکتری های همزیست اسفنج Ircinia ramoseاشارهداشتند که اهمیت ضد توموری دارد و در مدل های پیش بالینی بر دامنه عظیم سل لاین ها موثر بوده است (Joseph and Sujatha, 2011)״.
1-8-3 متابولیت های اسفنج دریایی با خواص آنتی بیوتیکی اسفنج دریاییAplysina caissara متعلق به راسته یVerongidaدارای ترکیباتFistyralin-3 و 11-hydoxyaerothioninمی باشد که علیهE.coli و P.aeruginosa فعالیت متوسط آنتی بیوتیکی دارند.اسفنجIrciniasp. دارای مولکول هایی است که از نظر زیستی فعال هستند و نشان دهنده ویژگی های آنتی بیوتیکی قوی،ضد درد و ضد التهابی می باشند (Dhinakaran and Lipton,2012).
اسفنجAplysina cavernicola دارای ترکیباتAeroplysinin , aerthionin , و دیگر مشتقات دی برمو و دی کلروتیروزین است که دارای برخی فعالیت آنتی بیوتیکی علیهB.subtilis , P. vulgaris می باشد.از اسفنجSuberites domuncula یک لکتینKDa 27 خالص سازی شد که اثر ضد باکتری علیهE.coli و Staphlococcus aureusرا نشان داده است (Dhinakaran and Lipton,2012).
1-9 ترکیبات فعال زیستی اسفنج دریایی در مرحله کاربردبالینیپتانسیل برخی داروهای زیستی از تولیدات طبیعی مورد توجه بخش داروشناسی قرار گرفته اند که کاربرد های متنوع دارند.برای مثال نوکلوئید آرابینوز از اسفنج Cryptotethya crypta اثرضد ویروسی و ضدسرطانی داردو کاربرد بالینی نیز پیداکرده است. از اسفنج Luffariella variabilis مانوآلدئیدی بدست آمده که خاصیت ضدالتهابیدارد (Joseph and Sujatha, .2011).
بسیاری داروهای دریایی از تولیدات طبیعی بی مهرگان دریایی، بطور غالب ازاسفنج ها در مراحل پایانی آزمایش های بالینی یا در مرحله ی تجاری شدن می باشند برخی از این داروها)Ara-A ضد ویروس(،Ara-C )ضد سرطان(، مونوآلدئید(مهار کننده ی فسفولیپازA2 ) وارد بازار شده اند و IPL51602 (ضدالتهابی)،KRN7000(ضدسرطان)، LAF389(ضدسرطان)، HTI286(ضدسرطان)،Discodermlide (ضدسرطان) در مراحل آزمایش بالینی قرار گرفته اند(Joseph and Sujatha, 2011).
1-10اهمیت مسئلهبا توجه به افزایش مقاومت پاتوژن های بیماری زای انسانی امروزه تحقیقات در زمینه ی اثرات عصاره ی اسفنج های دریایی در زمینه ضد سرطانی،ضدمالاریایی،ضد التهابی،ضدمیکروبی،ضد قارچی،ضدسل ،ضدایدز و ... در سراسر جهان به منظور استخراج مواد زیست فعال به عنوان داروی هایی با منشا زیستی ضروری می باشد.
1-11اهداف تحقیق:بررسی پتانسیل ترکیب زیست فعال اسفنج های خلیج فارس
استخراج عصاره ضد میکروبی از اسفنج های خلیج فارس
بررسی اثر عصاره استخراج شده بر پاتوژن های انسانی
سنجش حداقل غلظت مهار کنندگیMIC(Minimum inhibitory concentration) و حداقل غلظت باکتریایی MIB(Minimum concentration bacteria )فصل دوممروری بر پیشینه ی پژوهش2-1خاصیت ضد میکروبی باکتری های همزیست اسفنج دریاییNewbold و همکاران در سال 1999عصاره 33 گونه اسفنج دریایی را جهت بررسی اثر ضد میکروبی آنها علیه میکروب های دریایی استخراج کرده که 48% از آنها حداقل بر یک باکتری اثر مهار کنندگی رشد را نشان دادند(Newbold et al., 1999).
2-2 خاصیت ضد باکتری عصاره اسفنج دریاییSaid و همکاران در سال 2010 از میان 18 عصاره اسفنج دریایی بررسی شده جهت سنجش اثر ضد میکروبی، 12عصاره(66.7%) نشان دهنده فعالیت ضد میکروبی بر یک یا چند میکروب از درجه مقیاس تاثیر ضعیف تا قوی بودند.وی قطر ناحیه مهارکنندگی 6 تا 10 میلی متر را ضعیف و قطر 11تا 20 میلی متر را خوب و بیشتر از 20 میلی متر را قوی در نظر گرفت. طبق مشاهدات وی عصاره ی اتیل استات از اسفنج گونه هایHalichondrida sp و Oceanopia spبر مخمر Candidaalbicans اثر مهار کنندگی خوب را نشان دادند .
عصاره اتیل استات اسفنج گونه های .Oceanopia sp،Agelas mauritaniaHymeneciadon sp. وعصاره ی هگزانTedaniasp.بر قارچCryptococcus neoformans نشان دهنده اثر خوب تا قوی می باشد .
عصاره یHalichondria spبر باکتری Bacillus anthracisاثر قوی و برProteus mirabilis وStaphlococcus aureusاثر خوب را نشان داد. عصاره اتیل استات Oceanopia sp. بر Bacillus anthracis ، Proteus Mirabilis، S. aureus وShigella dysentriae اثر مهار کنندگی خوب را نشان داد.در میان 18 عصاره مطالعه شده 6عصاره (33.3%) هیچ اثر ضد باکتری یا ضد قارچی نداشته اند و شامل عصاره اتیل استات اسفنج دو گونه ی .Cliona sp،یک گونه ازHalichondria sp.،یک گونه ازPseudoceratina clavata و یک گونه از Suberites sp.و همچنین عصاره ی هگزانی .Myxillina sp می باشند(Said et al., 2010).
2-3 عصاره متانولی ضدباکتریایی و ضد قارچی اسفنج Haliclona sp.Darah وهمکاران در سال 2011 نمونه ی اسفنجHaliclona sp.از سواحل مالزی را خشک کرده و عصاره متانولی آن را تهیه نموده بر کشت های میکروبی باکتری گرم مثبتMRSA (استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متی سیلین)، گرم منفی، قارچ هاو مخمرهایC.albicans وutillisC.آزمایش کردند. عصاره متانولی برB.cereus, B.,A.anitratus ,ErwiniaspB.subtilis,spizizenii.و MRSA موثر بوده در حالی قارچ ها و مخمر های دیگر هیج نوع حساسیت به این عصاره نداشته اند.
2-4 عصاره متانولی ضدباکتریایی و ضد قارچی اسفنج Sigmadocia pumila ایساک و لیپتون در سال 2012 با تهیه عصاره متانولیاسفنجSigmadocia pumila سواحل هند و سنجش آن بر میکروب های بیماری زای انسان از جمله باکتری های گرم منفیE.coli ,K pneumonia,P. putida ,S. liquefaciene اثر مهار کنندگی رشد را نشان داد در حالی که بر باکتری های گرم مثبت جز S. aureus بر سویه های دیگر بی اثر بود .(Isaac and Lipton, 2012)
2-5 عصاره متانولی ضدباکتریایی و ضد قارچی اسفنج Zygomycale sp.Manjusha و همکاران (2012) عصاره متانولی اسفنج دریاییZygomycale sp. تهیه و بر چند سویه باکتری و قارچ بیماری زای انسانی بررسی کرده اند، این عصاره اثر ضدباکتری علیه باسیلوس مگاتوریوم،کلیبسلا پنومونیه ،استرپتوکوکوس پیوژنز و اثر ضد قارچی علیه Rhizomucor miehei، کاندیدا آلبیکنس،آسپیرژیلوس نیجر و آسپیرژیلوسفمگاتوس را نشان داد،عصاره ای اسفنج بر باکتری گرم مثبت 77%، گرم منفی35% و بر مخمر %32 اثر مهار کنندگی دارد،با تجزیه و تحلیل عصاره بوسیله کروموتوگرافی GC-MS طیف گسترده ای از مواد شیمیایی با عملکرد متنوع در میان مواد زیست فعال شناسایی شده که تنوع پلی کیتیدها،آلکالوئیدها ،اسیدهای چرب ، پپتیدها و ترپنوئیدها بیشتر بوده که دارای اثر ضدمیکروبی، ضد سرطانی و ضد توموری می باشند.
جدول 2-1ترکیبات فعال زیستی و در صد فراوانی آن هادرعصارهاسفنج در یایی Zygomycale sp.
(Manjusha et.al.,2012)
2-6 بررسی اثر ضد قارچی چهارنوع عصاره از نه گونه اسفنج دریاییPalpandi و همکاران )2013( نه گونه اسفنج دریایی از آبهای ساحلی جنوب شرقی هند را جهت بررسی اثر ضد قارچی عصاره آنها جمع آوری کرده سپس عصاره هایی با حلال های متفاوت از جمله عصاره اتانولی ، متانولی، استون و کلروفرمی به دست آوردند و علیه 9 سویه قارچ بیماریزا انسانی بررسیکرده،نتیجه بررسی آنها 4گونه اسفنج از رده یKeratosida(Psammaplysilla, spongia officinalis Var.ceylonesis, Hyattella cribriformis,purpurea, Dysiclea fragilis) نسبت به اثر ضد قارچی عصاره کلروفرمی می توان در تهیه داروهای منحصر به فرد از آنها استفاده کرد، این رده اسفنج بر قارچ هایC.albicans, A.niger, A.fumigatus, A.flavus موثربوده اند. Palpandi وهمکاران ذکر کردند که عصاره های متانولی و استونی در این تحقیق اثر ضد قارچی ندارند.
2-7 خواص ضد باکتریایی عصاره اسفنج Axinella sinoxea از جزیره لارک خلیج فارسدر تحقیق ناظمی و همکاران در سال 1390 عصاره ها یی از اسفنج دریاییAxinella sinoxeaدر غلظت های متفاوتی مورد آزمایش مهار کنندگی رشد باکتریایی قرار گرفت که حداقل غلظت مهار رشد عصاره دی اتیل اتری برای E.coli برابر10 میلی گرم بر میلی لیتر و عصاره متانولی 40 میلی گرم بر میلی لیتر می باشد و عصاره آبی بی اثر بود. عصاره متانولی ،دی اتیل اتری و آبی بر باکتری aeruginosaP. بی اثر بوده و توانایی مهار رشد باکتری را نداشته اند حداقل غلظت مهار رشد باکتری عصاره دی اتیل اتری بر باکتری B.subtilisبرابر 20 و عصاره متانولی 40 میلی گرم بر میلی لیتر گزارش شدعصاره آبی بر این باکتری نیز بی اثر است و حداقل غلظت مهار رشد عصاره دی اتیل اتر بر باکتری S.aureus برابر 075/0و عصاره متانولی 10 میلی گرم بر میلی لیتر و عصاره آبی بی تاثیر گزارش شد.
فصل سوممواد و روش ها-38735714375003-1نمونه برداریدر مهر ماه 1393نمونه برداری یک گونه اسفنج دریایی با روش SCUBA از اعماق 15 تا 20 متری جزیره هرمز انجام شد(تصویر شماره3-1). طبق گفته غواصان این اسفنج بر سازه کشتی قدیمی غرق شدهقرار داشت(تصویر شماره3-2).نمونه هادر محل با آب دریا شسته شده تا رسوبات و گل ولای آنها تمیز شود سپس مقداری از نمونه ها درالکل 100% (Palpandi et al., 2013)و مقداری نیز در هوای اتاق و دور از تابش نور مستقیم خورشید جهت خشک شدن قرار گرفتندDarah et al., 2011)( بخشی از نمونه در ازت مایع به آزمایشگاه منتقل شدند(Zeng et al.,2013 ).

تصویر 3-1 محل نمونه برداریدر تصویر فوق محل نمونه برداری با نشانک قرمز رنگنشان داده شده است.

تصویر3-2 اسفنج دریاییCallyslpongia sp. از جزیره هرمز خلیج فارس3-2 تهیه عصاره اسفنج دریایی3-2-1 تهیه عصاره اسفنج خشک شدهنمونه اسفنج خشک شده را با اسکالپل به قطعات ریز درآورده در ظرف شیشه ای درب دار ریخته و نسبت حجم1 : 1 از حلال ها را روی آن ریخته (حجم 20میلی لیتر متانول و 20 میلی لیتر دی کلرومتان ) درب بطری را محکم بسته و به مدت 24 ساعت در محلی تاریک و دور از گرما قرار دادهDarah et al., 2011)(،بعد از24 ساعت محلول یک فاز شیری رنگ در وسط و دو فاز کاملا شفاف بالا و پایین آنایجاد کرده(تصویرشماره 3-3).بطری را چند مرتبه به آرامی هم زده سپس قطعات اسفنج را فشرده از بطری خارج کرده و جهت حذف رسوبات اضافی محلول را با استفاده کاغذ صافی واتمن شماره 1 فیلتر کرده حلال اضافیمحلول بدست آمده (تصویر شماره 3-4)را با استفاده از دستگاه روتاری Heidolph مدل Laboreta 4011digital (تصویر شماره 3-5) با تنظیم دمای 40 درجه سانتی گراد، چرخش 100 دور در دقیقه و ایجاد شرایط خلاء حذف کرده، حجم نهایی عصاره 15میلی لیتر بدست آمد با حرف لاتین D نام گذاری شده(تصویر شماره 3-6) بعد از رسیدن دمای عصاره به دمای محیط در دمای 4 درجه سانتی گراد جهت آزمایشات بعدی نگهداری شد.

تصویر 3-3 اسفنج خیس شده در حلال و فاز میانی ایجاد شده
تصویر3-4 محلول عصاره گیری بعد از فیلتر کردن با کاغذ صافی واتمن شماره 1
تصویر 3-5 دستگاه روتاری Heidolph مدل Laboreta 4011digitalتصویر3-6 عصاره اسفنچ بعد از تبخیر حلال با استفاده از دستگاه روتاری3-3-2 تهیه عصاره الکلیاسفنجنمونه اسفنجی را که در الکل نگهداری شده بود از الکل خارج کرده در محیط آزمایشگاه برکاغذ صافی تمیز قرار داده تا الکل آن تبخیر شود سپس چندین مرتبه با سرم فیزیولوژی استریل شستشو داده و دوباره تا خشک شدن آن صبر کرده اسفنج را به قطعات ریزی در آورده در بطری شیشه ای درب دار قرار داده سپس نسبت حجم 1 : 1 از حلال ها را روی آن ریخته (حجم 15 میلی لیتر متانول و 15 میلی لیتر دی کلرومتان برای 50 گرم اسفنج بعد از تبخیر الکل) درب بطری را محکم بسته و به مدت 24 ساعت در محلی تاریک دور از گرما قرار داده بعد از گذشت 24ساعت سه فاز حلال بدست آمده بود بطری را چند مرتبه به آرامی هم زده و سپس قطعات اسفنج را فشرده و از بطری خارج می کنیم محلول را جهت حذف رسوبات اضافی با استفاده از کاغذ صافی شماره 1 واتمن فیلتر کرده محلول بدست آمده با استفاده از دستگاه روتاریحلال اضافیرا حذف کرده10 میلی لیتر حجم نهایی عصاره بدست آمدهبا حرف لاتین E نام گذاری شد. عصاره بدست آمده در دمای 4 درجه سانتی گراد نگهداری شد(Palpandi et al., 2012).
3-2-3تهیه عصاره اسفنج منجمد
اسفنج منجمد در فریز 80- روی کاغذ صافی تمیز قرار داده تا یخ آن ذوب شود سپس با سرم فیزیولوژی استریل شسته دوباره تا خشک شدن آب آن صبر کرده اسفنج را به قطعات ریز در آورده و نسبت حجم 1:1 حلال (Newbold et al., 1999) روی آن ریخته و مانند مراحل بند فوق ادامه می دهیم
3-3 تهیه میکروب و قارچ های بیماری زای انسان جهت انجام این پروژه سعی شده از میکروب و قارچ های بیماری زای انسان استفاده گردد، میکروب ها از آزمایشگاه میکروبیولوژی بیمارستان ولی عصر خرمشهر شاملباکتری گرم منفی اشریشاکلای، باکتری های گرم مثبت استافیلوکوک اورئوس، گونه شیگلا (تصاویر 3-7،3 -8 و3-9) بوده است. نمونه های قارچ از بخش قارچ شناسی دانشگاه جندی شاپور اهوازشامل آسپرژیلوس فلاوئوس،پنی سیلیوم و مخمر کاندیدا آلبیکنستهیه گردید.
3422651017270
تصویر3-7محیط کشت استافیلوکوکوس اورئوس12852401945640تصویر 3-8 محیط کشت اشریشاکلای00تصویر 3-8 محیط کشت اشریشاکلای-1819275859155تصویر 3-9 محیط کشت شیگلا00تصویر 3-9 محیط کشت شیگلا
3-4کشت میکروب و قارچبعداز انتقال میکروب و قارچ ها به آزمایشگاه میکروبیولوژی دانشگاه در محیط کشت تازه (میکروب در نوترینت آگار و قارچ در ساب دکستروزآگار)کشت داده شدند.دمای انکوباتور جهت رشد میکروب 37 درجه سانتی گراد به مدت 24 تا 48 ساعت و برای قارچ 30درجه سانتی گرادبه مدت 24تا 72 ساعت می باشد (Darah et al., 2011).
3-5 استخراج DNAو شناسایی مولکولی اسفنج گونه callyspongia sp.3-5-1 استخراجDNAمقدار 80 تا 100 گرم ازنمونه اسفنجی که در الکل نگهداری شده بود را بر فویل آلومینیومی استریل قرار داده بعداز تبخیر الکل آن در هاون چینی آزمایشگاهی استریل با کمی نیتروژن مایع پودر کرده (تصویر شماره 3-10 )سپس پودر اسفنج را در میکروتیوب ریخته مقدار 630 میکرولیتر محلول1%CTAB(در دمای 60 درجه سانتی گراد بن ماری گرم شده)بر آن ریختهسپس 70 میکرولیتر2%SDS (pH برابر8)و5تا7 میکرولیتر پروتئیناز Kبه آن افزودهوبه مدت یک شب در بن ماری 55 درجه سانتی گراد قرار داده شد.درمرحله بعدی استخراج DNA میکروتیوب ها را از بن ماری خارج کرده 240 میکرولیتر محلول نمک طعام 5/1 مولار، 2 میکرولیتر بتا کاپتواتانول(Kennedy et al., 2008)به آن اضافه کرده و برای تسهیل لیز شدن بافت اسفنجی میکروتیوب ها را در بن ماری 37 درجه سانتی گراد به مدت 15 دقیقه گذاشته، در مرحله بعد 250 میکرولیتر کلروفورم (زیر هود اضافه می شود) اضافه کرده و15 دقیقه در 12000 دور و دمای 4 درجه سانتی گراد سانتریفیوژمی شوند et al.,2008). (Kennedy.

تصویر 3-10 اسفنج پودر شده با استفاده از نیتروژن مایعدر مرحله بعد فاز بالایی را به آرامی با سمپلر استریل جدا کردهدر میکروتیوب جدید ریخته و 700 ماکرولیتر ایزوپروپانول (از قبل در فریز بوده است) اضافه کرده به آرامی میکرو تیوب ها را سر و ته کرده و مجددا در 12000 دور دمای 4 درجه سانتی گراد به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ کرده رسوب سفید رنگ ته نشین شده توده DNA می باشد.ایزوپروپانول را به آرامی ریخته، در هوای اتاق 3 تا 4 دقیقه قرار داده سپس مقدار 500 ماکرولیتر الکل 70 درصد با 8000دور، دمای 4 درجه سانتی گرادبه مدت 5 دقیقه سانتریفیوژکردهفاز رویی را خالی کرده و برای تبخیر الکل به مدت 30 دقیقه میکروتیوب را در مکان تمیز در آزمایشگاه قرار داده سپس 50 تا 100 میکرولیتر آب مقطر استریل درون میکروتیوب ریخته و در یخچال نگهداری شد (Kennedy et al.,2008).
3-5-2 بررسی کیفیتDNAجهت اطمینان از بدست آمدنDNA مطلوب محلول نهایی فوق از ژل آگاروزراناستفاده کردهبه این صورت که 3/0 گرم آگاروز را با 30 میلی لیتر محلول TE حل کرده،بعد از ژله ای شدن، DNA را با سمپلر استریل درون چاهک ها تزریق کرده سپسبا استفاده از دستگاه الکتروفوروز افقی با ولتاژ 75 به مدت 40 دقیقه این عمل انجام گرفت.
3-5-3 PCR مواد PCR عبارت اند ازµ5/0dNTPs ، بافرµ5/2(Tris،KCL ،pH 8/4 )، µ1MgCL2، پرایمرهاµ1،Taq DNA پلیمراز µ3/0و رشته های الگو Co1MT- µ1. دمای موثر در فرآیندPCR 50 درجه سانتی گراد بوده است (Kennedy et al.,2008). بعد از بارگذاریمحصول PCR بر ژل آگاروز مقدار باندهای بدست آمده را با استفاده از مارکر DNA Ladder1Kb –RTUمقایسه گردید)تصویر 3-13 ).
3-6سنجش میکروبی3-6-1آزمون حساسیت آنتی بیوتیک کربی بایرآزمون کربی بایر سنجش حساسیت باکتری نسبت به رقت های مختلف آنتی بیوتیک استبه این صورت که دیسک های آغشته به آنتی بیوتیک را بر محیط کشت باکتری قرار می دهند در اطراف دیسک باکتری رشد نمی کند قطراطراف دیسک را منطقه ی مهاری رشد می نامند. اندازه قطر این منطقه بستگی به میزان اثر آنتی بیوتیک بر رشد آن باکتری دارد.هرچه آنتی بیوتیک اثر قویتری داشته باشد منطقه مهاری بزرگتری ایجاد می گردد.غلظت آنتی بیوتیک با دور شدن از دیسک کمتر می شود در نتیجه مقدار کلنی ها نزدیک تر کمتر یا بدون هیچ کلنی می باشد از این برآورد برای میزان انتشار اثر آنتی بیوتیک استفاده می شود(Johnson et al.,2012).
مواد ضدباکتری به دو دسته موادباکتریواستاتیکی یا مهارگر باکتری و باکتریوسیدالی یا مواد کشندهباکتری تقسیم می شوند.باکتریواستاتیک به هر ماده ای که می تواند رشد باکتریها را متوقف واز تقسیم باکتری جلوگیری کند، باکتریوسیدال به موادی که قابلیت نابود سازی مستقیم باکتری را داشته باشد می گویند.
3-6-2 بررسی اثر ضد میکروبی عصاره اسفنج . Callyslpongia sp خشک شدهجهت سنجش اثر ضد میکروبی عصاره اسفنج، ابتدا محیط کشت مولر هینتون آگار تهیه شد سپس هریک از میکروب ها به روش خطی کشت داده شدند و مقدار 20 میکرولیتر از عصاره Dبر دیسک دیفیوژن بلانک 6 میلی متری ریخته با پنس استریل به آرامی روی محیط کشت درنقاط مختلف قرار داده، برای کنترل منفی از حلال هایی که عصاره از آن تهیه شده بود استفاده گردید و برای کنترل مثبت دیسک آنتی بیوگرام نیتروفلوستاتین و جنتامایسین به کار رفت.قطر هاله عدم رشد باکتریبا استفاده از خطکش میلی متری اندازه گیری شد (et al.,2011. Darah).
3-7-3بررسی اثر ضد میکروبی عصارهالکلی اسفنج Callyslpongia sp.کشت میکروب و کنترل منفی و مثبت مانند بندفوق) 3-6-2) انجام شد و قطر هاله ایجاد شده با استفاده از خط کش میلی متریاندازه گیری شد.
3-6-4بررسی اثر ضد میکروبی عصاره اسفنج منجمد شده Callyslpongia sp.کشت میکروب و کنترل منفی و مثبت مانند فوق) 3-6-2) انجام شد و قطر هاله ایجاد شدهبا استفاده از خط کش میلی متریاندازه گیری شد.
3-6-5(MinimumInihibitory Concentration)MICو )MBC(Minimum BacteriaConcentrationMIC(MinimumInihibitory Concentration)حداقل غلظت مهاری یا غلظتی از آنتی بیوتیک است که می تواند رشد باکتری را در شرایط آزمایشگاهی مهار کند(Subramani et al.,2013). در این تحقیق سه رقت از عصاره تهیه شد و هریک در محیط کشت مایع نوترینت براث بر میکروب ها تلقیح شد، بعد از 24 ساعت انکوباسیون کدورت محیطکشت ها با دستگاه اسپکتروفتومتری اندازه گیری شد.
MBC(Minimum BacteriaConcentration) حداقل غلظت باکتری یا حداقل تعداد کلنی باکتری می باشد.اگرهریک ازMIC بر محیط کشت مولر هینتون آگارکشت داده شود تعداد کلنی ایجاد شده را شمارش کرده مقدار MBC به دست خواهد آمد. نسبتMIC به MBC شاخص باکتریواستاتیک به باکتریوسیدال می باشد(Johnson et al.,2012).
3-7کدورت سنجی محیط کشت میکروبی مایع3-7-1تهیه سوسپانسیون میکروبی 5/0 مک فارلندمقدار 175/1 گرم کلرید باریم را در 100 سی سی آب مقطر حل کرده در ارلن دیگر اسید سولفوریک 1% تهیه کرده سپس 5/0 سی سی محلول کلرید باریم را به 5/99 سی سی اسید سولفوریک 1%اضافهکرده حجم نهایی را به 100 سی سی رسانده، محلول بدست آمده کدر همان کدورت 5/0 مک فارلند معادل کدورت 108×1 باکتری می باشد(Darah et al.,2011).
درتصویر 3-18 لوله آزمایش سمت راست حاوی سوسپانسیون میکروبی، لوله سمت چپ محلول 5/0 مک فارلند ولوله وسط آب مقطر به عنوان شاهد می باشد.

تصویر 3-11 مقایسه محلول های میکروبی 5/0 مک فارلند و کلرید باریم3-8-1رقت مهار کننده های رشد میکروبیدر زیست شناسی و پزشکی رقت به منظور کاهشغلظت موجودات زنده ی میکروسکوپی یا تعداد سلول های نمونه مورد استفاده قرار می گیرد .به عنوان مثال تعداد و اندازه ی کلنی باکتری ها در پلیت آگار در یک زمان معین رشد وابسته به غلظت آنهاست بیان مقدار حداقل غلظتی که می تواند اثر مهار کنندگی رشد میکروبی را داشته باشداست (http://en.wikipe dia.org/wiki/serial_dilution).
3-8-2دستگاه اسکتروفتومتریدستگاه اسپکتروفتومتری جهت سنجش مقادیر کدرورت محلول ها می باشد.هر ترکیب در محدوه ی خاصی از طول موج نور راعبور می دهد.این محدوه تجربی بدست می آید.اسپکتروفتومتری اندازه گیری جذب یا انتقال نور توسط ماده شیمیایی می باشد .اگر نمونه هیچ نوری را جذب نکند یعنی تمام نور را عبور داده در این صورت نمونه روشن به نظر می رسد و اگر نمونه تمام نور را جذب کند و هیچ نوری را عبور ندهد نمونه تیره می باشد.طیف سنج مرئی را در محدوه ی ماورابنفش(400-185 نانومتر)و در محدوه ی (700-400نانومتر) از اسپکتوفتومتری الکترومغناطیسی قابل مشاهده است .در طیف سنج IRمحدوده ی 700-1500 نانومتر اسپکتوفتومتری مادون قرمز قابل مشاهده است .نمونه های آزمایشگاهی در این تحقیق با طیف 610نانومتر سنجیده شد (Said et al., 2010).
در این تحقیق اندازه گیری مقدار کدورت محیط های کشت میکروبی بعداز اضافه عصاره به آن می باشد به این صورت که مقداری از محیط کشت انکوباته شده را در جایگاه نمونه قرار داده نور از آن جایگاه عبور کرده و برحسب روشنی و تیرگی آن،جذب نمونه می شود بقیه نوری که از نمونه عبور می کند با استفاده از فرمول زیر محاسبه می شود.
(3-1) T=ITI0IT مقدار نوری است که از جایگاه نمونه عبور می کند.
I0 مقدار نوری است که بعد از جذب از نمونه عبور می کند.
مقدار جذب نور از فرمول زیر محاسبه می شود
A=-logT =-logITI0(3-2) A نور جذب شده توسط نمونه
T مقدار نوری که از نمونه عبور می کند
3-8 رقیق سازی عصاره اسفنج Callyslpongiasp. خشک شده و سنجش MIC3-8-1رقیق سازی در این تحقیق رقیق سازی عصاره به این صورت که رقت شماره یک عصاره با برداشتن 3 میلی لیتر از عصاره و اضافه کردن 7 میلی لیتر آب مقطر استریل به آن (رقت شماره1)، رقت شماره دو نیز 3 میلی لیتر از رقت شماره یک برداشته و به آن7میلی لیتر آب مقطر استریل افزوده و برای تهیه رقت شماره سه از رقت شماره دو، 3 میلی لیتر برداشته و با 7 میلی لیتر آب مقطر استریل مخلوط شده است.
بعد از تهیه سه رقت متفاوت 1، 2 ، 3 (تصویر شماره3-12) محیط کشت نوترینت براث(NB)25 میلی لیتر، 250 ماکرولیتر سوسپانسیونباکتری 5/0 مک فارلند، 20 ماکرولیتر از رقت مورد نظر در لوله های آزمایش اضافه کرده و در انکوباتور با دمای ساعت 18 مدت به℃37قرار داده سپس بادستگاه اسپکتروفتومتری مدل Unico uv-1200 (تصویر شماره3-13)، طول موج610 نانومترمقدار جذب و عبور نور اندازه گیری گردید.لوله شاهد محیط کشت بلانک حاوی نوترنیت براث و میکروب مورد نظر و برای کنترل منفی نوترینت براث، سوسپانسیون باکتری و حلال،کنترل مثبت نوترینت براث، سوسپانسیون باکتری و دیسک آنتی بیوگرام اضافه گردید (Darah et al.,2011).

تصویر3-12 رقت های مختلف عصاره اسفنج Callyslpongia sp.
تصویر 3-13 دستگاه اسپکتروفتومتری مدل Unico uv-12003-8-2MIC(MinimumInihibitory Concentration)با دستگاه اسپکتروفتومتری مقدار عبور نوراندازه گیری و با استفاده از فرمول 3-2 جذب نور محاسبه شد. مقدار نور جذب شده توسط هریک از نمونه ها به اثر گذاری عصاره و رقت موثر آن در ممانعت از رشد باکتری بستگی دارد. شاهد NB(نوترینت براث)با جذب برابر (01/0)شاهد بلانک برای همگی میکروب ها در نظر گرفته شد. برای باکتری اشریشاکلای پارامترهای، NB+Ecoli (نوترینت براث و باکتری اشریشاکلای)با جذب 1/3 به عنوان کنترل مثبت NB+E.coli+GM(باکتری اشریشاکلای به همراه نوترینت براث و جنتامایسین)با جذب 5/0 به عنوان کنترل منفی تهیه گردید.NB+shiglla(نوترینت براث وشیگلا)با جذب (3/3)به عنوان کنترل مثبت NB+Shiglla+GM(نوترینت براث،شیگلا و جنتامایسین)با جذب 5/0 به عنوان کنترل منفی،NB+S.aureus(نوترینت براث و استافیلوکوکوس اورئوس)با جذب 1/2 کنترل مثبت +GMaureusNB+S. (نوترینت براث،استافیلوکوکوس اورئوس و جنتامایسین)با جذب (9/0)به عنوان کنترل منفی تهیه گردید سپس هر یک از باکتری ها را با هریک از رقت های عصاره به طور جداگانه در لوله آزمایش حاوی نوترینت براث قرار داده شد و بعد از سپری شدن مدت رشد با دستگاه اسپکتروفتومتری در طول موج 610 نانومتر اندازه گیری شد.3-9 شمارش و محاسبه کلنی باکتری الف) شمارش کلی میکروبی ( محاسبه استاندارد): جهت شمارش پلیت هایی انتخاب می شوند که بین 30 تا 300 کلنی داشته باشند، برابر میانگین تعداد کلنی های شمارش شده در دو پلیت ضرب در ضریب رقت بکار رفته است .
ب) محاسبه تخمینی: اگر در تمام رقت ها بیش از 300 کلونی در هر پلیت دیده شود ، سطح هر پلیت را به شعاع های مناسب تقسیم می کنیم و کلنی ها را در یک قسمت شمارش کرده و سپس تعداد کل را در ضریب مناسب ضرب می کنیم. میانگین شمارش را در دو پلیت محاسبه و در ضریب رقت ضرب و نتیجه را به عنوان تخمین شمارش کلنی گزارش می کنند.برای محاسبه MBCاز هر لوله آزمایش کهMIC آن تعین شد مقدار 20 میکرولیتر بر محیط کشت مولر هینتون آگارتلقیح شد. بعد از 24 ساعت انکوباسیون، کلنی های ایجاد شده(تصویر 3-21) بر سطح محیط کشت شمارش شد(Darah et al 2011).در این تحقیق تعداد کلنی ها از روش محاسبه ی استاندار شمارش شد.

تصویر3-14کلنی های ایجاد شده در محیط کشت میکروبی3–10 کشت قارچیهمه ی عصاره های اسفنج بر تمام محیط های کشت قارچ آسپرژیلوس فلاوئوس، پنی سیلیوم و مخمر کاندیدا آلبیکنس بدون اثر مهار رشد و کشندگی بوده اند.3-11عصاره الکلی غلیظ شدهدر این تحقیق جهت سنجش اثر عصاره گونه اسفنجCallyslpongia sp. با افزایش غلظت نسبت به کاهش حجم آن عصاره بر کشت باکتری نیز مورد بررسی قرار گرفت. برای غلیظ سازی عصاره اولیه (حجم50میلی لیتر) وقتی که عصاره در دستگاه روتاری جهت حذف حلال قرار گرفته است با حذف بیشتر حلال مقداری از عصاره را برداشته A1نام گذاری شد، عصاره اولیه مجددا جهت حذف حلال بیشتر در روتاری قرار گرفت حجم آن به 25 میلی لیتر رسیدو با A2نام گذاری شد.برای سومین بار این عمل تکرار شد و حجم نهاییبه 10 میلی لیتر با نام A3 تهیه گردید.اثر 20، 30 و 40 میکرولیتر از هریک از عصاره های بر 5 میلی لیتر محیط کشت نوترینت براث و 1 میلی لیتر سوسپانسیون میکروبی مک فارلند بعد از انکوباته کردن مقدار جذب و عبور نور با دستگاه اسپکتروفتومتری در طول موج 260 نانومتر اندازه گیری گردید.کلیه جدول و نمودار ها با نرم افزار Microsoft Office Excel 2007 طراحی و رسم شده اند.فصل چهارمنتایج4-1 شناسایی مولکولی اسفنج گونه Callyspongiasp.
باندهایPCRبا استفاده از مارکر Co1(تصویر شماره4-1)ایجاد شده در محدوده bp500 قرار دارند(تصویر شماره4-2)بعد از توالی خوانیگونه،اسفنج Callyslpongiaspجزیره هرمزبه شماره ثبت ژنیBGPM-2012با مقایسه سایر توالی گونه های ثبت شده و NCBIتایید شد در ضمن نتیجه ای از تحقیق میکروبی وبررسی قبلی این گونه در خلیج فارس ایران یافت نشد.

تصویر شماره 4-1مارکر co113208052768510000bp
0010000bp
1320801628775250bp
00250bp
1231901178560750bp
00750bp
1320801339215500bp
00500bp
5670551446530001224915145351500
تصویر شماره4-2 محدوده ی باندهای PCR4-2 خاصیت باکتریواستاتیکی و باکتریوسیدالی عصاره اسفنج Callyslpongiasp.نسبت MIC به MBC شاخص باکتریواستاتیک به باکتریوسیدال می باشدهاله ایجاد شده به معنی عدم رشد میکروب می باشد.عصاره E بر S.aureus خاصیت باکتریواستاتیکی(تصویر 4-3 ) وخاصیت باکتریو سیدالی عصاره الکلی بر میکروب های شیگلا (تصویر 4-4) و اشریشیاکلای (تصویر شماره4-5)داشته است.بعد از تلقیح عصاره به محیط کشت، مشاهده میکروب با میکروسکوپ نوری و مقایسه آن با میکروب بدون تلقیح عصاره در محیط کشت لیز شدن وتغییر فرم کلنی میکروب که نشانه توقف رشد باکتری استهمچنین اثر گذاری عصاره بر مرحله ای از رشد آن قابل ملاحظه است.
تمام عصاره ها بر رشد قارچ های مورد آزمایش بی اثر بوده اند .همانطور که در تصاویر 4-6،4-7 و4-8 قابل مشاهده است آنتی بیوتیک نیستاتین در تمام محیط کشت های قارچی هاله ای عدم رشد واضح و نسبتا بزرگی ایجاد کرده اما اطراف دیسک آغشته به عصاره هاله ای ایجاد نشده و کلنی ها در مجاورت دیسک عصاره به خوبی رشد کرده اند .
3188335550545دیسک آغشته به عصاره اسفنج
دیسک آغشته به آنتی بیوتیک
دیسک آغشته به حلال
00دیسک آغشته به عصاره اسفنج
دیسک آغشته به آنتی بیوتیک
دیسک آغشته به حلال

تصویر 4-3خاصیت باکتریواستاتیکی عصارهE بر S.aureus23876001016635عصاره الکلی بر محیط کشت میکروب شیگلا
00عصاره الکلی بر محیط کشت میکروب شیگلا

تصویر 4-4 خاصیت باکتریوسیدی عصاره الکلی بر میکروبShiglla sp.224155045085عصاره الکلی بر محیط کشت میکروب اشریشیاکلای
00عصاره الکلی بر محیط کشت میکروب اشریشیاکلای

تصویر 4-5 خاصیت باکتریوسیدی عصاره الکلی بر میکروب E.coli15240103505264096562230دیسک آغشته به عصاره
00دیسک آغشته به عصاره
194754529781500
3119755237490دیسک آنتیبیوتیک نیستاتین
00دیسک آنتیبیوتیک نیستاتین

235140511493500
2566670309245دیسک آغشته به حلال
00دیسک آغشته به حلال

19367505651500
تصویر 4-6 محیط کشت Candida albicanc300291513436600037477701193165دیسک آنتی بیوتیک نیستاتین

متن کامل در سایت امید فایل 

00دیسک آنتی بیوتیک نیستاتین
4003675725170دیسک آغشته به حلال
00دیسک آغشته به حلال
145859584137500-654685699770دیسک آغشته به عصاره
00دیسک آغشته به عصاره
326199588138000
تصویر 4-7 محیط کشت Pinicillum sp.105537089217500-881380781685دیسک آنتی بیوتیک نیستاتین
00دیسک آنتی بیوتیک نیستاتین
40036751249680دیسک آغشته به حلال
00دیسک آغشته به حلال
3002915372110003916680262255دیسک آغشته به عصاره
00دیسک آغشته به عصاره
2882265138747500
تصویر 4-8 محیط کشت Aspergillus4-3 بررسی قطر هاله عدم رشد باکتری بر اثر تلقیح عصاره اسفنجCallyslpongia spدر محیط کشت میکروبیبراثر تلقیح 20 میکرولیتر از انواع عصارهای اسفنج Callyslpongia spبه محیط کشت مولر هینتون آگارمحتوی هریک از میکروب های مورد آزمایش هاله هایی ایجاد شد که میانگین قطر آنها بعد از سه مرتبه تکرار آزمایش در جدول 4-1آورده شده است در تمام تکرار های کشت میکروبی قطر هاله با احتساب 6 میلی متر قطر دیسک دیفیوژن اندازه گیری شد.قطر هاله اطراف دیسک های آنتی بیوتیک جنتامایسین در محیط کشت اشریشاکلای 23، شیگلا 25، استافیلوکوکوس اورئوس 20 میلی متر بوده است. میانگین قطر هاله عصارهD در محیط های کشتاشریشاکلای 5/7 در شیگلا 5/8و در استافیلوکوکوس اورئوس 5/11 میلی متی اندازه گیری شد در نتیجه عصارهDاثر بهتری بر استافیلوکوکوس اورئوس داشته است.
میانگین قطر عصارهE در محیط های کشت اشریشاکلای8، شیگلا 7 واستافیلوکوکوس اورئوس 5/11 میلی متربوده است در نتیجه اثر بهتر این عصاره بر استافیلوکوکوس اورئوس می باشد(جدول4-1).
میانگین قطر عصارهF نیز در محیط های کشت اشریشاکلای 8، شیگلا 7 و استافیلوکوکوس اورئوس نیز 7میلی متر بوده است در نتیجه با اختلاف جزیی 1 میلی متری اثر این عصاره بر اشریشاکلای بهتر می باشد(جدول 4-1).
جدول 4-1 قطر هاله عدم رشد میکر وب با تلقیح عصاره های متفاوت اسفنج Callyslpongia sp. برحسب میلی مترمیکروب بیماری زا
قطر هاله عدم رشد عصاره برمیکروب* **قطر هاله
آنتی بیوتیک
Dعصاره Eعصاره Fعصاره E.coli 5/7 8 8 23
Shiglla sp. 5/8 7 7 25
S. aureus 11 5/11 7 20
* و**قطر هاله عدم رشد برحسب میلی متر ، با احتساب 6 میلی متر قطر دیسک دیفیوژن می باشد.
4-4کدورت سنجی محیط کشت در رقت های متفاوتسنجش کدورت لوله آزمایش حاوی محیط کشت نونرینت براث و باکتری تهیه شده 5/0 مک فارلند با هریک از باکتری ها توسط دستگاه اسپکتروفتومتری در طول موج 610 نانومتر در جدول 4-2 آورده شده است.NBنوترینت براث عاری از باکتری و آنتی بیوتیک به عنوان شاهد محیط کشت خالص مقدار جذب 01/0را نشان داد که شفاف ترین محلول می باشد در لوله آزمایش حاوی اشریشاکلای و نوترینت براث 3/1، لوله حاوی شیگلا و نوترینت براث مقدار جذب 3/3، لوله حاوی استافیلوکوکوس اورئوس با مقدار جذب 1/2 نشانه مقدار تراکم رشد باکتری ها در این لوله ها بود. در لوله آزمایش حاوی جنتامایسین برای اشریشاکلای و شیگلا مقدار جذب برابر5/0 و برای استافیلوکوکوس اورئوس برابر 9/0می باشد که به عنوان کنترل منفی در نظر گرفته شد. با اضافه کردن هریک از رقت ها مقدار جذب محاسبه شدهبیشترین اثر بازدارندگی رشد رقت 3 با جذب 2/1وکمترین اثر بازدارندگی رشد رقت 2با جذب 8/1 بر اشریشاکلای را نشان می دهد. در محیط کشت حاوی شیگلا رقت 1 بیشترین و رقت 3 کمترین اثر بازدارندگی رشد به ترتیب 2/1 و 8/1 را نشان می دهد.در محیط کشت استافیلوکوکوس اورئوس بیشترین اثر باز دارندگیبرابر6/1و کمترین برابر 9/1 بهترتیب رقت 1 و رقت 3 اندازه گیری شد.
جدول 4-2 مقدار جذب نوری در محیط کشتجذب نوری بر حسب nm محیطکشت
01/0 NB
3/1 NB+E.coli
5/0 NB+E.coli+GM
6/1 رقت1NB+E.coli+
8/1 رقت2 NB+E.coli+
2/1 رقت3NB+E.coli+
3/3 NB+Shiglla
5/0 NB+Shiglla+GM
2/1 رقت1NB+Sgiglla+
5/1 رقت 2NB+Sgiglla+
8/1 رقت 3NB+Sgiglla+
1/2 NB+S.aureus
9/0 NB+S.aureus+GM
6/1 رقت1NB+S.aureus+
7/1 رقت2NB+S.aureus+
9/1 رقت3NB+S.aureus+
4-5شمارش باکتری های زنده در آزمایش‌های میکروبی باید بتوان تعداد باکتری‌ها را شمارش کرد. این شمارش می‌تواند دریک‌سان‌سازی دوز مصرفی باکتری یا مقایسه و سنجش اثر یک ماده بر شمار باکتری‌ها به کار برده شود.روش‌های گوناگونی برای شمارش باکتری‌ها به کار می‌رود که به هدف شمارش، امکانات موجود ومایع یا جامد بودن کشت باکتری بستگی دارد.
در این تحقیق تعداد کلنی ها کمتر از 300 عدد بوده اند لذا از روش استاندارد محاسبه گردیدو نتایج در جدول 4-2 آورده شد.
جدول 4-3 شمارش میکروبی به روش محاسبه استاندارS.aureues Shiglla E.coli 1/34×1027/3×102رقت 1
2/36×1036/6×1031/73×103رقت 2
7/16×1034/13×1043/6×103رقت 3
0 0 0 NB+GM *
بی نهایت بی نهایت بی نهایت **NB+H

پاسخ دهید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *