مقالات

1-16) تولید جنین در شرایط آزمایشگاهی

اولین نوزاد متولد شده با بهره گرفتن از روش درمانی [1]IVF در سال 1978 به وسیله Steptoe وEdwards  گزارش شد. این روش درمانی امید تازه اي براي زوجهاي نابارور به وجود آورد. در آستانه قرن 21 انقلابی در زمینه استفاده از روشهاي بیوتکنولوژیک در مورد حیوانات اهلی صورت گرفت . این تحولات با تولید موشهاي ترانس ژنیک[2] توسط Brinster و همکاران آغاز گردید و پس از آن به سرعت با تولید گاو، گوسفند و خوك هاي ترانس ژنیک (Wall et al, 1992; Ebert & Schindlre, 1993)، تعیین جنسیت عملی گاو(Seidel et al, 1997; Seidel et al, 1999; Seidel et al,2002) و تولید اعجاب انگیز گوسفند دالی که توسط Campbell و همکاران از سلولهاي سوماتیک شبیه سازي شده بود، ادامه یافت(Campbell et al, 1996; Wilmut et al, 2007). فناوري تولید جنین در شرایط آزمایشگاه به ما اجازه ي تولید مقادیر انبوه جنین در مراحل تکاملی گوناگون را میدهد و از این رو بسیار مورد استقبال دانشمندان علوم زیستی تولید مثلی و بیوتکنولوژي قرار گرفته است

1-16-1) ظرفیت پذیري اسپرم

در واقع علت این امر که بسیاري از آزمایش هاي ابتدایی  لقاح آزمایشگاهی ناموفق بودند، عدم ظرفیت پذیري مناسب اسپرم بوده است. تا زمانی  که اسپرم ها مسیر داخل لوله تناسلی ماده را طی نکرده اند، ظرفیت کامل براي لقاح تخمک را ندارند. اسپرم باید تغییرات فیزیولوژیکی  تکمیلی  (ظرفیت پذیري اسپرم) را الزاماً متحمل شود تا بتواند از لایه ي شفاف عبور کرده و با تخمک ادغام شود. در طی ظرفیت پذیري ، غشاي پلاسمایی اسپرم متحمل واکنشهاي بیوشیمیایی شده و ناپایدار میگردد. در نتیجه این واکنشها میزان نفوذ پذیري غشاء به مواد مختلف به ویژه کلسیم تغییر میکند. این تغییرات ظاهرا به عنوان عامل اصلی براي واکنش آکروزومی عمل مینمایند.  واکنشهاي آکروزومی موجب متراکم شدن، شکسته شدن و نهایتا متخلخل شدن غشاهاي پلاسمایی و خارجی آکروزوم میشوند. آکروزوم حاوي آنزیم هایی است که پس از متخلخل شدن از آن خارج گشته و بافت های در اطراف تخمک را که در مسیر حرکت اسپرم قرار دارنداز بین میبرند. در نتیجه اسپرم قادر خواهد بود وارد تخمک گشته و آن را بارور نماید. مطالعات نشان میدهد که شستشوي اسپرم قبل از انکوبه نمودن و قرار گرفتن در محیط هاي سرشار از یون و محیطهاي کلسیم دار میتواند واکنش آکروزومی را در محیط آزمایشگاهی هدایت کرده و عمل لقاح را سرعت بخشد(Wani, 2002).

1-16-2) لقاح آزمایشگاهی (IVF)

اسپرم داراي مقادیر زیادی پروتئین در سطح غشایی خود می باشد که این پروتئین ها اتصال اسپرم را به زونا پلوسیدا سهولت می بخشد. فرایند لقاح از زمانی که اسپرم به رسپتورهاي زوناي اووسیت ثانویه متصل شود، آغاز می گردد. این رسپتورها به صورت اختصاصی عمل می کنند به طوري که اسپرم موش فقط  قادر به باور ساختن تخمک موش است. در فرآیند لقاح اووسیت توسط اسپرم فعال میشود، به طوري که بدون وجود هیچ گونه محرکی، پرونوکلئوسها و زایگوت را ایجاد می کند

باز شدن سر اسپرم 1-2 ساعت بعد از نفوذ در تخمک و شکل گیري پرونکلئوس نر ظرف 3-5 ساعت پس از نفوذ رخ می دهد(1989Hyttel et al,). از جمله تغییرات بیوشیمیایی  که در اثر نفوذ اسپرم در تخمک  رخ می دهد، تغییر در الگوي یون کلسیم داخل سلولی است که در طی پدیده لقاح موجب القاي اگزوسیتوز گرانول هاي کورتیکال و بلاك نمودن پلی اسپرمی میشود. عمده ترین مشکل در روند لقاح وقوع  پلی اسپرمی است. در شرایط In vivo دستگاه تولیدمثلی ماده باعث کاهش تعداد اسپرم رسیده به تخمک می شود.

در تخمکهاي پیر در صد لقاح چنداسپرمی بالاست و اگر تخمک خیلی پیر باشد، رشد رویانی، غیر طبیعی شده یا آن که اصلا لقاحی صورت نمیگیرد . به نظر میرسد در محیطهایی که داراي آلبومین حرارت داده شده سرم خون یا آلبومین سرم خون گاو Bovine Serum Albomin (BSA) هستند ، واکنش آکروزومی Acrosome reaction به مراتب راحت تر صورت میگیرد. همچنین ، لازم است یک منبع انرژي ، مانند گلوکز یا پیروات در محیط وجود داشته باشد تا از تحرك اسپرم و متابولسیم تخمک پشتیبانی کند . درصد بالاي لقاح درIVF به وجود تعداد مناسب اسپرم هاي باروري که به شدت متحرك بوده و تخمکهاي باروري که داراي اولین گویچه قطبی هستند، بستگی دارد .

بعضی از معیارهایی که به عنوان نشانه لقاح به کار میروند عبارتند از :

– نفوذ اسپرم به داخل اووپلاسم

– تورم سر اسپرم، تشکیل پیش هسته نر

– شکافتگی با ظاهر طبیعی ، در جهت تشکیل بلاستومر

– متلاشی شدن دانه هاي قشري

– مشاهده دم یک اسپرم در اووپلاسم

– هیچ یک از موارد فوق به تنهایی نمیتواند بیانگر لقاح طبیعی باشد ، چرا که رویان هاي حاصل از بکرزایی[3] هم ، بعضی از معیارهاي فوق را دارا هستند(Kim et al,1998).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2-1) مواد و تجهیزات مورد نیاز

داروها و مواد شیمیایی و وسایل به کار رفته در این مطالعه شامل موارد ذیل می باشد:

پودر داروی بلئومایسین، ژل رویال ، رنگ ائوزین-نگروزین جهت رنگ­آمیزی اسپرم و تهیه گسترش، محلول فرمالین ۱۰٪ جهت فیکس نمودن بافت بیضه موش­ها، رنگ ائوزین،  رنگ هماتوکسیلین، الکل اتیلیک (۷۰٪، ۸۰٪، ۹۰٪، ۹۶٪ و۱۰۰٪)،  محلول گزیلل (زایلین)، چسب آلبومین، گلیسرول، چسبEntellan، کربنات لیتیم، پارافین، محلول اسید الک، محلول کلروفریک، ترازوی حساس برای توزین موش­ها، دارو و بافت­ها، سرنگ انسولین ۱۰۰ واحدی جهت تزریق دارو و گاواژ، انکوباتور برای تأمین حرارت °C37 جهت نگهداری نمونه­های اسپرم در محیط کشت و همچنین گرم کردن وسایل مورد استفاده،  ست جراحی، سمپلر برای برداشتن نمونه و انتقال آن به لوله­های آزمایش، لام نئوبار (هموسیتومتر) جهت شمارش و بررسی اسپرم­ها، دستگاه سانتریفوژ، دستگاه اسپکتروفتومتر، فریزر با دمای۸۰ –  برای نگهداری سرم، لام و لام،  قلم الماس، میکروتوم، قالب­ های پارافین، ظروف مخصوص رنگ­آمیزی، دستگاه الکتروکمی­لومینسانس، عدسی مدرج و مشبک

2-2) حیوانات مورد مطالعه:

در این تحقیق 40 رت نر بالغ نژاد ویستار با میانگین وزنی20 ±200  گرم از مرکز نگهداری حیوانات آزمایشگاهی دانشکده علوم زیستی دانشگاه ارومیه جهت انجام آزمایشات تهیه گردید. این حیوانات تحت شرایط استاندارد ۱۲ ساعت روشنایی و ۱۲ ساعت تاریکی  و درجه حرارت ۲± ۲۲درجه سانتیگراد در قفس ­های مخصوص پرورش و نگهداری شده و به صورت آزادانه به آب و غذا دسترسی داشتند.

2-2-1) تعیین دوز مؤثر دارو و حیوانات

موش­های نر حدود دو ماه پس از تولد بالغ شده و قادر به تولید حداکثراسپرم روزانه و بارور نمودن موش های ماده می­شوند. رت های ماده نیز 50 – 70 روز پس از تولد به بلوغ جنسی می رسند. بررسی مطالعات پیشین بر  روی داروی بلئومایسن نشان می دهد که تجویز بلئومایسین با دوز mg/kg/ twice a week10 باعث اختلال در باروری رت ها می شود(Yildirim et al, 2005). بنابراین میزان دوز تجویزی mg/kg/ twice a week10 (بصورت محلول در نیم سی سی آب مقطر) انتخاب گردید . میزان دوز ژل رویال mg/kg/day 010 (بصورت محلول در یک سی سی آب مقطر). انتخاب شد.

 

 

 

2-2-2) گروه بندی حیوانات:

40 سر رت نر بالغ به طور تصادفی به 4 گروه 10 تایی تقسیم شدند و به صورت زیر تحت رژیم دارویی قرارگرفتند:

–  گروه کنترل (CO) : این گروه دوبار در هفته 10 میلی لیتر نرمال سالین را به ازای هر کیلوگرم وزن بدن به صورت درون صفاقی  بمدت 48 روز  دریافت کردند.

گروه ژل رویال (RJ) : : این گروه نرمال سالین را دو  بار در هفته  با دوز 10 میلی گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن از طریق تزریق درون صفاقی و ژل رویال را با دوز 100 میلی گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن روزانه یک بار به صورت خوراکی از طریق گاواژ بمدت 48 روز دریافت کردند.

گروه بلئومایسین (BL) : این گروه دارو را با دوز10 mg/kg به مدت 48 روز (2 بار در هفته ) به صورت تزریق درون صفاقی دریافت کردند.

گروه بلئومایسین_ ژل رویال (BL+RJ) : این گروه دارو را 2 بار در هفته  با دوز 10 میلی گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن از طریق تزریق درون صفاقی و ژل رویال را با دوز 100 میلی گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن روزانه یک بار به صورت خوراکی از طریق گاواژ بمدت 48 روز دریافت کردند.

2-3) نمونه برداری

پس از 48 روز رت ها آسان کشی شدند و پوست ناحیه شکمی با الکل اتانول  70 %  ضدعفونی گردید. از قلب حیوانات توسط سرنگ های هپارینه خونگیری به عمل آمد. نمونه ها پس از 30 دقیقه به منطور لخته شدن خون در دمای 37 درجه سانتی گراد سانتریفوژ شده و سرم سریعا جدا گردید و در دمای 30- درجه سانتی گراد جهت سنجش فاکتورهای بیوشیمیایی نگهداری شد. بعد از خونگیری بیضه سمت چپ در دمای 70- فریز شد تا از آن برای سنجش قدرت آنتی اکسیدانی استفاده شود و بیضه سمت راست جهت مطالعات بافت شناسی در فرمالین 10% نگهداری شد.

مواد لازم جهت تهیه محلول ثبوتی فرمالین ١٠% نمکی

کلرید سدیم                              ٩گرم

آلدئید فرمیک                         ١٠٠میلی لیتر

آب مقطر                             ٩٠٠ میلی لیتر

 

2-4) مراحل تهیه مقاطع بافتی

بافت­های تثبیت شده در فرمالین دارای مقدار زیادی آب هستند که این آب می ­تواند در تهیه مقاطع بافتی اختلال ایجاد کند، لذا آبگیری از بافت­ها جهت ایجاد قوام و سفتی، ضروری به نظر می­رسد. این اعمال طی پاساژ یا گردش بافت صورت می­گیرد. مراحل پاساژ بافت عبارتند از:

2-4-1)  آبگیری (dehydration)

برای آبگیری از الکل اتانول با غلظت­های صعودی به شرح زیر استفاده شد:

١- الکل ٧٠ درجه                                   ١ ساعت

٢- الکل ٨٠ درجه                                   ١ ساعت

٣- الکل ٩٠ درجه                                   ١ساعت و 30 دقیقه

۴- الکل مطلق I                                     ١ ساعت

۵- الکل مطلق II                                   ١ ساعت

2-4-2) شفاف سازی (clearing)

به منظور زدودن کدورت و افزایش شفافیت بافت این مرحله مورد استفاده قرار می­گیرد

مراحل شفاف سازی به صورت ذیل انجام گرفت:

١- محلول گزیلول + روغن صدر                     ١ شب

٢- محلول گزیلول                                      ١ ساعت

 2-4-3) نفوذ و آغشتگی

در این مرحله برای نفوذ و آغشتگی، بافت­ها به یک حمام پارافین در یک کوره با دمای Cº60-56 (دمای ذوب پارافین) منتقل شدند. با این عمل، گزیلل از بافت­ها با پدیده انتشار خارج و تبخیر گشته و متعاقب آن پارافین برای جانشین شدن گزیلل به داخل بافت انتشار می­یابد.

 

 

مراحل آغشتگی به صورت ذیل انجام گرفت:

١- پارافین مذاب                                   ١ ساعت

٢- پارافین مذاب II                                      ١ ساعت

٣- پارافین مذاب III                                    ٢ ساعت

2-4-4) قالب گیری

بلافاصله پس از مرحله آغشتگی بافت ها قالب گیری شدند. برای این منظور بافت ها از جهت مناسب در درون قالب  قرار گرفت و پارافین مذاب فاقد گزیلل بر روی نمونه ها ریخته شد.

تصودر 2-1: مراحل قالب گیری بافت(Istockphoto, 2013)

2-4-5) برش بافت و ثابت کردن مقاطع بافتی بر روی لام

در این مرحله قالب­های پارافینی در جایگاه مخصوص  دستگاه میکروتوم قرار داده شد و برش­هایی با ضخامت ۵ تا ٧ میکرون از آن ها تهیه گردید. برش­های حاصل به منظور از بین رفتن چین خوردگی ها به حمام آب گرم با دمای Cº45 منتقل گردیدند و  برای چسباندن نمونه­ها به لام چسب آلبومین مورد استفاده قرار گرفت.

2-4-6) رنگ آمیزی مقاطع بافتی

برای بررسی خصوصیات فیزیکی اجزاء سلولی و ارتباطات بافت­ها، برش­های مورد نظر باید مورد رنگ آمیزی قرار گیرند. اما قبل از انجام رنگ آمیزی پارافین از مقطع روی لام برداشته شده، برای این منظور و آب­دهی به بافت­ها، اسلایدها به ترتیب از محلول­های ذیل عبور داده شدند.

١- محلول گزیلل I                           ٣ دقیقه

٢- محلول گزیلل II                          ٣ دقیقه

٣- محلول گزیلول III                       ٣ دقیقه

۴- الکل مطلق                                ٣ دقیقه

۵- الکل ٩٠ درجه                            ٣ دقیقه

۶- الکل ٨٠ درجه                            ٣ دقیقه

٧- الکل ٧٠ درجه                            ٣ دقیقه

بدین ترتیب مقاطع برای رنگ آمیزی آماده می­گردند.

2-4-6-1) رنگ آمیزی آهن وایگرت

رنگ آمیزی وان گیسن (Van Geison) :

معرف ها :

محلول وایگرت – هماتوکسین :

محلول الف :

هماتوکسیلین                                                      1    گرم

الکل مطلق                                                        100 سانتی مترمکعب

محلول ب :

محلول مائی کلرورفریک 29 %                                4 میلی لیتر

آب مقطر                                                        95 میلی لیتر

اسید کلریدریک                                                1 میلی لیتر

محلول کار :

مخلوط مساوی از محلول های الف و ب می باشد .

محلول وان گیسن :

محلول مائی فوشین اسید 1 درصد                           5/2 میلی لیتر

محلول مائی اشباع شده اسید پیکریک                       5/97 میلی لیتر

طریقه رنگ آمیزی :

1- گزیلل                                                         15  دقیقه

2- الکل مطلق                                                  3    دقیقه

3- الکل 95 %                                                 3   دقیقه

4- شستشو با آب مقطر                                       1    دقیقه

5- رنگ آمیزی با محلول وایگرت هماتوکسیلین           45  دقیقه

6- کربنات لیتیم                                                 3   دقیقه

7- شستشو با آب مقطر                                        1   دقیقه

8- رنگ آمیزی با محلول وان گیسن                        3  دقیقه

9- الکل 95 درجه                                              4  دقیقه

10- الکل مطلق دو تعویض                                   4  دقیقه

11- گزیلل دو تعویض

11- مونته کردن

بعد از اتمام رنگ آمیزی یک قطره چسب انتالان روی لامل گذاشته شده و سپس به آرامی لامل حاوی چسب بر روی لام حاوی بافت قرار داده شد(خامه چیان، 1379)

2-5)  آماده سازی موش برای IVF

در مطالعه حاضر، ابتدا به 12 رت ماده بالغ 30 واحد هورمون گنادوتروپین سرم مادیان آ بستن(ساخت شرکت Folligon هلند )به حجم از 0.2 میلی لیتر  (Pregnant mare serum gonadotropin, PMSG)و54 ساعت بعد، 15 واحد هورمون گنادوتروپین کوریون انسان(ساخت شرکت Folligon هلند) به حجم از 0.2 میلی لیتر(Human chorionic gonadotropin, HCG) به روش داخل صفاقی صفاقی ([4]IP) تزریق شد. عمل تخمک گذاری معمولاً 12 الی 16 ساعت پس از تزریق هورمون گنادوتروپین کوریون انسان صورت می گیرد.

2-5-1) آماده سازی محیط کشت برای IVF

یک روز پیش از انجام لقاح آزمایشگاهی، محیط کشت لازم برای انجام عمل لقاح و کشت جنین ها تهیه و به مدت 12 ساعت در انکوباتور با ترکیب گازی CO2 %5 در دمای 37 درجه سانتی گراد قرار گرفت. دیش های لقاح با محیط کشت اختصاصی جنین رت (4mg/ml BSA+mR1ECM) قطره گذاری شدند. چند قطره 100 میکرولیتری در هر دیش برای لقاح و چندین قطره 100میکرولیتری برای شستشو در دیش های لقاح گذاشته شدند و سطح قطره ها با روغن معدنی (Mineral oil) پوشانیده شد. در ضمن 6 الی 9 ساعت بعد از اضافه کردن اسپرم به قطره لقاح با مشاهده دو پیش هسته نر و ماده و بدست آوردن درصد لقاح،  زایگوت ها شستشو داده شده و به پتریدیش حاوی قطره های کشت انتقال داده شدند. لازم بذکر است که هم محیط لقاح و هم محیط کشت، هر دو از نوع محیط کشت اختصاصی جنین رت (medium for 1 –cell rat embryos, mRECM) بوده است(Toyoda et al, 1974).

 

2-5-2) طرز تهیه محیط کشت  mR1ECM:

این محیط به صورت تازه در مرکز تحقیقات جنین شناسی دانشکده علوم زیستی دانشگاه ارومیه بصورت استوک 1 و استوک 2 تهیه گردید.

استوک 1 :کلرید سدیم 42/6 گرم، کلرید پتاسیم 239/0 گرم ، گلوکز 352/1 گرم ، پنی سیلین جی 075/0 ، استرپتومایسین 050/0 گرم لاکتات سدیم 9/1 میلی لیتر را در 100 میلی لیتر آب سه بار تقطیر حل کرده و سپس با بهره گرفتن از فیلتر 20/0 فیلتر نموده و تحت عنوان استوک 1 در داخل یخچال 4 درجه سانتی گراد قرار داده شد.

استوک 2 :برای تهیه آن کلرید کلسیم به میزان 294/0 گرم و کلرید منیزیم 102/0 گرم را در 100 میلی لیتر آب دو بار تقطیر حل نموده و بعد از فیلتر کردن در یخچال4 درجه سانتی گراد نگهداری گردید.

در داخل یک فلاکس محیط کشت 10 میلی لیتر از استوک 1 و 10 میلی لیتر از استوک 2 را ریخته و به آن 210/0 گرم بی کربنات سدیم ، 0055/0 گرم پیرووات سدیم ، 0146/0 گرم گلوتامین ال ، 2 میلی لیتر اسیدهای آمینه ضروری و 1 میلی لیتر اسیدهای آمینه غیر ضروری اضافه نموده سپس حجم آن را با بهره گرفتن از آب سه بار تقطیر به 100 میلی لیتر رسانده و محیط را فیلتر و مورد استفاده قرار گرفت.

2-5-3) آماده سازی اسپرم :

رت های نر تحت تیمار به روش جابجایی مهره های گردن آسان کشی شدند. سپس پوست ناحیه شکمی با الکل اتانول  70 درصد ضدعفونی شده و با ایجاد برش در ناحیه شکمی و دسترسی به  بیضه، دم اپی دیدیم از بیضه جدا شد. بعد از ایجاد چند برش در آن ، اپیدیدیم به لوله آزمایش استریل حاوی 1 میلی لیتر محیط کشت اختصاصی جنین رت حاوی 4 میلی گرم آلبومین سرم گاوی   (Bovine Serum Albumin, BSA)، که قبلاً جهت تعادل در داخل انکوباتور با دمای 37 درجه سانتی گراد قرار داده شده بود، منتقل شد. بعد از گذشت 60 دقیقه اسپرم ها از دم اپیدیدیم خارج  و وارد محیط کشت شدند. از این اسپرم های موجود در محیط کشت  برای بررسی فاکتورهای اسپرمی استفاده شد همچنین جهت ظرفیت یابی محیط کشت حاوی اسپرم بمدت 5 ساعت در داخل انکوباتور قرار گرفت.

2-5-4) روش گرفتن تخمک بالغ و لقاح داخل آزمایشگاهی(IVF):

2-5-4-1) لقاح داخل آزمایشگاهی (IVF):

بعد از گذشت  12 الی 16 ساعت از تزریق هورمون گنادوتروپین کوریون انسانی رت های ماده توسط جابجایی مهره های گردن آسان کشی شدند. لوله های رحمی به همراه قسمت کوچکی از رحم جدا شده و و در داخل محیط کشت 37 درجه سانتی گراد، قرار داده شد. با بهره گرفتن از تکنیک Dissecting تخمک ها را از ناحیه آمپول اویداکت با بهره گرفتن از سرنگ انسولین با سر سوزن گیج 30 ، خارج نموده و به قطره لقاح  منتقل گردید. پس از آن اسپرم های متحرک ظرفیت یابی شده،  به تعداد یک میلیون به ازای هر میلی لیتر محیط کشت به قطره لقاح اضافه شد. عمل لقاح 6 الی 9  ساعت بعد از اضافه کردن اسپرم با مشاهده دو پیش هسته مشخص شد. زیگوت های بدست آمده بعد از شستشو به محیط کشت تازه منتقل شده و به مدت 5 روز کشت داده شدند.

2-5-4-2) ارزیابی رشد جنین ها:

برای ارزیابی مراحل رشد، زایگوت ها در زیر میکروسکوپ معکوس مورد ارزیابی قرار گرفتند، بررسی میزان کلیواژ 24 ساعت بعد از کشت صورت گرفت و درصد جنین های دو سلولی از این طریق محاسبه گردید. سپس پتری دیش ها به منظور بررسی  بلاستوسیت ها در روز 4 و 5  مجددأ  در داخل انکوباتور قرار گرفتند. همچنین درصد جنین های متوقف شده نیز محاسبه گردید(Cebral, 2007).

 

 

 

 

A
C
B

 

 

 

 

 

 

G
H
I
F
E
D

 

تصویر2-2: مراحل انجام پروسه IVF

A: تشریح موش ماده

B,C,D و E: مراحل جدا کردن لوله های رحمی

F,G: قرار دادن شاخ رحم در محیط کشت

H: قرار دادن اسپرم در محیط کشت

I: لقاح اسپرم و تخمک

. 2-6) ارزیابی هیستومورفومتریک بیضه

پس از تهیه مقاطع بافتی و رنگ آمیزی آهن-وایگرت، جهت انجام ارزیابی های هیستومورفومتریک بیضه نظیر بررسی قطر لوله های منی ساز در گروه های مختلف آزمایشی، عدسی چشمی مدرج مورد استفاده قرار گرفت.  برای این منظور در هر لوله، قطر بزرگ و قطر کوچک با بهره گرفتن از عدسی مدرج اندازه گیری و میانگین قطر هر لوله با بهره گرفتن از فرمول ذیل محاسبه گردید.(Elias and Hyde, 1980).

 

 

2-7) ارزیابی فاکتور های مختلف بافت بیضه

برای این منظور تعداد 100 لوله منی ساز در هر بیضه جهت ارزیابی شاخص های زیر مورد مطالعه و بررسی قرار گرفتند.

2-7-1)  ضریب تمایز لوله ای (TDI)

جهت مشخص نمودن این شاخص، درصد لوله های منی سازی که کمتر  از سه رده سلول های اسپرماتوژنز تمایز یافته از سلول اسپرماتوگونی A بودند، محاسبه گردید (Porter et al, 2006).

2-7-2) ضریب اسپرمیوژنز (SPI)

این شاخص بیانگر درصد لوله های منی ساز دارای اسپرمیوژنز طبیعی (حاوی اسپرم) می باشد(Rezvanfar et al, 2008).

2-7-3) ضریب سلول سرتولی (SCI)

به منظور محاسبه ضریب سلول سرتولی نسبت تعداد سلول های زایا به تعداد سلول های سرتولی (Russell et al, 1990)محاسبه گردید.

2-7-4) ضریب میوزی (MI)

برای این منظور نسبت تعداد اسپرماتیدهای گرد به اسپرماتوسیت های اولیه محاسبه گردید (Kheradmand et al, 2011)

2-8) ارزیابی خصوصیات اسپرم ها

2-8-1)  نحوه استحصال اسپرم از اپیدیدم

پس از تشریح موش ها، اپی دیدیم از بافت بیضه جدا گردید. بلافاصله پس از جداسازی، اپی دیدیم عاری از بافت های مجاور درون پتری دیش های حاوی یک میلی لیتر محیط کشت HTF + 4 میلی گرم آلبومین سرم گاوی  (BSA) قرار گرفت. سپس دم اپی دیدیم در داخل محیط کشت به قطعات کوچک خرد گردید و به مدت30 دقیقه در انکوباتور باقی ماند تا امکان خروج اسپرم ها از اپی دیدیم فراهم آید. لازم به ذکر است که برای جلوگیری از ایجاد شوک حرارتی و آسیب به اسپرم ها، تمام وسایل مورد استفاده و محیط کشت قبل از مصرف و شروع عملیات در انکوباتور 37 درجه قرار داده شدند.

2-8-2) شمارش اسپرم­ها :

5 میکرولیتر از مایع منی با 95 میکرولیتر محلول رقیق کننده(0.35% فرمالین، 5% بیکربنات سدیم و 0.25% رنگ تریپان بلو ) رقیق گردید. 10 میکرولیتر از سوسپانسیون حاصل بر لام نئوبار منتقل گردید و تعداد اسپرم­ها در هر میلی لیتر با بهره گرفتن از فرمولd  ×۵۰۰۰۰ n ×و توسط میکروسکوپ نوری با درشت نمایی ۴۰۰ برابر محاسبه گردید؛ که n تعداد اسپرم­های شمارش شده و d عکس رقت سوسپانسیون حاوی اسپرم می­باشد (Zambrano et al, 2005)

2-8-3) ارزیابی قابلیت زنده ماندن اسپرم ها

برای ارزیابی درصد اسپرم­های مرده، رنگ­­آمیزی ائوزین- نگروزین مورد استفاده قرار گرفت­. بدین منظور 20 میکرولیتر از مخلوط ائوزین 0.05% و نگروزین به حجم برابری از سوسپانسیون اسپرم اضافه شد. مبنای تشخیص اسپرم­های مرده در این روش رنگ­آمیزی بر این اصل استوار است که در اثر آسیب به غشاء پلاسمایی، اسپرم­ها در بر­ابر رنگ مذکور نفوذپذیر می­گردند. لذا آن دسته از اسپرم­هایی که هر یک از قطعات سر، گردن و یا دم آنها رنگ گرفته بود به عنوان اسپرم­های مرده در نظر گرفته شدند. تعداد ۲۰۰ اسپرم برای هر نمونه با درشت­نمایی ۴۰۰ برابر مورد بررسی قرار گرفت و نتایج حاصل در قالب درصد بیان شدند (Wyrobek et al., 1983).

2-8-4) بررسی تحرک اسپرماتوزوئیدها

برای این منظور، ۱۰ میکرولیتر از محلول رقیق شده اسپرم بر روی لام قرار داده شد. شمارش اسپرم­های متحرک با حرکت های سریع(RPFM) ، آهسته (SPFM)، حرکت درجا (RM) و غیر متحرک (ML) در چند میدان دید و در سه مرحله با بهره گرفتن از میکروسکوپ نوری و بزرگنمایی 400 صورت گرفت و درصد اسپرم­های متحرک بدست آمد (World Health Organization 2010)

2-8-5) بررسی وضعیت بلوغ هسته اسپرم: رنگ آمیزی آنیلین بلو (AB)

پروتئین هیستون دارای تعداد زیادی اسیدآمینه لیزین می­باشد که با رنگ­های اسیدی مانند آنیلین بلو واکنش می­دهد و آبی رنگ می­شود. بنابراین اسپرم­هایی که پس از تراکم در کروماتین خود، دارای هیستون­های اضافی باشند با این رنگ آمیزی مشخص می­شوند. پس از تهیه اسمیر از هر نمونه حیوانی و خشک شدن در هوا، مرحله فیکس شدن نمونه­ها توسط فیکساتیو گلوتارآلدئید ۳% در بافر به مدت ۳۰ دقیقه انجام شد. در مرحله بعد نمونه­ها توسط محلول ۵% آنیلین بلو در اسید استیک ۴% (۵/۳=PH) به مدت ۵ دقیقه رنگ­ آمیزی شدند. پس از شستشو با آب مقطر، لام­ها با میکروسکوپ نوری و عدسی 100× مورد بررسی قرار داده و با شمارش ۱۰۰ اسپرم، درصد اسپرم بی­رنگ (نابالغ) تعیین گردید. (Hamadeh et al., 2001)

 

2-8-6)  بررسی DNA شکسته و یا تک رشته ای: رنگ آمیزی آکریدین اورانژ (AO)

رنگ فلورسنت، جهت تمایز DNA دو رشته ای سالم از DNA تک رشته ای ناسالم و دناتوره بکار میرود. AO با DNA دو رشته ای سالم زیر میکروسکوپ فلورسنت سبزرنگ و با DNA تک رشته ای دناتوره زرد تا قرمز رنگ می شود( 11 Varghese et al.,20). پس از تهیه اسمیر از هر نمونه و خشک کردن در هوا، فیکس شدن نمونه ها توسط محلول کارنوی(متانول: اسید استیک:1:3 ) به مدت حداقل 2ساعت صورت گرفت و سپس رنگ AO تازه با غلظت 19/0 میلی گرم در بافر سیترات فسفات به مدت 10 دقیقه برای رنگ آمیزی لام ها بکار رفت. پس از شستشو توسط آب مقطر، لام ها توسط میکروسکوپ فلورسنت و در یک محیط تاریک با فیلتر nm 460 بررسی شدند. برای هر پروتکل 400 اسپرم مورد بررسی قرار گرفت. ( 08 Rezvanfar et al, 20).

 

 

2-9) سنجش فاکتورهای بیوشیمیایی

2-9-1)  روش اندازه گیری مالون دی آلدئید :

برای این منظور یک گرم از بافت بیضه در بافر فسفات صفر درجه سانتیگراد 0.05 مولار با 7.4=ph و با غلطت 10 درصد (w/v) هموژنیژه گردید و سپس محلولهای حاصل با دور g 1000 سانتریفیوژ گردید. مایع رویی جهت میزان تولید محصولات پراکسیداسیون لیپید مورد استفاده قرار گرفت. درجه پراکسیداسیون لیپیدها بر مبنای میزان تشکیل مالون دی آلدئید (MDA) تعیین میگردد. مالون دی آلدئید محصول نهایی پراکسیداسیون اسیدهای چرب است و با تیوباربیتوییک اسید (TBA)وارد واکنش شده و کمپلکس رنگی ایجاد میکند. اساس روش اندازه گیری اسپکتروفتومتریک رنگ ایجاد شده بر اثر واکنش TBA با  MDA میباشد. بدین منظور300 میکرولیتر تری کلریک اسید 10 درصد به 150 میکرولیتراز محلول رویی نمونه سانتریفیوژ شده اضافه شده و به مدت 10 دقیقه با دور g 1000 در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفوژگردید. 300 میکرولیتر از محلول رویی به لوله آزمایش منتقل و با 300 میکرولیتر از تیوباربیتوریک اسید0.67% در دمای 100 درجه سانتیگراد برای 25 دقیقه انکوبه شد.5  دقیقه بعد از خنک شدن محلول ، رنگ صورتی ناشی از واکنش  TBA-MDA ظاهر و به کمک اسپکتروفتومتر در طول موج  535 نانومتر ارزیابی گردید. غلظت MDA بصورت nmol/g wet tissue بیان شد(Hosseinzade et al., 2005).

 

 

 

 

 

2-9-2) روش اندازه گیری قدرت آنتی اکسیدانی کل(FRAP):

قدرت آنتي اکسیدانی کل بافت بیضه با اندازه گيري قدرت احياء كنندگي/ آنتي اكسيداني فريك (FRAP:Ferric Antioxidant Power) محاسبه گردید. در روز آنالیز بافت ها در محلول KCL سرد (5/1%) برای گرفتن 10% سوسپانسیون هموژنی، هموژنیزه شده و برای ارزیابی بیوشیمیایی استفاده شدند.

ارزیابی FRAP تغییر در جذب 593 نانومتر را بواسطه تشکیل ترکیب  Fen– Tripyridyltriazine آبی رنگ از Fem اکسید شده بی رنگ توسط عمل آنتی اکسیدانت های دهنده الکترون را اندازه میگیرد (Iris& Strain, 1996).

معرف FRAP شامل :

محلول1: شامل بافر استات 300 میلی مولار (g3/1 سدیم استات +ml16 اسید استیک در یک لیتر آب مقطر6/3PH: )

محلول2: TPTZ 10 میلی مولار در HCL 40 میلی مولار

محلول3: Fecl3.6H2O 20 میلی مولار در آب مقطر که این 3 محلول تهیه شده به نسبت 1:1:10 با هم مخلوط گردیدند. محلول معرف شامل ml25 محلول 1، ml2.5 محلول 2 و ml5/2 محلول 3 می باشد. محلول معرف باید همیشه به تازگی تهیه شود. 50 میکرولیتر محلول هموژنیزه بافت به 5/1  میلی لیتر محلول تازه آماده شده و از قبل گرم شده(37 درجه سانتی گراد) معرف FRAP  در لوله آزمایش اضافه و سپس در 37 درجه ساتی گراد برای 10 دقیقه انکوبه گردید. جذب کمپلکس آبی رنگ علیه محلول بلانک در 593 نانومتر خوانده میشود. واکنش برای 5 دقیقه بررسی میشود. معرف بلانک شامل5/1 میلی لیتر معرف FRAP + 50 میکرولیتر آب مقطر می باشد. محلول استاندارد Fen در رنج 100 به 1000 میلی مول از فروس سولفات Feso4-7H2O در آب مقطر آماده می شود. داده ها بر اساس میلی مول یون فریک کاهش یافته به فرم فروس در لیتر بیان می شود (Iris& Strain, 1996; Hosseinzade et al, 2005).

2-9-3) روش اندازه گیری فعالیت آنزیم کاتالاز:

فعاليت كاتالاز بر اساس توانایی آن در تجزیه H2O2  در بافت هموژنیزه شده بیضه تعیین گردید. تجزیهH2O2 با کاهش جذب  در طیف جذبی 240 نانومتر قابل بررسی می باشد. تفاوت در جذب در واحد زمان معادل مقدار فعالیت کاتالاز است. برای این منظور از پراکسید هیدروژن 30 میلی مولار به عنوان سوبسترا و از بافر فسفات 50 میلی مولار با  7.4=PH به عنوان جایگزین سوبسترا در محلول بلانک استفاده شد. محلول سنجش محتوی 2 میلی لیتر محلول هموژنای بافتی و 1 میلی لیتر محلول پراکسید هیدروژن میباشد. واکنش با افزودن H2O2 شروع شد وکاهش در جذب به کمک اسپکتروفتومتر در طول موج 240 نانومتر به مدت 30 ثانیه بررسی و در پایان مقادیر بر حسب  U/g tissue بیان گردید(Havir &Mellate, 1987).

2-10) اندازه گیری تستوسترون سرمی

برای اندازه گیری غلظت تستوسترون سرمی از روش الایزا استفاده گردید. این کار با کمک دستگاه الایزا ریدر  Staff fax 3200 ساخت کمپانی آمریکا Avernes و کیت شرکت مونوباین انجام گردید.

2-11) مطالعات هیستوشیمیایی بیضه

2-11-1) رنگ آمیزی آهن وایگرت

به منظور مطالعه بافت بیضه، روش رنگ آمیزی آهن وایگرت مورد استفاده قرار گرفت. در این روش رشته های کلاژن به رنگ قرمز، عضلات و پوشش های شاخی به رنگ زرد و هسته ها به رنگ آبی تا سیاه قابل مشاهده هستند.

2-11) آنالیز و تحلیل داده ها

محاسبه آماری با بهره گرفتن از نرم افزار آماری SPSS نسخه 19 و با بهره گرفتن از روش آنالیز One-way ANOVA  به طرقDuncan و Tukey  انجام گرفت. (p<0.05) به عنوان معیار معنی دار بودن اختلاف ها در نظر گرفته شد.

 

 

– In Vitro Fertilization 

Transgenic

[3]Parthenogenesis

1-Intra peritoneal

متن کامل پایان نامه ها در 40y.ir