پایان نامه ها

پایان نامهi– (171)

معاونت پژوهش و فناوری
به نام خدا
منشور اخلاق پژوهش
باياری‌از خداوند سبحان ‌و‌اعتقاد به‌اين‌که ‌عالم محضرخداست ‌و همواره ‌ناظر بر اعمال ‌انسان و به‌منظور پاس داشت مقام بلنددانش ‌و‌پژوهش ‌و نظر به اهميت جايگاه دانشگاه در اعتلای فرهنگ و تمدن بشری، ما دانشجويان و اعضاءهيات‌علمی واحدهای‌دانشگاه‌آزاداسلامی متعهد می‌گرديم اصول زيررا درانجام فعاليت‌های پژوهشی مدنظر قرار داده و از آن تخطی نکنيم:
1- اصل برائت: الترام به برائت‌جویی از هرگونه رفتار غیرحرفه‌ای و اعلام موضع نسبت به کسانی که حوزه علم و پژوهش را به شائبه‌های غیرعلمی می‌آلایند.
2- اصل رعایت انصاف و امانت: تعهد به اجتناب از هرگونه جانب‌داری غیر علمی و حفاظت از اموال، تجهیزات و منابع در اختیار.
3- اصل ترویج: تعهد به رواج دانش و اشاعه نتایج تحقیقات و انتقال آن به همکاران علمی و دانشجویان به غیر از مواردی که منع قانونی دارد.
4- اصل احترام: تعهد به رعایت حریم و حرمت‌ها در انجام تحقیقات و رعایت جانب نقد و خودداری ازهرگونه حرمت شکنی.
5- اصل رعایت حقوق: التزام به رعایت کامل حقوق پژوهشگران و پژوهیدگان (انسان، حیوان، نبات) و سایر صاحبان حق.
6- اصل رازداری: تعهد به صیانت از اسرار و اطلاعات محرمانه افراد، سازمان‌ها و کشور و کلیه افراد و نهادهای مرتبط با تحقیق.
7- اصل حقیقت جویی: تلاش در راستای پی‌جویی حقیقت و وفاداری به آن و دوری از هرگونه پنهان سازی حقیقت.
8- اصل مالکیت مادی و معنوی: تعهد به رعایت کامل حقوق مادی و منعوی دانشگاه و کلیه همکاران پژوهش.
9- اصل منافع ملی: تعهد به رعایت مصالح ملی و در نظر داشتن پیشبرد و توسعه کشور در مراحل پژوهش.
فرم تصویب پایان نامه
یرفع الله الذی آمنوا منکم والذین اوتوالعلم درجات
قرآن کریم
کارشناسی ارشد خانم سیده مریم شاکری با عنوان القاء موتاسیون نقطه‌ای با استفاده از EMS در گیاه بادرنجبویه Melissa officinalis در جلسه مورخه13/6/92 تحت نظارت شورای پایان نامه متشکل از استادان زیر با درجه و نمره مورد تایید قرار گرفت.
1- استاد راهنما: دکترسیدکمال کاظمی تبار امضاء
2- استاد مشاور: دکترجعفرمسعود سینکی امضاء
3- داور خارج از گروه: دکترمجید معصومیان امضاء
دکتر شهرام رضوان بیدختی
معاون پژوهشی دانشگاه آزاد اسلامی
واحد دامغان

دانشگاه آزاد اسلامی
واحد دامغان
دانشکده‌کشاورزی
پايان نامه برای دريافت درجه کارشناسی ارشد
رشته مهندسی کشاورزی بيوتکنولوژی کشاورزی
گرايش کشاورزی
عنوان
القاء موتاسيون نقطه‌ای با استفاده از EMS در گياه بادرنجبويه Melissa officinalis
استاد راهنما
دکترسيدکمال کاظمی‌تبار
استاد مشاور
دکترجعفرمسعودسينکی
نگارنده
سيده مريم شاکری
شهريور 1392
سپاسگزاری
با سپاس بیکران و شکر بی‌انتها به درگاه ذات اقدس الهی، که توفیق انجام این رساله را به بنده حقیر داد و با حمد و ثنای او که هر قدر زیاد باشد، باز در مقابل لطف او اندکی بیش نیست.
سپاس بی‌کران پروردگار یکتا را که هستی‌مان بخشید و به طریق علم و دانش رهنمون‌مان شد و به همنشینی رهروان علم و دانش مفتخرمان نمود و خوشه‌چینی از علم و معرفت را روزی‌مان ساخت. 
هر چند واژه‌ها را یارای آن نیست که لطف، محبت و بزرگواری کسانی را که در تمام دوران زندگیم جرعه نوش دریای بی‌کران مهر و محبت‌شان بوده‌ام را به تصویر بکشم، به رسم ادب و احترام، بوسه بر دست‌شان زده و بر خود واجب می‌دانم زحمات کلیه اساتید بزرگوارم را ارج نهاده و مراتب تشکر قلبی خویش را از الطاف و مهربانی‌های آن‌ها ابراز نمایم.
از زحمات، راهنمایی‌ها و مشاوره‌های ارزشمند اساتید علم و ادب و اخلاق جناب آقای دکتر سیدکمال کاظمی‌تبار و دکتر جعفر مسعودسینکی که با راهنمایی‌ها و نظرات گوهربار خود راه‌گشای اینجانب بوده‌اند، کمال تشکر را دارم. بی‌شک انجام این پژوهش بدون کمک فکری، همـکاری و همـدلی این اساتید متواضـع و اندیشمند غیـر ممـکن می‌نمود و همنشینی و شاگردی ایشان را که از بزرگترین افتخارات و شیرین‌ترین لحظات زندگی‌ام می‌باشد، منت‌دار محبت‌های کارساز این عزیزان هستم.
از صبر و بردباری استاد بزرگوارم دکترمجید معصومیان که زحمت مطالعه و داوری این پایان‌نامه را بر عهده داشتند بسیار سپاسگزارم.
از برادر عزیزم جناب آقای مهندس امین صادقی و مهندس سعید قریب بلوک به خاطر لطف‌هایی که در حق من کرده‌اند بی‌نهایت سپاس گزارم.
فهرست مطالب
صفحه عنوان
1 چکیده………………………………………………………………………………………………………………………..
فصل اول: مقدمه و کلیات
2 1-1 مقدمه………………………………………………………………………………………………………………….
4 1-1-1 اهمیت موضوع…………………………………………………………………………………………………
4 1-1-2 فرضیات………………………………………………………………………………………………………….
5 1-1-3 اهداف پژوهش…………………………………………………………………………………………………
5 1-1-4 ساختارپژوهش…………………………………………………………………………………………………
6 1-2 کلیات………………………………………………………………………………………………………………….
6 1-2-1 گیاه شناسی……………………………………………………………………………………………………..
7 1-2-2 رویش و تکثیر گیاه…………………………………………………………………………………………..
7 1-2-3 خواستگاه و دامنه انتشار…………………………………………………………………………………….
7 1-2-4 نیازهای اکولوژی………………………………………………………………………………………………
8 1-2-5 اهمیت دارویی…………………………………………………………………………………………………
8 1-2-6 مواد موثره و اجزاء اسانس…………………………………………………………………………………
9 1-2-7 استفاده‌ها…………………………………………………………………………………………………………
9 1-2-8 کشت بافت گیاهی……………………………………………………………………………………………
11 1-2-8-1 تاریخچه کشت بافت گیاهی…………………………………………………………………………..
12 1-2-9 کاربردهای کشت بافت گیاهی…………………………………………………………………………….
12 1-2-9-1 تولید مواد شیمیایی……………………………………………………………………………………….
12 1-2-9-2 ایجاد گیاه عاری از عوامل بیماری‌زای گیاهی……………………………………………………
12 1-2-9-3 ایجاد تنوع ژنتیکی………………………………………………………………………………………..
12 1-2-9-4 کاربرد کشت بافت گیاهی در کشاورزی،باغبانی و جنگل‌داری…………………………….
13 1-2-9-5 کاربردهای اقتصادی کشت بافت گیاهی…………………………………………………………..
13 1-2-9-6 کاربردهای کشت بافت گیاهی در مهندسی ژنتیک و فناوری زیستی…………………….
صفحه عنوان
14 1-2-9-7 انواع کشت بافت گیاهی………………………………………………………………………………..
14 1-2-9-8 بررسی اثرات فاکتورهای مختلف در محیط کشت…………………………………………….
15 1-2-9-9 نمک‌های غیرآلی………………………………………………………………………………………….
15 1-2-9-10 ویتامین‌ها…………………………………………………………………………………………………..
16 1-2-9-11 هورمون‌های گیاهی…………………………………………………………………………………….
16 1-2-9-11-1 اکسین‌ها………………………………………………………………………………………………..
17 1-2-9-11-2 سیتوکنین‌ها……………………………………………………………………………………………
18 1-2-9-12 منبع انرژی…………………………………………………………………………………………………
18 1-2-9-13 عوامل فیزیکی……………………………………………………………………………………………
18 1-2-9-14 مواد آلی…………………………………………………………………………………………………….
19 1-2-9-15 ریزنمونه……………………………………………………………………………………………………
19 1-2-9-16 PH………………………………………………………………………………………………………….
19 1-2-9-17 آب…………………………………………………………………………………………………………..
20 1-2-9-18 آگار………………………………………………………………………………………………………….
20 1-2-9-19 چگونگی انتخاب محیط کشت……………………………………………………………………..
20 1-2-10 ریزازدیادی گیاهان از طریق کشت بافت…………………………………………………………….
21 1-2-10-1 موارد استفاده از ریزازدیادی…………………………………………………………………………
22 1-2-11ریشه‌زائی………………………………………………………………………………………………………..
22 1-2-12 تعریف موتاسیون (جهش)……………………………………………………………………………….
22 1-2-12-1 تاریخچه استفاده از موتاسیون……………………………………………………………………….
23 1-2-12-2 انواع موتاسیون…………………………………………………………………………………………..
23 1-2-12-3 موتاژن………………………………………………………………………………………………………
24 1-2-12-3-1 انواع موتاژن…………………………………………………………………………………………..
24 1-2-12-3-2 عوامل شیمیایی جهش‌زا…………………………………………………………………………..
25 1-2-12-4 سطوح ایجاد موتاسیون………………………………………………………………………………..
صفحه عنوان
26 1-2-12-5 مواد گیاهی مورد تیمار………………………………………………………………………………..
26 1-2-12-6 اهمیت موتاسیون در اصلاح نباتات……………………………………………………………….
26 1-2-12-7 هدف موتاسیون مصنوعی…………………………………………………………………………….
27 1-2-12-8 موفقیت موتاسیون………………………………………………………………………………………
27 1-2-12-9 اصلاح به روش موتاسیون……………………………………………………………………………
27 1-2-12-10 روش‌های جدید استفاده از موتاسیون………………………………………………………….
28 1-2- 13اسانس گیاهی…………………………………………………………………………………………………
29 1-2-13-1روغن‌های اسانس………………………………………………………………………………………..
30 1-2-13-2 جداسازی و شناسایی مواد تشکیل دهنده روغن اسانسی گیاه……………………………
فصل دوم: مروری بر تحقیقات انجام شده
31 2-1 اثر موتاژن‌ها در ایجاد تنوع در صفات مختلف………………………………………………………….
33 2-2 اثر موتاسیون اتیل متیل سولفانات در ایجاد تنوع در سطوح مختلف……………………………..
38 2-3 کشت بافت………………………………………………………………………………………………………….
فصل سوم: مواد و روش‌ها
40 3-1 مواد گیاهی…………………………………………………………………………………………………………..
40 3-2 کشت بافت………………………………………………………………………………………………………….
40 3-2-1 تهیه محلول ذخیره محیط‌های کشت……………………………………………………………………
41 3-2-1-1 تهیه محلول ذخیره ماکرو……………………………………………………………………………….
41 3-2-1-2 تهیه محلول ذخیره عناصر میکرو…………………………………………………………………….
43 3-2-1-3 تهیه محلول ذخیره آهن-سدیم……………………………………………………………………….
43 3-2-1-4 تهیه محلول ذخیره ویتامین…………………………………………………………………………….
44 3-2-2 تهیه محیط کشت………………………………………………………………………………………………
45 3-2-3 کار در اتاقک کشت بافت…………………………………………………………………………………..
46 3-2-4 ضدعفونی وسایل آزمایشگاهی، محیط کشت و مواد گیاهی……………………………………
46 3-2-4-1 ضدعفونی نمونه‌های گیاهی……………………………………………………………………………
صفحه عنوان
46 3-2-3-1 ضدعفونی اندام گیاه……………………………………………………………………………………..
47 3-2-5 تهیه ریزنمونه……………………………………………………………………………………………………
47 3-2-6 بهینه سازی محیط کشت……………………………………………………………………………………
47 3-2-7 بررسی نمونه‌های کشت شده…………………………………………………………………………….
47 3-2-8 بازیافت کشت‌های آلوده……………………………………………………………………………………
48 3-2-9 تیمارهای مورد استفاده………………………………………………………………………………………
48 3-2-9-1 روش تهیه استوک EMS …………………………………………………………………………….
49 3-2-9-2 روش اعمال تیمارهای EMS در گیاه کشت بافتی……………………………………………
49 3-2-9-3 روش اعمال تیمارهای EMS در مزرعه………………………………………………………….
50 3-2-9-4 روش شستشوی تیمارها………………………………………………………………………………..
50 3-3 تهیه مواد گیاهی برای اسانس‌گیری………………………………………………………………………….
50 3-4 آنالیز اجزاء اسانس………………………………………………………………………………………………..
51 3-5 تجزیه داده‌های آماری……………………………………………………………………………………………
فصل چهارم: نتایج و بحث
52 4-1 کشت بافت………………………………………………………………………………………………………….
55 4-2 تاثیر EMS برروی خصوصیات مرفولوژیکی گیاه…………………………………………………….
56 4-2-1 ضریب همبستگی بین صفات و خصوصیات مورد بررسی……………………………………..
56 4-2-2 اثر دوز EMS و زمان برروی تعداد ریشه جانبی………………………………………………….
57 4-2-3 اثر دوز EMS و زمان برروی طول ریشه…………………………………………………………….
57 4-2-4 اثر دوز EMS و زمان برروی تعداد ریشه……………………………………………………………
58 4-2-5 اثر دوز EMS و زمان برروی تعداد برگ…………………………………………………………….
58 4-2-6 اثر دوز EMS و زمان برروی تعداد جوانه…………………………………………………………..
59 4-2-7 اثر دوز EMS و زمان برروی طول ساقه……………………………………………………………..
60 4-2-8 اثر دوز EMS و زمان برروی متوسط طول برگ………………………………………………….
60 4-3 استخراج اسانس……………………………………………………………………………………………………
صفحه عنوان
60 4-3-1 آنالیز و شناسایی کمی و کیفی اجزای موجود در اسانس…………………………………………
61 4-3-2 نتایج مربوط به طیف کروماتوگرام گازی گیاه……………………………………………………….
62 4-3-3 ترکیبات تشکیل دهنده اسانس……………………………………………………………………………
فصل پنجم: نتیجه‌گیری
63 5-1 بحث…………………………………………………………………………………………………………………..
63 5-1-1 کشت بافت گیاهی……………………………………………………………………………………………
64 5-1-2 اثرات موتاژن EMS ……………………………………………………………………………………….
68 5-2 نتیجه‌گیری…………………………………………………………………………………………………………..
69 5-3 پیشنهادات……………………………………………………………………………………………………………
70 فهرست منابع فارسی…………………………………………………………………………………………………….
74 فهرست منابع انگلیسی………………………………………………………………………………………………….
86 چکیده انگلیسی……………………………………………………………………………………………………………
فهرست جداول
صفحه عنوان جدول
41 جدول 3-1 جدول عناصر کم مصرف MS با غلظت X100…………………………………………….
42 جدول 3-2 ترکیبات محیط کشت پایه MS…………………………………………………………………….
43 جدول 3-3 جدول عناصر پرمصرف MS با غلظت X10…………………………………………………
43 جدول 3-4 محلول ذخیره آهن، ویتامین و اسیدهای آمینه با غلظت X100………………………….
51 جدول 3-5 شرایط دستگاه GC-MS……………………………………………………………………………
56 جدول 4-1 ضریب همبستگی بین صفات و خصوصیات مورد بررسی در گیاه بادرنجبویه…….
56 جدول 4-2 تجزیه واریانس اثر متقابل دوزEMS و زمان برروی تعداد ریشه جانبی……………..
57 جدول 4-3 تجزیه واریانس اثر متقابل دوزEMS و زمان برروی طول ریشه……………………….
57 جدول 4-4 تجزیه واریانس اثر متقابل دوزEMS و زمان برروی تعداد ریشه………………………
58 جدول 4-5 تجزیه واریانس اثر متقابل دوزEMS و زمان برروی تعداد برگ در ساقه……………
58 جدول 4-6 تجزیه واریانس اثر متقابل دوزEMS و زمان برروی تعداد جوانه……………………..
59 جدول 4-7 تجزیه واریانس اثر متقابل دوزEMS و زمان برروی طول ساقه………………………..
60 جدول 4-8 تجزیه واریانس اثر متقابل دوزEMS و زمان برروی متوسط طول برگ……………..
62 جدول 4-9 میزان مواد موثره موجود در اسانس بادرنجبویه……………………………………………….
فهرست شکل‌ها
صفحه عنوان شکل
6 شکل 1-1 شمائی از گیاه کامل بادرنجبویه………………………………………………………………………
16 شکل 1-2 ساختار تعدادی از اکسین‌ها……………………………………………………………………………
17 شکل 1-3 ساختار تعدادی از سیتوکنین‌ها……………………………………………………………………….
25 شکل 1-4 ساختار شیمیایی مواد جهش‌زا………………………………………………………………………..
30 شکل 1-5 دستگاه کروماتوگرافی گازیGC/MS……………………………………………………………
61 شکل 4-1 کروماتوگرام گازی اسانس بادرنجبویه……………………………………………………………..
65 شکل 5-1 مراحل رشد گیاه در محیط پایه MS………………………………………………………………
66 شکل 5-2 مراحل رشد گیاهان مورد تیمار موتاژن در محیط کشت…………………………………….
67 شکل 5-3 تیمار اعمال شده در مزرعه…………………………………………………………………………….
81 شکل الف-1 مراحل ضدعفونی گیاه……………………………………………………………………………….
82 شکل الف-2 تهیه ریزنمونه……………………………………………………………………………………………
82 شکل ب-1کشت ریزنمونه و مراحل انجام کار………………………………………………………………..
83 شکل ب-2 نمونه های کشت شده قرارگرفته در ژرمیناتور………………………………………………..
83 شکل ج-1 شستشوی تیمارهای کشت بافتی از EMS……………………………………………………..
84 شکل ج-2 اعمال EMS در مزرعه………………………………………………………………………………..
85 شکل د-1 مراحل اسانس‌گیری………………………………………………………………………………………
85 شکل د-2 دستگاه روتاری…………………………………………………………………………………………….
فهرست نمودارها
صفحه عنوان نمودار
52 نمودار4-1 طول ساقه…………………………………………………………………………………………………..
53 نمودار4-2 طول ریشه…………………………………………………………………………………………………..
53 نمودار4-3 تعداد برگ در ساقه………………………………………………………………………………………
54 نمودار4-4 تعداد ریشه جانبی………………………………………………………………………………………..
54 نمودار4-5 تعداد جوانه در ساقه…………………………………………………………………………………….
55 نمودار4-6 متوسط طول برگ………………………………………………………………………………………..
59 نمودار4-7 اثر غلظت EMS برروی تعداد جوانه گیاه بادرنجبویه………………………………………
فهرست علامت‌ها و اختصارها
معادل فارسی معادل انگلیسی علامت
اتیل متیل سولفانات Ethyl Methane Sulfonate EMSکروماتوگرافی گازی توام با طیف سنجی جرمی Gas ChromatograpHy Mass Spectroscopy GC-MS
اتیل اتان سولفانات Ethyl Ethane Sulfonate EES
بنزیل آدنین Benzyladenine BA
بنزیل آمینوپورین Benzylaminopurine BAP
ایندول-3- استیک اسید Indole3-acetic acid IAA
ایندول-3- بوتیریک اسید Indole3-butric acid IBA
نفتالین استیک اسید 1-NapHthaleneacetic acid NAA
چکیده
بادرنجبویه با نام علمی Melissa officinalis یکی از انواع گیاهان دارویی می‌باشد که به دلیل تولید اسانس‌های با ارزش در صنایع داروسازی و بهداشتی استفاده‌های فراوانی دارد. این پژوهش با قرار دادن ريز نمونه‌هاي بادرنجبویه به محيط کشت درون شیشه‌ای MS انجام شد و هدف تکثیر گیاه از طریق کشت بافت برای استفاده از تاثیر موثرتر ماده جهش‌زا و بدست آوردن نمونه‌های گیاهی جدید موتانت شده هم از طریق کشت بافت و هم در محیط مزرعه و بررسی تغییرات میزان مواد موثره اسانس موجود در گیاه در اثر ماده جهش‌زای اتیل متیل سولفانات (EMS) می‌باشد. این آزمایش هم بصورت مزرعه‌ای و هم بصورت آزمایشگاهی (کشت بافتی) مورد بررسی قرار گرفت. در تیمارهای آزمایشگاه، سرشاخه‌های رشد یافته در محیط MS بدون هورمون را با غلظت‌های 0/0% (به عنوان شاهد)، 05/0% و 01/0% و 005/0% EMS و در مدت زمان‌های 24 و48 ساعت اعمال شدند. در قسمت مزرعه‌ای نیز از همین غلظت‌ها و زمان‌ها استفاده شدند. فاکتورهای مختلف مورفولوژیک از قبیل طول ساقه، طول ریشه، تعداد جوانه در ساقه، تعداد ریشه رونده جانبی، طول برگ و تعداد برگ در ساقه مورد ارزيابي قرار گرفته و پاسخ معنی‌داری را در سطح 5 درصد نشان دادند اين آزمايش نشان داد كه استفاده از مواد جهش‌زا در محیط کشت MS نقش بسزایی در تغییر مرفولوژیک این گیاه دارویی دارد. بهترین نتیجه نیز از کشت ریزنمونه‌های که شامل جوانه‌های جانبی و انتهایی بوده‌اند و تحت تیمار با غلظت 01/0% EMS بودند به‌دست آمد. آنالیز اسانس تیمارها نیز انجام شد که نتیجه آن بی‌اثر بودن این ماده اتیل متیل سولفانات روی مواد اجراء اسانس این گیاه بوده است.
کلمات کلیدی: بادرنجبویه (Melissa officinalis)، کشت درون شیشه‌ای، محیط کشت MS، اتیل متیل سولفانات(EMS)، مواد موثره
فصل اول
مقدمه و کلیات
1-1 مقدمه:
گیاهان دارویی فراوانی در کشور ما می‌رویند که بسیاری از آن‌ها دارای طیف وسیعی از خواص دارویی می‌باشند و در بسیاری از نقاط کشور رشد می‌یابند. برهمین اساس بررسی و مطالعه گیاهان دارویی ایران با استفاده از ابزارهای امروزی ضروری به نظر می‌رسد. در حال حاضر در قرن 21، طب گیاهی از جایگاه خاصی برخوردار است به گونه‌ای که در اتحادیه اروپا قوانینی مبنی بر لزوم انجام آزمایشات بالینی برروی گیاهان دارویی همانند داروهای شیمیایی وضع کرده است که بر اساس آن تمام داروهای گیاهی باید مجوز دریافت نمایند. اولین استفاده از گیاهان دارویی در خاورمیانه و مربوط به عصر پارینه سنگی است. شواهد استفاده از گیاهان دارویی توسط انسان به حدود شصت هزار سال پیش می‌رسد.
گیاهان به عنوان یکی از اجزاء طبیعت، از دیرگاه پشتوانه غنی نیازهای بشری بوده‌اند و می‌توان با اطمینان گفت تا زمانی که انسان در این کره خاکی به سر می‌برد، به گیاهان نیاز دارد (سلیمان زاده، 1377).
در بحث گیاهان دارویی، محدودیت‌های کاشت و نگهداری آن‌ها متعدد می‌باشد که از آن جمله می‌توان به کوتاه بودن فصل کاشت و یا برداشت بعضی از گونه‌های گیاهی، کمبود زمین‌های مناسب جهت داشت، ناچیز بودن مواد موثره حاصل از گیاه و غیره اشاره کرد (ثقه الاسلام و موسوی، 1385).
یکی از راه‌های رفع این محدودیت‌ها کشت بافت گیاهی است. تکنیک‌های کشت بافت گیاهی درحال حاضر به عنوان یک ابزار قوی جهت رفع مشکلات اساسی و کاربردی بیولوژی گیاهی درآمده است.
استفاده از گیاهان به عنوان دارو از زمان‌های خیلی دور در معالجه انسان و دام مرسوم بوده است. در حال حاضر حدود یک سوم داروهای مورد استفاده دارای منشاء گیاهی می‌باشند. کشورهای آسیایی بخصوص هند، چین و ایران سابقه بسیار طولانی دراین زمینه دارند. این گیاهان مواد زیستی بخصوص و فعال با مقادیر بسیار کم تولید می‌کنند که تحت عنوان متابولیت‌های ثانویه نام‌گذاری می‌شوند.در عصر جدید، دانشمندان علوم گیاهی با استفاده از آخرین تکنیک‌های عملی کشت بافت گیاهی، توانسته‌اند از انواع گیاهان ترکیب‌های بسیار مفیدی را جهت مداوای بیماری‌های سخت و غیر قابل مداوا و موارد استفاده دیگر، بدست آورند. در طی چند دهه اخیر روش‎های متفاوتی با استفاده از بیوتکنولوژی درزمینه پرورش محصولات گیاهی برتر ابداع شده است که از جمله آن‌ها می‌توان روش‌های ایجاد گونه‌های جهش یافته و پلی پلوئید را نام برد.
کشت سلول و بافت که به عنوان کشت درون شیشه‌ای و یا کشت استریل نیز مطرح می‌شود، ابزاری مهم در مطالعات پایه و کاربردی بوده و دارای کاربردهای تجاری است (رجب بیگی و همکاران، 1385؛ سونانداکوماری و همکاران، 2003). یکی از این کاربردها امکان ایجاد گیاهان ترانسژنیک با وارد کردن DNA تقریبا از هر منبع دیگری می‌باشد. شاید اولین قدم در زمینه کشت بافت گیاهی در سال 1756 توسط هنری لوئیس داهامل برداشته شد، زمانی که وی شاهد تشکیل کالوس در حین مطالعه مواد التیام دهنده زخم‌های گیاهی بود (غضنفری، 1994).
اساس تئوری کشت بافت گیاهی توسط گتلیت هابرلنت از آکادمی علوم آلمان در سال 1902، بعد از آزمایش های وی روی کشت تک سلول ها پیشنهاد گردید (هابرلنت، 1902). توسعه روش‌های کشت بافت و زیست‌شناسی مولکولی برای تبادل DNA بین موجودات زنده غیر خویشاوند این امکان را می‌دهد که ژن‌های جدیدی از موجودات زنده خارج از سلسله گیاهی به درون گیاهان گیرنده وارد شوند. لذا مطالعه حاضر می‌تواند کمکی جهت بررسی و واکنش‌های گیاه بادرنجبویه نسبت به تکنیک‌های مختلف کشت بافت و باززائی این گیاه از طریق کشت بافت و اثر مواد جهش‌زائی همچون اتیل متیل سولفانات (EMS) باشد، تا محققین دیگر بتوانند به مطالعه خواص دارویی یا تغییرات لازم در مواد موثره یا فعال (متابولیت‌های ثانویه) و یا مطالعات انتقال ژن در این گیاه بپردازند.
1-1-1 اهمیت موضوع
برای انجام کشت بافت بادرنجبویه (Melissa officinalis L) از بخش‌های مختلف گیاه مانند ریشه، برگ، ساقه و گره استفاده شد (سونانداکوماری و همکاران، 2003؛ ساجانا و همکاران، 2011). با توجه به اینکه روش معمول اصلاح و بهبود تولید متابولیت‌های ثانویه در گیاهان دارویی شامل کاشت آن‌ها در مزرعه و سپس برداشت و استخراج این مواد به روش‌های شیمیایی و غیره با مشکلات متعددی نظیر شرایط محیطی و زراعی، صرف زمان، هزینه و استفاده نیروی کار زیاد و همچنین خطرنابودی برخی از گیاهان دارویی کمیاب روبرو است، استفاده از روش‌های نوین از جمله کشت درون شیشه‌ای (in vitro) ضرورت می‌یابد به همین منظور اولین بار در سال 1976 توسط زنیک تکنیک کشت سوسپانسیون سلول های گیاهی حاوی متابولیت‌های ثانویه انجام گرفت. البته در ارتقاء بیوسنتز متابولیت‌های دارویی در شرایط درون شیشه‌ای اغلب، گیاهانی انتخاب می‌شوند که بازده تولید متابولیت‌های با ارزش در آن‌ها بالا باشد (باقری و صفاری، 1387).
بادرنجبویه به عنوان یک گیاه دارویی شناخته می‌شود (امیدبیگی ،1386؛ هوشیار قیصر،1388). تاکنون مطالعات زیادی در مورد تعیین مواد موثره بادرنجبویه صورت گرفته است (رجحان،1362؛ زرگری،1369؛ مومنی وشاهرخی،1377؛ آزادبخت،1378). موارد مصرف و خواص دارویی آن نیز به خوبی مطالعه شده است اما مطالعات کشت بافت و ایجاد جهش زیاد نبوده است. همچنین با در نظر گرفتن اهمیت و خواص دارویی این گیاه، مطالعات کشت بافت، بهینه‌سازی محیط کشت جهت اهداف مختلف، مطالعه متابولیت‌های ثانویه ،انتقال ژن و مهندسی ژنتیک برای این گیاه ضرورت دارد.
1-1-2 فرضیات
* کشت بافت یکی از راه‌های سریع در ازدیاد انبوه بادرنجبویه می‌باشد.
* بادرنجبویه در محیط کشت همواره در دسترس برای اعمال هر گونه اعمال تیمار از قبیل جهش می‌باشد.
* ایجاد جهش تا چه میزانی می‌تواند بر روی مواد موثره و میزان اسانس تغییر ایجاد نماید.
1-1-3 اهداف پژوهش
در این پژوهش تلاش می شود اهداف زیر دنبال شود
*آشنایی با تکنیک کشت بافت گیاه دارویی بادرنجبویه و تکثیر آن در داخل شیشه.
* انتخاب بهترین و مناسب‌ترین نوع از انواع مخیط‌های مختلف کشت بافت
* بدست آوردن مقدار قابل توجه گیاه در حال رشد برای اعمال جهش نقطه‌ای در بادرنجبویه.
*بررسی تغییرات در خصوصیات مورفولوژیکی پس از اعمال جهش در گیاه بادرنجبویه.
* بررسی تغییر در میزان مواد موثره گیاه در غلظت‌های مختلف ماده جهش‌زای EMS
1-1-4 ساختار پژوهش
پژوهش حاضر در پنج فصل ارائه شده است. در فصل اول بیان کلی مسئله، هدف پژوهش و دلایل اهمیت موضوع، گیاه شناسی بادرنجبویه و خصوصیات مختلف آن می‌پردازد. همچنین مباحث مربوط به کشت بافت، تاریخچه و کاربرد آن و فاکتورهای موثر در کشت بافت به دقت مورد بررسی قرار می‌گیرد. در ادامه، مطالب مربوط به ایجاد جهش و اسانس‌گیری آن مطرح شده و در این میان به پژوهش‌های پیشین نیز اشاره خواهد شد.
فصل دوم شامل مروری بر تحقیقات و کارهای پژوهشی انجام شده در رابطه با کشت بافت و اعمال موتاژن‌ها بر روی گیاهان است.
فصل سوم شامل مواد و روش‌های مورد استفاده در پژوهش از جمله چگونگی ساخت محیط کشت MS و ویژگی‌های هر کدام از مواد مورد استفاده دراین محیط است. همچنین در ادامه به روش ضدعفونی کردن گیاه، تهیه ریزنمونه و چگونگی کشت کردن اشاره خواهد شد. روش اسانس‌گیری از گیاه نیز در این فصل مورد بررسی قرار خواهد گرفت.
فصل چهارم به بیان نتایج بدست آمده از محاسبه آنالیزهای آماری نمونه‌های کشت شده و تحت تیمار قرار گرفته با غلظت‌های مختلف می‌پردازد.
فصل پنجم شامل چکیده‌ای از نتایج حاصل از این تحقیق و استدلال و بحث در مورد آنها می‌باشد و همچنین پیشنهادهایی در مورد کارهای آتی ارائه می‌دهد.
1-2 کلیات
1-2-1 گیاه شناسی

شکل1-1شمائی از گیاه کامل بادرنجبویه
Melissa officinalis لاتین
lemon balm – bee balm انگلیسی
بادرنجبويه فارسی
حوک، بادروج، حشیشه النحل، ترنجان عربی
بابری هندی
melisse – the de france فرانسوی
بادرنجبویا اردو
بادرنجبويه گياهي علفي و چند ساله با نام علمی Melissa officinalis L. از خانواده نعناعیان lamiaceae که با نام‌های فارسی مختلف همچون بادرنگبویه، وارنگ بو، بالنگو، ریحان کوهی، تره خراسانی، مفرح القلب می‌باشد. روي ريزوم‌ها گره‌هاي خاصي وجود دارد. از اين گره‌ها استلون‌ها (ريشه راست) و ساير انشعاب‌هاي ريشه‌اي به رنگ قهوه‌اي روشن خارج مي‌شود. ارتفاع گياه متفاوت است و به شرايط اقليمي محل رويش آن بستگي دارد و بين 50 تا 100 سانتي‌متر مي‌باشد. ساقه مستقيم است ولي به ندرت ممكن است به صورت خوابيده روي زمين قرار گيرد (ساقة گياهان جوان معمولاً به صورت خوابيده رشد مي‌كند). برگ‌ها پهن، تخم مرغي شكل به طول سه تا شش سانتي‌متر و به صورت متقابل روي ساقه قرار مي‌گيرند. برگ‌ها به رنگ سبز تيره هستند، سطح آنها ناصاف و برجستگيهاي متعددي دارند (شکل1-1). گل‌ها در قسمت فوقاني گياه و در ناحيه زاويه برگ‌ها تشكيل مي‌شوند. غنچه‌ها معمولاً زردرنگ هستند كه پس از باز شدن به گلهاي سفيد يا بنفش تبديل مي‌شوند. بذر تخم مرغي شكل و رنگ آن تيره و براق (معمولاً سياه رنگ) است. وزن هزاردانه 6/0 تا 7/0 گرم است (ساری و سیلان،2002؛ رحیمی نیا، 1387).
براي اين گياه سه زيرگونه Altissima و Inodora ،Officinalis معرفي شده است. از بين زيرگونه‌هاي اين جنس، فقط زيرگونه افيسيناليس داراي ارزش اقتصادي بوده و رايحه‌اي شبيه ليموي تازه از خود متصاعد مي‌كند (باتیارکا و همکاران،2006).
1-2-2 رویش و تکثیر گیاه
رويش گياه از طريق بذر به كندي انجام مي‌گيرد. رويش گياهان چند ساله در اوايل بهار پس از گرم شدن هوا آغاز مي‌شود. اندام‌هاي هوايي گياه در زمستان بر اثر سرمازدگي خشك مي‌شوند. در اين حالت ريشه زنده است و از فعاليت خفيفي برخوردار است. گل‌ها اواسط تابستان (اواخر تير – اوايل مرداد) ظاهر مي‌شوند و نكتار زيادي نيز توليد مي‌كنند. بوي معطر گل‌ها باعث جلب حشرات، بخصوص زنبورهاي عسل مي‌شود. تغذية نكتار گل‌ها توسط زنبورها سبب افزايش توليد عسل آنها مي‌شود. ميوة آن از اواسط تابستان (اواخر مرداد) به تدريج مي‌رسد. پس از رسيدن، دانه‌ها به اطراف پراكنده مي‌شوند (امیدبیگی، 1384،1386).
1-2-3 خواستگاه و دامنه انتشار
اين گياه بومي جنوب اروپا، آسياي صغير و بخش‌هاي جنوبي آمريكاي شمالي است. جمعيت‌هاي بادرنجبويه در تمام كشورهاي مديترانه‌اي شامل مناطق ساحلي تركيه و شمال ايران و بخش‌هاي جنوبي آمريكايي شمالي پراكندگي دارند (امیدبیگی،1386؛ آدینی و همکاران،2008).
پيشينه كاشت بادرنجبويه به 2000 سال مي‌رسد و در سراسر اروپا، قفقاز، ایران، ترکمنستان، دامنه‌های معتدل هیمالیا، هندوستان، مولداویا، اندونزی و امروزه در سراسر جهان كشت مي‌شود (زرگری، 1368-1380).
1-2-4 نیازهای اکولوژیکی
بادرنجبويه در طول رويش به هواي گرم و نور كافي نياز دارد. بذرها در دماي 10 تا 12 درجة سانتي‌گراد جوانه مي‌زنند، ولي دماي مناسب براي جوانه‌زني 18 تا 20 درجه سانتي‌گراد است. درجة حرارت مطلوب در طول رويش اين گياه 20 تا 22 درجة سانتي‌گراد است. بادنجبويه براي مدتي قادر به تحمل درجة حرارت‌هاي پايين (20- تا 25- درجة سانتي‌گراد) مي‌باشد. براي گياهان مسن درجة حرارت‌هاي پايين براي مدت طولاني مضر بوده و تأثير نامطلوبي بر رشد و نمو و همچنين مواد مؤثرة آنها بر جاي مي‌گذارد. ريشة بادرنجبويه نسبتاً طويل است. اين ريشه به جذب رطوبت از اعماق زمين قادر بوده و براي مدتي خشكي را تحمل مي‌نمايد. رويش گياه در سايه نه تنها سبب كند شدن رشد و نمو گياه مي‌شود، بلكه در كاهش كميت و كيفيت اسانس آن نيز مؤثر است. بادرنجبويه در هر نوع خاكي قادر به رويش مي‌باشد، و خاك‌هايي با بافت متوسط و غني از تركيبات كلسيم و مواد و عناصر غذايي، براي رويش اين گياه بسيار مناسب است. بادرنجبويه قادر است خشكي را براي مدتي تحمل كند. ولي كم آبي و خشكي‌هاي طولاني سبب خشك شدن آن مي‌شود. در هر دورة آبياري گياهان 30 تا 40 ميلي‌متر بايد آبياري شوند، PH خاك براي بادرنجبويه 8/4 تا 8 مناسب است (باقری و همکاران،1384؛ رحیمی نیا،1387).
1-2-5 اهمیت دارویی
از مواد مؤثرة اين گياه ، داروهايي براي درمان ناراحتي‌هاي عصبي و همچنين داروهايي براي مداواي بيماريهاي معده ، قلب و روده‌اي كه منـشأ عصبي دارنـد تهيـه مي‌شود. نيرودهنده و ضدتشنج است و به عنوان مقوي معده، بادشكن، تسهيل عمل هضم و معرق و اسانس آن خاصيت آرام كننده با اثر قاطع است. در رفع دلپيچه ناشي از نفخ، درد معده با منشأ عصبي، اختلالات هضمي، طپش قلب سرگيجه و سنكوب بي‌خوابي، ضعف قلب، احساس صداي مبهم در گوش، نزله‌هاي مزمن برونش‌ها، و لوسيون حاصل از دم كرده‌ي آن يا گرد سرشاخه‌ها روي زخم‌ها و جراحات و دردشان را تسكين و مالش دادن جوشانده آن باعث از بين رفتن دردهاي صورت مي‌شود (فیالوا و همکاران،2008؛ یلدیز، 1387). در برخي كشورها از تنتور بادرنجبويه به عنوان آرام بخش استفاده مي‌شود. مواد مؤثرة بادرنجبويه به همراه مواد مؤثرة سنبل الطيب اثر درماني يكديگر را تشديد مي‌كنند.
1-2-6 مواد موثره و اجزاء اسانس
برگ داراي يك ماده تلخ، تانن، كامفز، مواد رزيني+ قندهاي مختلف و اسانس است كه از تركيبات اسانس آن سيترونلال و سيترال، ژرانيول، لينالول، استات اوگنول و اسيد رزماري و فنوليك و فلاونوئيد است. در روغن فرار آن مونوترپنها سيترونلال، سيترال، كمي متيل سترونلات اُسيمن، سترونلول، سزكوئي‌ترپن‌ها كاريوفيلين و ژرماكرن است (بیسیت و ویچل،2001؛ بلومنتال و همکاران،2000 ؛ اوانس،2002). اسانس موجود در برگ اين گياه داراي اثرهاي ضد ميكروبي، ضد باكتريايي، ضد ويروسي و هضم كنندگي است و در درمان اختلالات و ناراحتي‌هاي عصبي و بي‌نظمي‌هاي مربوط به معده و روده در سطح وسيعي مورد استفاده قرار مي‌گيرد (فیالوا و همکاران،2008).
1-2-7 استفاده‌ها
اسانس بادرنجبويه در صنايع غذايي و صنايع آرايشي و بهداشتي كاربرد زيادي دارد. از بادرنجبويه مي‌توان به عنوان عطر چاي و همچنين به عنوان طعم دهندة ساير داروها استفاده كرد. اگر چشم‌ها را با دم‌کرده بادرنجبویه (پس از صاف کردن آن) بشویند در تقویت چشم مؤثر است. دم‌کرده 5 درصد بادرنجبویه که طعم و عطر خیلی مطبوعی دارد در رفع بی‌خوابی کودکان و پیران نتایج خیلی خوبی داده است. جويدن آن دهان را خوشبو مي‌كند و جوشانده آن براي استحكام لثه و دندان‌ها مفيد است (امیدبیگی،1384).
1-2-8 کشت بافت گیاهی
به رشد مواد گیاهی عاری از میکروب در شرایط عاری از میکرو ارگانیسم ها مانند محیط غذایی استریل در یک لوله آزمایش، کشت بافت گیاهی اطلاق می‌شود و شامل کشت پروتوپلاست، سلول، بافت و اندام گیاهی می باشد. این تکنولوژی با نظریه پردازی دانشمند آلمانی، هابرلنت در مورد توانایی تبدیل یک سلول به موجود کامل در اوایل قرن بیستم شروع شد. هابرلنت پیشنهاد کرد که فنونی جهت جداسازی و کشت بافت ایجاد شود و ادعا کرد که اگر محیط و تغذیه سلول‌های کشت شده تنظیم شود این سلول‌ها می توانند گیاهان نرمالی را به وجود آورند.
در یک موجود زنده پرسلولی اعم از گیاهی و جانوری بسیاری واحد ساختمانی یعنی سلول وجود دارد که به طور بالقوه دارای ژن‌های سازنده یک موجود کامل پرسلولی دیگر می‌باشد و بسته به شرایط محیطی و هورمونی و غیره می‌توانند تمایز پیدا کرده و بافت‌ها و اندام‌های مختلفی تولید کنند و یا اینکه به صورت بی شکل باقی بمانند. بنابراین هر قسمت از یک گیاه ممکن است در شرایط مناسب و ویژه بتواند یک جنین و یک گیاه کامل ایجاد کند. از جمله پایه گذاران این علم ترکول است که در سال 1850 متوجه شد چنانچه قسمتی از ساقه گیاه کاکائو زخمی شود یک توده غیر متمایز در محل زخم تشکیل می‌شود که برای اولین بار به آن کالوس یا توده سلولی تمایز نیافته گفته شد(ملایری، 1375).
برخلاف سلول‌های جانوری، سلول گیاهی حتی در مراحل پیشرفته بلوغ و تمایز، در صورتی‌که سیستم غشائی و هسته آن سالم و فعال باشد، توانائی تغییر به حالت مریستمی و نمو به گیاه کامل را دارد. ایده انجام آزمایشات با استفاده از بافت‌ها و اندام‌های مجزا شده گیاهان تحت شرایط آزمایشگاهی کنترل شده، در اواخر قرن نوزدهم مطرح شده و در تحقیقات هابرلند بیان گردیده است (ملایری، 1375). در سال 1961 روش استفاده از آگار در پتری دیش معرفی شد. در این روش سلول‌های تکی را با آگار گرم شده مخلوط و حاصل را در پتری دیش به صورت یک لایه نازک پهن می‌کردند. این موضوع که یک سلول منفرد توانائی تقسیم و تکثیر داشته و نهایتا می‌تواند به یک گیاه کامل تبدیل شود در سال 1965 اعلام شد (افشاری‌پور، 1372؛ احسان پور،1380).
اولین کشت موفقیت آمیز بافت های گیاهی توسط وایت در سال 1934 انجام شد. در سال 1939 وایت اولین کشت موفقیت آمیز کالوس هویج و توتون را گزارش کرد. در سال 1957 یک مقاله کلیدی توسط اسکوگ و میلر منتشر شد. در آن مقاله آن ها اظهار داشتند که اثرات متقابل بین مقدار اکسین ها و مقدار سیتوکنین ها تعیین کننده نوع رشد و تغییرات ریخت شناختی می باشد(تاجی و همکاران، 1382).
مزيت تكثير از طريق كشت بافت نسبت به ساير روش‌هاي مرسوم، توليد تعداد زيادي گياه با محتواي ژنتيكي يكسان و كيفيت يكنواخت، در زمان كوتاه‌تر و فضاي نسبتاً محدود مي‌باشد(ساتیش و باوان اندان، 1988 ؛ مانتل و هوگو، 1989 ؛ باسو و چاند، 1996 ؛ شاسانی و همکاران، 1998).
در کشت بافت گیاهی بیشتر اوقات یک ریز نمونه را برای شروع رشد در محیط کشت مصنوعی قرار می‌دهیم سلول‌های غیر فعال ، تمایز یافته و تقسیم نشده و ریزنمونه در حین رشد در محیط غذایی ابتدا متحمل تغییراتی برای وارد شدن به حالت مریستمی می‌شوند (آدام و وندل، 2005). پدیده بازگشت سلول‌های بالغ به مرحله مریستمی و شکل‌گیری بافت کالوس را تمایززدایی می‌نامند. از آنجا که ریزنمونه چند سلولی، متشکل از انواع مختلفی از سلول‌ها می‌باشد بنابراین سلول‌های بافت کالوس نیز هتروژن خواهند بود. توانایی سلول‌های بافت کالوس برای تمایز یافتن به یک گیاه کامل و یا یک اندام گیاهی را تمایز مجدد می‌نامند. این دو پدیده یعنی خارج شدن از حالت تمایز با تمایززدایی و تمایز مجدد از ظرفیت‌های ذاتی سلول‌های گیاهی هستند و تکامل آنها به گیاه کامل به عنوان توتی‌پتانسی توصیف می‌گردد. عموما قبل از اینکه سلول‌ها بتوانند وارد تمایز مجدد شده و گیاه کامل تولید نمایند مرحله کالوس را بایستی بگذرانند (والن زوئلا و همکاران،1986 ؛ فارسی و ذوالعلی،1382).
همچنین استفاده از راه‌كارهاي فناوري زيستي از جمله كشت سوسپانسيون سلولي، كشت اندام (كشت ريشه هاي موئين و ساقه) راه حلي مناسب براي توليد سريع و انبوه متابوليت‌هاي ثانويه مي‌باشد (پزوت، 1996؛ راو و راویش انکار، 2002؛ بورگاد و همکاران، 2002 ؛ مولاباگال و تسای، 2004).
یکی از بخش‌های مهم بیوتکنولوژی، کشت بافت است که کاربردهای مختلف آن در زمینه گیاهان داروئی، از جنبه‌های مختلفی قابل بررسی است.
1-2-8-1تاریخچه کشت بافت گیاهی
در سال‌های اخیر تکنیک‌های کشت بافت گیاهی به یک ابزار خیلی قوی برای تکثیر و اصلاح گونه‌های گیاهی زیادی تبدیل شده‌اند. این تکنولوژی با پژوهش گتلیب هابرلند در مورد پرتوانی سلول در اوایل قرن 20 شروع شد. وی با توجه به این نکته که با دستکاری محیط کشت سلول‌ها ، سلول‌های کشت شده مراحل نموی یک رشد عادی را تکرار خواهند نمود،پیشنهاد گسترش تکنیک‌های جداسازی و کشت بافت‌های گیاهی را ارائه داد.
کشف اکسین‌ها توسط ونت و همکاران و کشف سیتوکینین‌ها توسط اسکوگ و همکاران قبل از اولین کشف موفق بافت‌های گیاهی در آزمایشگاه صورت گرفت (افشاری پور 1372 ).
اولین کشت موفق کالوس هویج و توتون توسط وایت در سال 1943 گزارش گردید. اسکوگ و میلر نیز در سال 1957 گزارش کردند که اثر متقابل کمی بین اکسین‌ها و سیتوکینین‌ها نوع رشد و ریخت‌زایی گیاه را تعیین می‌کند. مطالعات آنها بر روی توتون نشان داد که نسبت بالای اکسین به سیتوکینین، ریشه‌زائی را تحریک نموده و پایین بودن این نسبت، باعث تحریک تشکیل اندام هوائی می‌شود اما این پاسخ، عمومی نیست.با این که دستکاری نسبت اکسین و سیتوکینین در ریخت‌زائی گونه‌های زیادی موفقیت آمیز بوده است، اما امروزه واضح است که عوامل زیاد دیگری بر توانائی سلول‌ها در کشت برای تمایز ریشه، اندام هوائی یا رویا موثر است (افشاری پور 1372).
ایجاد انگیزه برای بکارگیری تکنیک‌های کشت بافت گیاهی در تکثیر و اصلاح گونه‌های گیاهی از کار اولیه مورل و موراشیگ روی تکثیر ارکیده در محیط کشت و تهیه یک محیط کشت جدید با غلظت بالائی از نمک های معدنی توسط موراشیک و اسکوک ناشی شد. از آن به بعد به صورت قابل توجهی رشد یافت و امروزه یک نقش کلیدی در تکثیر، اصلاح و مهندسی ژنتیک گیاهی ایفاء می‌کند.
1-2-9کاربردهای کشت بافت گیاهی
1-2-9-1 تولید مواد شیمیایی
گیاهان به عنوان منبع مهمی از مواد پیشتاز فرآورده‌هایی که در صنایع مختلف مانند داروسازی، صنایع غذایی و آرایشی و بهداشتی و کشاورزی مورد استفاده‌اند (هیناستین و مری 1988).
1-2-9-2 ایجاد گیاهان عاری از عوامل بیماری‌زایی گیاهی
غلات ممکن است توسط گونه‌های زیادی از آفات میکروبی، ویروس، باکتریائی و قارچی آلوده می‌شوند. این آلودگی‌ها تا حد زیادی موجب کاهش تولید فرآورده کیفیت آن و توان گیاه می‌شوند. آلودگی در درختان میوه بازده محصول را تا 90% کم می‌کند. اساس به دست آوردن گیاهان بدون ویروس کشت مریستم انتهایی آنهاست با کشت قطعه کوچکی از مریستم می‌توان کالوس بدون ویروس تهیه کرد (هیناستین و امری 1988).
1-2-9-3 ایجاد تنوع ژنتیکی
مواد گیاهی که از طریق کشت بافت تکثیر می‌شوند تغییرات ژنتیکی بالایی را نشان می‌دهند. زمانی که از کشت کالوس مرتبا زیر کشت گرفته شود گیاهان حاصل سطح پلوئیدی متفاوتی را نشان می‌دهند و همین تغییرات ناشی از کشت بافت می‌تواند تنوع ژنتیکی جدیدی را در اختیار اصلاح کننده نباتات قرار دهد (هیناستین و امری 1988)
1-2-9-4 کاربرد کشت بافت گیاهی در کشاورزی،باغبانی و جنگلداری
از اوایل دهه 1970 با توسعه فنون کشت آزمایشگاهی و ابداع روشهای جدید بیولوژی مولکولی، کشت بافت و سلول گیاهی تأثیر چشم‌گیری در هر دو زمینه اصلاح نباتات و تکثیر رویشی (ریزازدیادی) داشته و ذخیره و نگهداری ذخایر توارثی را تسهیل کرده است. از طرف دیگر، کشت بافت گیاهی بخش جدایی ناپذیر فناوری تراریختی گیاهان است که با استفاده از آن تولید گیاهان تراریخته با انتقال DNA از منابع مختلف امکان پذیر میشود. به مجموعه این روشها، فناوری زیستی گیاهی گفته میشود که مباحث متنوعی شامل شده و در تحقیقات علمی پایه و همچنین برای مقاصد اقتصادی در زمینههای کشاورزی، باغبانی و جنگلداری کاربرد دارد.
1-2-9-5 کاربردهای اقتصادی کشت بافت گیاهی
ریزازدیادی یکی از روشهای کشت بافت است که از آن برای ایجاد تعداد زیادی گیاه مشابه از یک گیاه مادری استفاده میشود. مزیت مهم ازدیاد این است که از طریق آن میتوان بسیار سریعتر از روشهای سنتی تعداد زیادی گیاه مشابه تولید کرد. این روش مخصوصاً در دست‌ورزی ژنتیکی کاربرد زیادی دارد، زیرا از این طریق میتوان گیاه تراریخته جدید را سریعاً تکثیر نمود (علیزاده، 1390).
با استفاده از ریزازدیادی بیش از 10 هزار گونه گیاهی با موفقیت تولید شدهاند. بسیاری از این گونهها زینتی هستند، با این وجود این روش برای گیاهان زراعی و درختان میوه نیز مورد استفاده قرار میگیرد. استفاده از این روش در بعضی از شرایط خاص بسیار مفید است. اولاً در گونههایی که تکثیر رویشی در آنها مشکل است و یا گونههایی که بذر سرسخت دارند (یعنی به سختی جوانه میزنند) که از آن جمله میتوان به گونههای زینتی مانند ارکیده اشاره کرد. مورد دوم شامل موقعی است که آمیزش گیاهان و ازدیاد از طریق بذر، سرعت تکثیر گیاه را کاهش داده و برای مثال در گونههای درختی موجب به وجود آمدن تنوع ژنتیکی ناخواسته می‌شود. سومین مورد، کاربرد ریز ازدیادی برای تکثیر گیاهانی است که بعضی از بیمارهای ساختاری در آن‌ها از طریق روشهای سنتی تکثیر منتقل میشود ولی از طریق ریزازدیادی مریستم یا بافتهای دیگر امکان انتقال آنها وجود ندارد (افشاری پور 1372).
1-2-9-6 کاربردهای کشت بافت گیاهی در مهندسی ژنتیک و فناوری زیستی
کشت بافت گیاهی جزئی ضروری برای کارهای مهندسی ژنتیک و ایجاد گیاهان تراریخته با خصوصیات جدید است. در بیشتر سال‌های قرن بیستم، آمیزش گیاهان روشی معمول برای تولید گیاهان زراعی با صفات مطلوب بوده است. با آمیزش گیاهان انتخابی ژن‌های مطلوب دو یا چند فرد با هم ترکیب شده به طوری که دورگ حاصل دارای ترکیبی از صفات مطلوب خواهد بود.
با گسترش کشت بافت گیاهی و روش‌های جدید زیست شناسی مولکولی، امکان تبادل DNA بین موجودات غیر خویشاوند نیز فراهم شده است، به طوری که می‌توان ژن‌های جدیدی را از موجودات خارج از سلسله‌ی گیاهان به آنها وارد کرد. علاوه بر این، تغییر ژنوم گیاهی از طریق معرفی و بیان DNA بیگانه (مهندسی ژنتیک)، منجر به ایجاد ژنوتیپ‌های جدیدی (گیاهان تراریخته) می‌شود که می‌توان با استفاده از روش‌های اصلاح سنتی به اصلاح و بهبود بیشتر آنها کمک نمود.(هیناستین و امری 1988)
1-2-9-7 انواع کشت بافت گیاهی
تکنیک‌های انواع کشت بافت گیاهی را می‌توان عمدتا به پنج دسته طبقه بندی نمود:
کشت کالوس: کشت دانه رست‌ها ، قطعات جداکشت ، گیاهان بر روی محیط‌های حاوی آگار که منجر به تولید توده‌های سلولی می‌شود را کشت کالوس می‌نامند.
کشت سلولی: کشت سلول‌ها در محیط‌های مایع (بدون آگار) در ظرف‌هایی که معمولا با تکان دادن تهویه می‌شوند را کشت سلولی می‌گویند. سیستم‌های مختلف کشت سلولی عبارتند از: سیستم کشت بسته ، سیستم‌های کشت نیمه پیوسته و سیستم‌های کشت پیوسته.
کشت اندام: کشت آسپتیک جنین‌ها، بساک‌ها، تخمدان‌ها و یا دیگر اندام‌های گیاهی بر روی محیط های مغذی را کشت اندام می‌نامند.
کشت مریستم و ریخت‌زایی: کشت آسپتیک مریستم‌های نوک ساقه و یا دیگر قطعات جدا کشت شده بر روی محیط های مغذی به منظور تولید گیاهان کامل را کشت مریستم و ریخت‌زایی می‌نامند.
کشت پروتوپلاست: جداسازی آسپتیک پروتوپلاست‌های گیاهان و کشت دادن آن‌ها بر روی محیط های مناسب را کشت پروتوپلاست گویند (افشاری پور، 1372؛ راشد وبنائیان، 1385).
1-2-9-8 بررسی اثرات فاکتورهای مختلف در محیط کشت
انتخاب محیط کشت یا تهیه ترکیب آن برای موفقیت در کشت بافت ضروری است. هیچ محیط کشت مشخصی را نمی‌توان برای رشد انواع سلول‌ها توصیه کرد و اغلب لازم است تغییراتی در محیط کشت برای پاسخگوئی انواع مختلف ریزنمونه صورت گیرد. بطور کلی محیط کشت حاوی نمک‌های غیرآلی و ترکیبات معدنی مثل تنظیم کننده‌های رشد ، ویتامین‌ها، کربوهیدرات‌ها و یک عامل ژلی برای انجماد محیط کشت می‌باشد (افشاری‌پور، 1372؛ باقری و آزادی، 1381).
بافت‌های گیاهی کشت شده نیاز به ترکیبات شیمیایی غیرآلی ویژه‌ای دارند. به غیر از کربن، هیدروژن و اکسیژن، عناصر اساسی دیگر که به مقادیر نسبتا زیادی مورد نیاز گیاه می‌باشد عبارتند از : ازت، فسفر، پتاسیم، کلسیم، منیزیم و گوگرد. به این عناصر، پر مصرف می‌گویند (افشاری‌پور، 1372؛ احسان پور،1380).
آهن، منگنز، مس، برم، روی و مولیبدن نیز برای رشد گیاهان لازم است اما به مقادیر خیلی کمتر. به این عناصر کم مصرف می‌گویند (افشاری‌پور، 1372). این 15 عنصر که برای رشد گیاهان در طبیعت مهم هستند برای کشت‌های بافت نیز ضروری می‌باشند. در ترکیب نمک‌ها و یون‌های محیط‌های کشت مختلف بافت‌های گیاهی، از نظر کمی و کیفی اختلاف اندکی وجود دارد (بوجانیس، 1989؛ پیری و همکاران، 1385).
1-2-9-9 نمک‌های غیرآلی
ترکیب نمک‌های غیرآلی می‌تواند متفاوت باشد. اون و میلر (1992) ترکیب محیط‌های کشتی را که بطور گسترده‌ای استفاده می‌شوند، بدقت مورد بررسی قرار دادند و خطای اندکی را در این ترکیب‌ها گزارش کردند. ترکیب موراشیگ و اسکوک(1962)یا MS ترکیبی است که بطور گسترده از آن استفاده می‌شود (اسمیت و گولد، 1989). به مقدار نمک آن بطور خاص توجه شده است. ترکیب MS به این منظور تهیه شد تا نشان داده شود که اضافه نمودن عصاره بافت‌های گیاهی که در آن زمان به محیط کشت اضافه می‌شد، رشد سلولی در کشت in vitro را افزایش نمی‌دهد. ترکیب MS ثابت کرد که مواد غذائی غیرآلی، عامل محدود کننده رشد سلولی توتون نبوده و مکمل‌های آلی نظیر عصاره مخمر، شیر نارگیل، هیدرولیزات کازئین و عصاره گیاهی به اندازه نمک‌های غیرآلی ضروری نیستند (باقری و آزادی، 1381).
1-2-9-10 ویتامین‌ها
ویتامین‌های افزودنی برای کشت سلول و بافت گیاهی ضروری نیستند، هرچند که ویتامین B1 (تیامین) در کشت بافت برخی گونه‌ها سودمند بنظر می‌رسد، با این وجود بیوتین، پانتوتنیک اسید، نیکوتینیک اسید ( نیاسین)، پیریدوکسین(پیریدوکسال- ویتامین B6)، اسید فولیک، اسید اسکوروبیک(ویتامین C) و توکوفرول به برخی محیط‌های کشت اضافه می‌گردند (چان و همکاران، 2000). بیشتر سلول های کشت شده گیاهان توانایی سنتز ویتامین های لازم را دارند ولی مقدار آن کافی نیست (ملایری، 1375؛ جاها و قاش،2005). ویتامین‌ها دارای فعالیت کاتالیک در سیستم آنزیمی بوده و فقط به مقادیر کم موردنیاز می باشند. برخی معتقدند که تیامین (ویتامین B1) ممکن است تنها ویتامین موردنیاز تقریبا تمام انواع کشت های بافت گیاهی باشد، در حالی که اسید نیکوتینیک (نیاسین) و پیریدوکسین (ویتامین B6) ممکن است رشد و نمو را تحریک کند. ویتامین‌های دیگری که در کشت بافت گیاهی مورد استفاده قرار گرفته اند عبارتند از: پارا آمینو بنزوئیک اسید (BABA یا ویتامین BX)، اسید آسکوربیک (ویتامین C)، بیوتین (ویتامین H)، سیانوکوبالامین (ویتامین B12)، اسید فولیک (ویتامین BC)، پانتوتنات کلسیم (ویتامین B5) و ریبوفلاوین (ویتامین B2). ضمنا اسید آسکوربیک به عنوان یک آنتی اکسیدان جهت جلوگیری از قهوه‌ای شدن بافت‌ها می‌تواند مفید واقع شود (افشاری پور، 1372).
1-2-9-11 هورمون‌های گیاهی
نوع ویژه‌ای از ترکیبات آلی مورد نیاز برای رشد، تمایز و نمو سلول، تحت عنوان تنظیم کننده‌های رشد گیاهی یا هورمون‌های گیاهی می‌باشند که پنج گروه عمده از این ها شامل اکسین ها، سیتوکینین‌ها، جیبرلین‌ها ، اسید آبسزیک و اتیلن است.
1-2-9-11-1 اکسین‌ها
اکسین‌ها که اولین بار در سال 1931 مورد مطاله قرار گرفتند باعث دراز شدن سلول‌های جوانه شده و تقسیم سلولی را در رشد لایه زاینده ساقه افزایش می‌دهند.در حالی که رشد ریشه و شکوفه‌های جانبی را ممانعت می‌کنند. متداولترین‌ها اکسین‌ها عبارتند از:2و4 دی کلرو فنوکسی استیک اسید (2,4-D)،نفتالن استیک اسید (NAA)، ایندول بوتیریک اسید (IBA)، ایندول استیک اسید (IAA) (تاجی و همکاران 1382؛ دیکسون،1994).

شکل 1-2 ساختار تعدادی از اکسین ها
1-2-9-11-2 سیتوکینین‌ها
گروهی از تنظیم کننده‌های رشد گیاهی که تقسیم سلولی و ساقه‌زائی را تشدید می‌کنند. ایزوپنتیل آدنین،6-فوریل آدنین که کینیتین نیز نامیده می‌شود و بنزیل آدنین (BA) متداولترین سیتوکینین‌ها در محیط کشت بافت گیاهی هستند. با اعمال تغییراتی در نوع و غلظت نسبی اکسین‌ها و سیتوکینین‌ها در محیط کشت، امکان القاء رشدهای تمایز نیافته همراه با ریخت‌زائی فراهم می‌گردد ( تاجی و همکاران 1382).

شکل 1-3 ساختار تعدادی از سیتوکینین ها
1-2-9-12 منبع انرژی
سلول‌های سبز کشت شده، معمولا از نظر فتوسنتزی فعال نبوده و به یک منبع کربن نیاز دارند. متداول‌ترین منبع انرژی کربن مورد استفاده در محیط‌های کشت سلول گیاهی، ساکاروز است اما گلوکز و فروکتوز هم مورد استفاده قرار می‌گیرند (فارامی و همکاران، 2000 ؛ تاجی و همکاران، 1382).
1-2-9-13 عوامل فیزیکی
نور و دما از مهمترین عوامل فیزیکی موثر بر رشد می‌باشد. نور باعث تحریک اندام‌زائی می‌شود، اما از رشد ریشه جلوگیری می‌کند. اثر نور بر اندام‌زائی ممکن است به طور مستقیم یا غیر مستقیم مربوط به تجمع نشاسته در سلول‌های خاصی باشد و نشاسته باعث افزایش حضور سیتوکنین‌ها از جمله کینتین می‌شود (رجب بیگی و همکاران، 1385). دما نیز از جمله عوامل موثر بر رشد سلول بافت گیاهی است. برای اغلب کشت‌ها، دمای بین 20 تا 25 درجه سانتی‌گراد جهت رشد مناسب است. دمای بالاتر از 28 درجه سانتی‌گراد باعث تبخیر آب موجود در محیط کشت شده و سبب محدودیت رشد بافت می‌شود (اوانس و همکاران، 1984).
1-2-9-14 مواد آلی
به استثنای گلیسین که از ترکیبات تشکیل دهنده محیط‌های کشت متعددی می‌باشد معمولا اسیدهای آمینه دیگر به محیط‌های کشت اضافه نمی‌شوند. مشاهده شده است که رشد بافت‌ها در محیط‌های کشت که در اثر اضافه نمودن مخلوطی از اسیدهای آمینه مهار می‌شود (افشاری پور، 1372).با توجه به نیاز غذایی سلول‌های گیاهی به ترکیبات هیدروکربن، وجود یک منبع خارجی کربن در محیط کشت بافت گیاهی جهت افزایش رشد بافت کالوس لازم و ضروری است. ساکارز متداول‌ترین منبع کربن می‌باشد که معمولا با غلظت 5/2 درصد به کار می‌رود. گرچه سعی بر این است که ترکیبات محیط کشت‌های مختلف مشخص شود اما در مواردی که مخلوط ترکیبات شیمیایی جواب‌گوی نیاز کشت نباشد باید از عصاره‌های طبیعی خام مانند پپون، عصاره مخمر و آب نارگیل استفاده شود (افشاری پور، 1372؛ تاجی و کومار،2001).
1-2-9-15ریزنمونه
سن فیزیولوژی قطعه جداکشت، ژنوتیپ، اندازه قطعه جداکشت و منشاء اندام کشت شده در تولید گیاه و رشد آن موثر است. هر چه قطعه جداکشت جوانتر باشد امکان موفقیت در کشت بافت بیشتر است. کاشت سلول های مریستمی به علت جوان بودن و تمایز کم در بیشتر گیاهان موفق بوده است (ملایری، 1375؛ میست سوهاشی،2002).
عوامل مختلفی بر چگونگی پاسخ‌دهی ریزنمونه‌ها کشت شده تاثیر گذارند که از آن جمله می‌توان به ژنوتیپ گیاه مادری، شرایط رشد، سن زیرنمونه، زمان انتخاب ریزنمونه و… اشاره کرد. به طور کلی بهتر است بافت های دارای سلول‌های زنده جوان به عنوان ریزنمونه مورد استفاده قرار گیرند، زیرا سلول‌های تشکیل دهنده بافت‌های جوان دارای واکوئل کوچکی هستند و بنابراین فعالیت و توانایی زیادی در ایجاد گیاه باززائی شده دارند (طباطبایی و امیدی، 1390).
1-2-9-16 pH
pH محیط کشت معمولا بین 6/5 تا 8/5 تنظیم می‌شود. اما گیاهان مختلف برای رشد مطلوب ممکن است به pH های متفاوتی نیاز داشته باشند. اگر pH بالاتر از 6 باشد ممکن است که محیط کشت بسیار سخت و سفت شود و اگر pH کمتر از 2/5 باشد، معمولا مشکلات ژله‌ای شدن محیط کشت را خواهیم داشت (تاجی و همکاران، 1382).
1-2-9-17 آب
در کشت بافت معمولا از آب مقطر استفاده می‌شود در بسیاری آزمایشگاه‌ها از آب دو بار تقطیر شده استفاده می‌کنند. استفاده از ستون‌های تبادل یونی با خالص کردن آب با مشکلاتی همراه است (دادس و رابرت، 1985). زیرا در این فرایند، یکسری ترکیبات آلی از ستون آزاد شده و باعث آلودگی آب می‌شود. با این حال ستون‌های تبادل یونی بدون هیچ مشکلی آب مورد نیاز بسیاری از آزمایشگاه‌ها را تامین می‌کنند و به طور گسترده ای در اروپا استفاده می‌شود. بعضی از آزمایشگاه‌ها بدلیل مسائل اقتصادی از آب باران تیمار نشده استفاده می کنند، اما باید توجه داشت که در این صورت از میزان کنترل ما بر روی مقادیر ترکیبات آلی و معدنی محیط کشت کاسته می‌شود (تاجی و همکاران، 1382).
1-2-9-18 آگار
بعضی از گیاهان یا بافت‌های آن‌ها در محیط کشت مایع کشت می‌شوند. این محط کشت ممکن است ساکن باشد یا این که معمولا توسط یک همزن تکان داده می‌شود. اکثر بافت‌ها روی محیط کشت جامدی کشت می‌شوند که توسط آگار یا جانشین آن مانند ژلرایت یا فیتاژل، ژله‌ای شده باشد. طیف غلظت آگار مورد استفاده از 7/0-1٪ است. آگار در غلظت‌های بالا به شدت سفت شده و آب قابل دسترس در آن کم می‌شود و در نتیجه انتشار مواد غذایی به بافت‌های گیاهی ضعیف خواهد بود. آگار با کیفیت بالا مانند دیفکوبی تک آگار گران است. اما ناخالصی‌های آن که ممکن است مانع رشد گیاه شود کمتر است. در آزمایشگاه تجاری گاهی اوقات از جانشین‌های دیگر آگار مانند ژلاتین استفاده می‌شود. ژل‌های مصنوعی باعث پر آب شدن (شیشه‌ای شدن) بافت های گیاهی می‌شوند. این مسئله یک مشکل فیزیولوژیکی است که در کشت بافت بسیاری از گونه ها اتفاق می افتد. به منظور رفع این مشکل شرکت سیگما محصول جدیدی به نام آگارژل تولید کرده است. این محصول مخلوطی از آگار و ژل مصنوعی است و به علت کاهش مشکل شیشه‌ای شدن از هر دو آن‌ها بهتر است. این محصول را می‌توان در آزمایشگاه با مخلوط نمودن 1گرم ژلرایت (فیتاژل) با 4گرم آگار، به عنوان عامل مولد ژل برای یک لیتر محیط کشت تولید نمود (تاجی و همکاران، 1382).
1-2-9-19 چگونگی انتخاب محیط کشت
انتخاب یک محیط کشت بیشتر بستگی به گونه‌های گیاهی، بافت یا اندام مورد کشت و هدف از انجام آزمایش دارد (دیویس، 1994). به منظور انتخاب یک محیط کشت مناسب برای کشت مورد نیاز بهتر است که ابتدا با یک محیط کشت پایه مثل MS شروع نمود سپس به وسیله یک سری تغییرات کیفی و کمی در محیط کشت از طریق یک سری آزمایشات، یک محیط کشت مناسب را بدست آورد (بوجانیس، 1989؛ رازدان،2003).
1-2-10 ریزازدیادی گیاهان از طریق کشت بافت
ریزازدیادی عبارت است از تکثیر درون شیشه‌ای گیاه از اندام‌ها، بافت‌ها، سلول‌ها و پروتوپلاست و غیره. در برخی منابع نیز عنوان ریزازدیادی طیف وسیعی از روش‌ها و تکنیک‌های کشت بافت را شامل می‌شود که از جوانه، نوک ریشه، بافت، برگ‌ها، رویان‌ها، پرچم‌ها و حتی سلول‌های



قیمت: 11200 تومان

متن کامل پایان نامه ها در 40y.ir

پاسخی بگذارید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *