پایان نامه ها و مقالات

آرتمیا، فالکون

مثبت ناپلیوس های فعال در آن قسمت جمع شوند. سپس با استفاده از لوله پلاستیکی متصل به لوله شیشه ای ناپلیوس ها جمع شدند، بدین صورت که ابتدا درون لوله شیشه ای و پلاستیکی با آب پر شده، سپس طرف لوله شیشه ای وارد قسمت بالای شیب آکواریوم گردید و آکواریوم دیگری در ارتفاع پایین تر از این آکواریوم گذاشته شد که داخل آن پیپت های متصل به لوله های هوادهی به منظور هوادهی تعبیه شده بود. ناپلیوس های تازه تخم گشایی و ضدعفونی شده با استفاده از رفتار نورگرایی مثبت، از سیست های تخم گشایی نشده و پوسته ها جدا و به درون آکواریوم منتقل گردیدند. بعد از جمع آوری کل ناپلیوس ها، پوسته های خالی و احیاناً سیست های دکپسوله شده و جنین باقی مانده درون آکواریوم شیشه ای دور ریخته شدند.
بعد از آن با استفاده از سمپلر µl 250 از نواحی مختلف آکواریوم ۱۰ نمونه برداشته و به درون خانه های میکروپلیت انتقال داده شدند. بعد از ریختن یک قطره لوگل در هر خانه حاوی نمونه ناپلیوس، تعداد ناپلیوس ها زیر میکروسکوپ شمارش شدند. از مجموع ۱۰ خانه شمرده شده میانگین گرفته و تعداد ناپلیوس های آکواریوم در یک میلی لیتر محاسبه شد. با توجه به اینکه در این تحقیق از تراکم های ۵۰۰۰۰، ۱۰۰۰۰۰ و ۲۰۰۰۰۰ آرتمیا ارومیانا و آرتمیا فرانسیسکانا در لیتر آب شور استفاده شد، بنابراین میزان مورد نیاز از آب شور دارای ناپلیوس محاسبه و در درون صافی ۱۵۰ میکرونی با آب مقطر شستشو داده شد. در نهایت، ناپلیوس ها به درون زوگ های تمیز حاوی آب تازه با شوری ppt 35 به حجم ۶ لیتر با هوادهی مناسب منتقل شدند.

شکل ۳-۲. جداسازی ناپلیوس ها از سیست ها و پوسته ها.

۳-۶- غنی سازی ناپلیوس ها
در این بخش عمل غنی سازی ناپلیوس ها با روغن کلزای بومی تحت تراکم ها و غلظت های مختلف روغن در پنج زمان نمونه برداری مورد بررسی قرار گرفته است.

شکل ۳-۳. غنی سازی ناپلیوس ها با استفاده از امولسیون.

۳-۷- تهیه محلول غنی سازی
برای تهیه سوسپانسیون ابتدا به نسبت ۱/۰ :۱۰ آب با دمای ۴۰ درجه سانتیگراد و لسیتین درون بشر خشک و تمیز ریخته و با استفاده از همزن برقی به خوبی مخلوط شدند تا حدی که دیگر اثری از لسیتین قهوه ای رنگ در درون بشر دیده نشود و محلول به رنگ شیری درآید. سپس روغن به نسبت ۱ به این محلول اضافه شد و با استفاده از همزن به خوبی مخلوط شد. بعد از آن مقداری از نمونه روی لام ریخته شد و یک عدد لامل روی آن جهت بررسی قطر ذرات زیر میکروسکوپ گذاشته شد. هر چقدر روش آماده سازی محلول دقیق تر و بهتر باشد و اندازه میکروگلبول های تهیه شده مناسب باشد میزان غنی سازی بهتر بوده و ارزش غذایی ناپلیوس به ویژه از نظر دو اسیدچرب غیراشباع زنجیره بلند (DHA و EPA) افزایش می یابد. درنهایت محلول آماده شده به درون ارلن تمیز و اتوکلاو شده منتقل شد و پس از تزریق گاز ازت (نیتروژن) برای جلوگیری از اکسید شدن اسیدهای چرب، درب ارلن با پارافیلم پوشانده و تا موقع استفاده داخل یخچال نگهداری شد.
میزان اسیدهای چرب اشباع (SFA) روغن کلزا طبق برچسب کارخانه ( شرکت فرآورده های روغنی Sirco)، ۸-۶% و اسیدهای چرب غیراشباع با یک پیوند دوگانه MUFA 69-56% و اسیدهای چرب غیراشباع با چند پیوند دوگانه PUFA 33-25% بود.
زوگ های غنی سازی که قبلاً برای تراکم ها و غلظت های مختلف آماده شده بودند، بعد از ریختن ناپلیوس ها درونشان با توجه به اینکه نسبت لسیتین، روغن و آب ۱/۰، ۱ و ۱۰ بود به ازای هر لیتر برای غلظت های ۱/۰، ۲/۰ و ۳/۰ گرم در لیتر به ترتیب ۱، ۲ و ۳ میلی لیتر از محلول به وسیله پیپت مدرج به درون زوگ ها ریخته شد (البته ابتدا محلول داخل بشر ریخته شد و با همزن کمی مخلوط گردید تا برای غنی سازی مورد استفاده قرار گیرد) و باقیمانده امولسیون تهیه شده مجدداً بعد از فلاش کردن (تزریق) گاز نیتروژن و بستن درب ارلن با پارافیلم درون یخچال برگردانده شد، دومین دوره غنی سازی نیز ۱۲ ساعت بعد انجام گرفت (میزان محلول غنی سازی با توجه حجم آب باقیمانده درون زوگ ها محاسبه شد). مسئله مهم در دومین دوره غنی سازی، افت pH به دلیل افزودن محلول امولسیون و استفاده از این محلول توسط ناپلیوس هاست که برای رفع این مشکل از محلول ضعیف قلیایی استفاده شد (حدود ۵/۰ گرم NaCO3 در درون بالن ژوژه ریخته، در۵۰ سی سی آب مقطر حل گردید و محلول ضعیف NaCO3 تهیه شد). البته لازم به ذکر است که میزان pH در ساعت های ۳، ۶، ۹، ۱۲، ۱۵ و ۱۸ ساعت بعد از غنی سازی اندازه گیری شد و در مواقعی که pH پایین تر از ۵/۸، می شد این محلول مورد استفاده قرار می گرفت، زیرا درصد بقا با کاهش pH و افزایش متابولیت ها کاهش می یابد.

۳-۸- نمونه برداری برای محاسبه میزان بقا۳۹ و طول کل۴۰
از هر زوگ به تعداد ۱۰ نمونه ۲۵۰ میکرولیتری در زمان های ۶، ۹، ۱۲، ۱۵ و ۱۸ ساعت برداشته و به داخل میکروپلیت های ۲۴ خانه منتقل شد. در ابتدا تعداد ناپلیوس های مرده (تلفات) بررسی و بعد از شمارش مرده ها با ریختن یک قطره لوگل بر روی نمونه ها تمامی ناپلیوس ها کشته شده و تعداد کل ناپلیوس ها نیز شمارش شد. سپس از میزان تلفات و نیز تعداد کل ناپلیوس ها در ۱۰ نمونه میانگین گرفته شد و بدین ترتیب درصد تلفات و تعداد کل ناپلیوس ها بعد از غنی سازی و درصد بقای آن ها با استفاده از فرمول زیر در زمان مورد نظر محاسبه شد (این کار برای تمامی زوگ ها در تیمارها و تکرارهای مختلف انجام شد).
+ (حجم آب باقیمانده درون زوگ × تعداد ناپلی زنده در یک لیتر))] = درصد بق
ا
۱۰۰× [تعداد کل ناپلی درون زوگ / (تعداد ناپلی برداشت شده برای آنالیز اسیدهای چرب

شکل ۳-۴. شمارش ناپلیوس ها به منظور محاسبه درصد بقا.

جهت رسم طول ناپلیوس از هر زوگ به تعداد ۲۰ عدد ناپلی زنده تهیه و با استفاده از لوگل تثبیت گردیدند. سپس روی لام کنار هم چیده شده و طول کل آنها با استریومیکروسکوپ مجهز به لوله رسم ترسیم گردید. درنهایت خطوط رسم شده توسط دستگاه Digitizer اندازه گیری و توسط برنامه نرم افزاری مربوطه به داده های عددی بر حسب میلی متر تبدیل گردیدند.

شکل ۳-۵. کشیدن طول کل ناپلیوس ها با استریومیکروسکوپ.

۳-۹- نمونه برداری برای تعیین میزان اسیدهای چرب
در پنج زمان مورد نظر از هر زوگ به میزان ۵/۰ گرم ناپلی (معادل ۵۰۰۰۰ ناپلی) روی صافی ۸۰ میکرونی منتقل و بعد از شستشو با آب شیر و آبگیری آنها توسط دستمال کاغذی از زیر صافی ، ناپلیوس ها با اسپاتول۴۱ برداشته و به درون میکروتیوب منتقل شدند و پس از درج مشخصات نمونه، تاریخ و ساعت تا زمان آنالیز در درون فریزر ۸۰- درجه سانتیگراد نگهداری شدند. برای تعیین پروفیل و میزان اسیدهای چرب، متیل استرهای اسیدهای چرب با استفاده از روش متیل استریفیکاسیون مستقیم (Lepage and Roy, 1984)، استخراج شدند.

شکل ۳-۶. نمونه برداری ناپلی برای اندازه گیری میزان اسیدهای چرب.

۳-۱۰- استخراج اسیدچرب
جهت بررسی اسید های چرب ابتدا ۵/۰ گرم از نمونه تر وزن و درون لوله های شیشه ای درب دار مخصوص ریخته شد. به هر کدام از لوله ها ml 5 محلول متانول/تولوئن (v/v 3:2 ) و ml5 محلول تازه تهیه شده استیلکلراید/ متانول (v/v 1:20) به عنوان عامل استریفیکاسیون اضافه شد. درب ظروف محکم بسته و در حمام آبی°c 100 به مدت یک ساعت جوشانده شد. لوله ها هر ۱۰ دقیقه یکبار تکان داده شدند و درب لوله ها کنترل گردید (برای جلوگیری از پریدن حلال ها). بعد از اینکه لولهها سرد شدند محتوای لوله ها به درون فالکون های ml 50 انتقال داده و به هر یک ml5 آب دیونیزه و ml5 هگزان اضافه شد. سپس لوله ها به مدت ۵ دقیقه با دور rpm3000 سانتریفیوژ شدند و فاز بالایی محلول به وسیله پیپت پاستور به درون فالکون های تمیز ml 15 منتقل گردید و این عمل دو بار دیگر با افزودن ml 3 هگزان تکرار شد. سپس فالکون های ml 15 به مدت ۵ دقیقه با دور rpm 10000 سانتریفیوژ شدند تا آلودگی باقیمانده در ته فالکون جمع شود. محلول رویی درون فالکون ها به لوله های آزمایش منتقل و از طریق فیلتر سولفات سدیم بدون آب، آبگیری و به بالن های گلابی شکل انتقال داده شد. بالن ها توسط روتاری در دمای ?c35 تغلیظ و حلال ها تبخیر شدند. سپس lµ ۵۰۰ ایزواکتان به عنوان حلال متیل استر و رقیق کننده داخل هر یک از بالن ها ریخته شد. درنهایت اسیدهای چرب استخراج شده توسط پیپت پاستور به درون میکروتیوب های ml 5/1 منتقل و تا زمان تزریق به دستگاه کروماتوگرافی گازی در فریزر نگهداری شدند. پس‌ از تهیه‌ محلول‌ نهایی‌ مقدار ۱ میکرولیتر از آن به‌ دستگاه‌ کروماتوگرافی‌ گازی تزریق‌ گردید‌.
نمونه ها به دستگاه کروماتوگرافی گازی (مدلAgilent technologies 7890A، ساخت آمریکا) تزریق شدند. آشکارساز این دستگاه از نوع یونیزاسیون شعله ای (FID)42 است که شعله آن از سوختن گاز هیدروژن با هوا تامین می گردد و از گاز نیتروژن به عنوان گاز حامل در این دستگاه استفاده می شود. در نهایت‌ اسیدهای چرب مختلف با استفاده از مقایسه زمان بازداری هر اسید چرب در ترکیب استاندارد اسیدهای چرب و نمونه ها شناسایی شدند و میزان هر اسید چرب با توجه به سطح زیر منحنی نمودار آنها نسبت به سطح زیر منحنی کل اسیدهای چرب هر نمونه‌ و متیل استر کل استخراج شده از هر گرم وزن تر آرتمیا محاسبه‌ شدند (Lepage and Roy, 1984).

شکل ۳-۷. دستگاه GC برای تعیین میزان اسیدهای چرب.

۳-۱۱- آنالیز آماری
قبل از مقایسه میانگین ها، ابتدا نرمال بودن داده ها به کمک آزمون کولموگروف-اسمیرنوف۴۳ بررسی شد. جهت تجزیه و تحلیل داده ها با توجه به تعداد تیمارهای قابل مقایسه از روش آنالیز واریانس دوطرفه۴۴ (Multivariate) یا tIndependent samples T-tes، نرم افزار SPSS (نسخه ۱۶) و آزمون دانکن۴۵ استفاده شد. در تمام بررسی ها، سطح معنی دار بودن آزمون ها ۰۵/۰ P در نظر گرفته شد.

۴-نتایج
تراکم های مختلف آرتمیا و غلظت های متفاوت روغن کلزا اثرات متفاوتی بر میزان طول کل و درصد بقا و میزان اسیدهای چرب ناپلیوس های آرتمیا ارومیانا و آرتمیا فرانسیسکانا غنی شده دارند که در برخی از تراکم های ناپلی و غلظت های مختلف روغن مقدار آن ها بیشتر و در تراکم ها و غلظت های خاصی میزان این فاکتورها حداقل بود. میزان طول کل و درصد بقای ناپلیوس های آرتمیا فرانسیسکانا و آرتمیا ارومیانا طی غنی سازی تحت تاثیر تراکم ها و غلظت های متفاوت در جداول ۳-۱ و ۳-۲ آمده است. همچنین پروفیل اسیدهای چرب ناپلی آرتمیا فرانسیسکانا و آرتمیا ارومیانا قبل از عمل غنی سازی در جدول ۳-۳ آورده شده است. میزان اسیدهای چرب مختلف در دو گونه نیز در جداول ۳-۴، ۳-۵، ۳-۶، ۳-۷، ۳-۸، ۳-۹، ۳-۱۰، ۳-۱۱ مورد بررسی قرار گرفته اند.

۴-۱- تغییرات میزان طول کل و درصد بقا در دو گونه آرتمیا فرانسیسکانا و آرتمیا ارومیانا با تراکم های متفاوت ناپلی و غلظت های مختلف روغن کلزا در ۵ زمان متفاوت
میانگین طول کل و درصد بقا در هر دو گونه با تراکم های ۵۰۰۰۰، ۱۰۰۰۰۰ و ۲۰۰۰۰۰ در غلظت های ۱/۰، ۲/۰ و ۳/۰ گرم در لیتر
روغن کلزا به مدت ۶، ۹، ۱۲، ۱۵ و ۱۸ ساعت غنی سازی در جداول ۴-۱ و ۴-۲) آورده شده اند. لازم به ذکر است که طول اولیه آرتمیا فرانسیسکانا و آرتمیا ارومیانا به ترتیب ۵±۶۵/۰ و ۵±۵۵/۰ میلی متر بودند.

جدول ۴-۱- طول کل و درصد بقا در آرتمیا فرانسیسکانا با تراکم های متفاوت ناپلی و غلظت های مختلف روغن کلزا در ۵ زمان متفاوت (میانگین ± انحراف از معیار)
تراکم (ناپلیوس در لیتر)
مدت زمان غنی سازی (ساعت)
غلظت (گرم در لیتر)
طول کل (میلی متر)
بقا (%)

میانگین
انحراف از معیار
میانگین
انحراف از

متن کامل پایان نامه ها در 40y.ir

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *