پایان نامه ها

هاي، رويان، ريزنمونه، مي، al,، محيط

ت آمده است. این بررسی ها ممکن است مدل های مفیدی زمانی که ژن های مطلوب به جای ژن های گزارشگر یا نشانگر گزینشگر به درون گیاهان هدف انتقال می یابند، ارائه دهد (Stachel et al, 1986). اين پژوهش به منظور انجام كشت بافت دو رقم استاندارد و مينياتور ميخك و ارزيابي شرايط بهينه انتقال ژن با استفاده از tumefaciens Agrobacterium به آن ها صورت گرفته است.

فصل دوم

2- مروري بر پژوهش هاي پيشين2-1- ريزافزايي و کشت بافت ميخک2-1-1- گزينش ريزنمونه و گندزدايي سطحي آناولين گام در هر برنامه کشت بافت موفق، گزينش يک منبع ريزنمونه مناسب و به دنبال آن تعيين بهترين تيمار گندزدايي است. به صورت فراگير هر بافت يا اندام گياهي را مي توان به عنوان ريزنمونه به کار گرفت، اما درجه موفقيت به سيستم کشت به کار رفته، گونه کشت شده و حذف آلوده گرهاي سطحي از ريزنمونه بستگي دارد. صالحي (ُSalehi, 2006)، تيمار گندزدايي سطحي مناسب برای ريزنمونه هاي نوک شاخساره ميخک را چنين گزارش کرد: ريزنمونه ها پس از شستشوي ابتدايي به مدت 10 دقيقه در محلول شوينده (ريکا) قرار گرفته، سپس به مدت 1 ساعت در زير آب جاري قرار داده شده و سپس به مدت 5/0 يا 1 دقيقه در اتانول 70% و به دنبال آن 15 دقيقه در کلراکس 10% گندزدايي شدند. دلجو و همکاران (Delju et al., 2006)، تيمار گندزدايي جهت جوانه هاي گل نابالغ 4 رقم ميخک را شامل گندزدايي سطحي با اتانول 70% به مدت 30 ثانيه و استفاده از ماده شوينده تجاري 2% به مدت 20 دقيقه و در پايان 3 بار آبکشي با آب مقطر گندزدایی شده را مناسب تشخيص دادند. نانتاسواتسري و همکاران (Nontaswatsri et al 2002) شاخساره هاي 5 رقم ميخک به طول 5 تا 8 سانتي متر را از گياهان مادري رشد يافته در گلخانه جدا نموده و به مدت 15 دقيقه در محلول کلراکس 10% همراه با يک قطره Tween-20 قرار دادند، سپس 2 بار و هر بار 10 دقيقه در آب گندزدایی شده آبکشي گرديدند. آلتورست و همکاران (Altworst et al. 1994) از ريزنمونه هاي برگ به عنوان مواد شروع کننده براي باززايي گياه استفاده کردند. در پژوهشي از بذرهاي رقم ’Chabaud‘ ميخک و رقم ’Tall Double Mix‘ قرنفل به عنوان ريزنمونه استفاده شد. بذرها نخست به مدت 3 تا 4 دقيقه در محلول کلريد نقره 1/0% گندزدايي سطحي شده و سپس 3 مرتبه با آب مقطر گندزدایی شده آبکشي شدند (Pareek and Kothari, 2003).
واتاد و همکاران (Watad et al. 1996) ريزنمونه هاي ساقه میخک را پس از گندزدايي سطحي به مدت 15 دقيقه در محلول هيپوکلريت سديم 2% حاوي 01/0% Tween-20 و به دنبال آن 3 بار آبکشي هر بار به مدت 2 دقيقه با آب گندزدایی شده به کار بردند. مسگوئر و همکاران (Messeguer et al, 1993) از برگ و قطعات پايه اي گل و گلبرگ به عنوان ريزنمونه استفاده کردند. مسن ترين برگ ها دور ريخته شده و جوانه هاي گل و قلمه ها در محلول شوينده تجاري حاوی هيپوکلريت سديم 5% به مدت 20 دقيقه گندزدايي سطحي شده و به دنبال آن 3 مرتبه با آب مقطر گندزدایی شده آبکشي گرديدند. آن ها بيان داشتند که گلبرگ هاي نابالغ و قطعات پايه اي گل ظرفيت ريخت زايي بالايي دارند.
آلتورست و همکاران (Altvorst et al, 1992) از برگ و گلبرگ گياهان کشت بافتي به عنوان منبع ريزنمونه براي تشکيل شاخساره نابجا استفاده کردند. آن ها نتوانستند رابطه اي بين ظرفيت باززايي برگ ها و گلبرگ هاي ارقام مختلف پيدا کنند. باززايي از ريزنمونه هاي برگ بيشتر موفق بود و شاخساره ها در مدت کمتري از ريزنمونه هاي برگ نسبت به گلبرگ باززايي شدند.
کانتيا و کوساري (Kantia and Kothari, 2002) بيان داشتند که نوع ريزنمونه استفاده شده براي افزونگري همگروهي احتمال تغييرات ژنتيکي را تحت تأثير قرار مي دهد. ريزنمونه هاي برگ مواد مناسبي براي تشکيل شاخساره نابجا و آزمايشات انتقال ژن توسط اگروباکتريوم مي باشند. آن ها همچنين بيان داشتند موقعيت (مکان) برگ ها روي گياه در باززايي بعدي مهم می باشد و جوان ترين برگ ها تنها زير مريستم انتهايي بهترين باززايي را نشان دادند.
2-1-2- ريخت زايي و باززايي باززايي گياه، با کشت قطعه اي از بافت گياهي عاري از بافت مريستمي از پیش تشکیل شده (منشأ نابجا)، يا از کشت یاخته ای و بافت پينه امکان پذير است. باززايي گياه به روش پرآوري جوانه جانبي بر مبناي وجود بافت مريستمي از پيش تشکيل شده مي باشد. در مقابل، باززايي نابجا از مکان هاي غيرمعمول از يک بافت کشت شده مانند سطح برگ، لپه، ميانگره، دمبرگ و … که بافت مريستمي به طور طبيعي در اين مناطق وجود ندارد، صورت مي پذيرد (Chawla, 2000). آلتورست و همکاران (Altvorst et al, 1995) نشان دادند که باززايي تنها در ناحيه انتقالي از ساقه به برگ يعني پايه برگ امکان پذير است. آن ها همچنين بيان داشتند که موقعيت يا مکان برگ روي گياه براي باززايي بعدي داراي اهميت است و جوان ترين برگ ها بيشترين توانايي باززايي را دارند. نانتا سواتسري و فوکاي (Nontaswatsri and Fukai, 2005) نشان دادند که ريزنمونه هاي گره اي پتانسيل بيشتري براي توليد شاخساره نسبت به ريزنمونه هاي برگ دارند.
اميرعلي و همکاران (Amirali et al, 2008) پيشنهاد کردند که کاربرد مريستم انتهايي در مقايسه با مريستم گره اي براي پرآوري شاخساره مناسب تر است. آلتورست و همکاران (Altvorst et al, 1992)، جوان ترين برگ هاي گسترش يافته زير مريستم انتهايي را مناسب ترين ريزنمونه برای باززايي تشخيص دادند.
مسگوئر و همکاران (Messeguer et al, 1993) نشان دادند که باززايي شاخساره تنها در نواحي پايه اي قطعه های گلبرگ امکان پذير مي باشد. فيشر و همکاران (Fisher et al. 1992) اثبات نمودند که شرايط کاشت بيش از ظرفيت ريخت زايي قسمت هاي مختلف گلبرگ براي باززايي شاخساره اهميت دارند.
2-1-3- رويان زايي بدني رويان زایی بدني عبارتست از تشکيل رويان از یاخته های بدنی در شرايط درون شيشه اي به طوري که اين رويان ها شبيه به رويان معمولي درون بذر مي باشند و قادرند به صورت گياه کامل نمو پيدا کنند. از اين روش کشت بافت مي توان به صورت ابزاري براي بررسي هاي پايه نظير بيوشيمي، فيزيولوژي، مورفولوژي و تشريح که در بسياري از دستاوردهاي فناوری زیستی مانند انتقال ژن، حفظ ژرم پلاسم، توليد بذر مصنوعي، توليد متابوليت هاي ثانويه، ايجاد گوناگوني ژنتيکي و حذف ويروس از گياه استفاده نمود (Chawla, 2000). گزارش هاي بسياری نشان داده اند که گياه ميخک از راه تشکيل شاخساره نابجا روي ريزنمونه هاي مختلف مانند ساقه، برگ، گلبرگ، نهنج، تخمدان و تخمک باززايي شده است (Edtington et al. 1984)، در حالي که گزارش هاي اندکي در مورد باززايي اين گياه از راه رويان زايي بدنی انتشار يافته است (Fery et al, 1992،,1998 Vicient and Martinez). برخی اوقات رويان هاي بدني نسبت به ديگر روش هاي افزایش رويشي مطلوب تر مي باشند که به سبب احتمال تنظيم افزایش با استفاده از بيوراکتورها مي باشد (Vicient and Martinez, 1998).
بیشتر رويان هاي بدني يا کشت هاي روياني مي توانند در دماي 196- درجه سلسیوس نگهداري شوند (Von Arnold et al., 2002) که این روش امکان ايجاد بانک هاي ژني را فراهم مي سازد. افزون بر این، رويان زايي بدني شرطی مهم براي شماري از ابزارهاي فناوری زیستی برای بهبود ژنتیکي مي باشد (Sankhla et al, 1995). همچنين رويان هاي بدني نقشی کليدي در روش هاي انتقال ژن بازي مي کنند (Yantcheva et al, 1995.).
فري و همکاران (Fery et al, 1992) ايجاد رويان بدني از پينه هاي حاصل از ريزنمونه هاي ساقه گياه ميخک را گزارش کردند. در اين پژوهش ويژگي هاي ريخت شناسي و تشريحی پينه هاي غير رويان زا و پينه هاي رويان زا به دست آمده از ريزنمونه هاي گلبرگ و رويان هاي بدني گياه ميخک شرح داده شده است. دلجو و همکاران (Deljou, 2006)، اثر غلظت هاي مختلف سوکروز بر رويان زايي بدني 4 رقم ميخک را مورد بررسي قرار دادند. در پژوهش ايشان از ريزنمونه هاي گلبرگ ارقام ميخک استفاده شد. در اين پژوهش مشخص شد که با افزايش غلظت سوکروز در محيط کشت، رويان زايي بدني گسترش مي يابد. بيشترين ميزان پينه هاي رويان زا، از محيط کشت داراي 9 و 12 درصد سوکروز به دست آمد، در حالي که در غلظت هاي بالاتر از 15 و 18 درصد کاهش يافت. نتايج اين پژوهش نشان داد که غلظت هاي بالاتر سوکروز بلوغ رويان هاي بدني را بهبود مي بخشد.
از جمله عوامل مؤثر بر انگيزش رويان هاي بدني و نمو بعدي گياه مي توان به موارد زير اشاره کرد:
2-1-3-1- تنظيم کننده هاي رشدافزودن تنظيم کننده هاي رشد به ويژه اکسين و يا اکسين به همراه سيتوکينين براي شروع رشد و انگيزش رويان زايي ضروري است (Feher et al, 2003). به هر حال، نمو رويان در رويان هاي بدني در نبود تنظيم کننده هاي رشد نيز گزارش شده است (Choi et al, 1998). انگيزاننده هاي غير هورموني همچنين براي افزایش رويان زايي بدني استفاده مي شوند. برخي از اين انگيزاننده ها شامل غلظت هاي بالاي سوکروز يا تنش اسمزي (Kamada et al, 1993)، يون هاي فلزات سنگين (Pasternak et al, 2002) و دماي بالا (Kamada et al, 1989) مي باشد. دلجو و همکاران (Deljou, 2006) اثر مانيتول بر رشد رويان هاي بدني توليد شده از پينه رويان زاي ميخک را بررسي کردند. آن ها بيان داشتند که در محيط کشت حاوي مانيتول بدون سوکروز رويان بدنی ايجاد نشد. اگر چه نقش دقيق مانيتول روي افزايش تعداد رويان ها از پينه هاي رويان زاي ميخک مشخص نيست اما با توجه به اين که وجود سوکروز در محيط حاوي مانيتول براي رويان زايي ضروري است مي توان نتيجه گرفت که اثر مانيتول روي افزايش تعداد رويان ها به عنوان منبع تأمين کربن مؤثر نبوده، بلکه به احتمال با تغييرات پتانسيل اسمزي ناشي از حضور مانيتول در ارتباط است. اثر 2,4-D و پس از آن NAA بر رويان زايي بدني بيش از ديگر اکسين ها مي باشد. آن ها در تسریع بلوغ رويان، به ويژه در رشد لپه ها مؤثر هستند. در برخی مواقع سيتوکينين ها براي رشد رويان و تبديل آن به گياهچه لازمند (Tanaka et al, 2000).
به هر حال، در داوودي كاينتين در تركيب با يك اكسين به ويژه IAA براي تحريك رويان زايي بدني گزارش شده است (Tanaka et al, 2000). تیدیازورون به تنهايي يا در تركيب با ديگر تنظيم كننده هاي رشد براي تحريك رويان زايي بدني در تعدادي از گونه هاي گياهي گزارش شده است (Zhang et al, 2005).
اينتچوا و همكاران (Iantcheva et al, 2005) باززايي گياه از راه اندام زايي مستقيم و رويان زايي بدني دو رقم ميخك مينياتور را مورد بررسي قرار دادند. در اين پژوهش محيط موراشیگی و اسکوگ (MS)( Murashige and Skoog, 1962) جامد حاوي BAP و NAA برای انگيزش مستقيم شاخساره هاي نابجا استفاده شد. محيط كشت مناسب برای باززايي هر دو رقم شامل محيط MS حاوي 9/0 ميلي گرم در ليتر BAP و 9/0 ميلي گرم در ليتر NAA بوده است. در اين پژوهش وجود 2,4-D در تركيب با BAP و كازيين هيدروليزشده به طور موفقيت آميزي در انگيزش پينه رويان زا مؤثر واقع شد.
2-1-3-2- محيط پينه زاييپينه يك بافت گياهي كم و بيش سازمان نيافته است كه در زخم هاي بافت ها و اندام هاي تمايز يافته، به وجود مي آيد. بنابراين پينه يك بافت سازمان نيافته با تمايز خيلي پايين است (Chawla, 2000). تشكيل پينه زیر تأثير مواد تنظيم كننده رشد برون زا كه به محيط كشت افزوده مي شوند، قرار مي گيرد. نوع ماده تنظيم كننده رشد مورد نياز و غلظت مصرفي آن در محيط كشت به شدت به نژادگان و محتواي هورموني درون ريزنمونه بستگي دارد (Chawla, 2000). در پژوهشي روي ميخك تشكيل پينه روي محيط كشت MS داراي 30 گرم در ليتر سوكروز، 2 ميلي گرم در ليتر2,4-D و 2/0 ميلي گرم در ليتر BA حاصل شد (Karami and Kordestani, 2007 ).
آرچنا و كوتاري (Archana and Kothari, 2002) در بررسی براي تشكيل جوانه هاي شاخساره نابجا همراه با تشكيل پينه، از ريزنمونه هاي برگ میخک كشت شده روي محيط كشت MS حاوي 5/0 ميلي گرم در ليتر BAP و 1 ميلي گرم در ليتر 2,4-D استفاده كردند.
در پژوهش هاي بسياري (Altvorst et al, 1996) اثر قسمت انتهاي نزد پاهنگ برگ در باززايي تاييد شده است. اينتچوا و همكاران (Iantcheva et al, 2005) پيشنهاد كردند كه محيط كشت مناسب براي انگيزش پينه شامل MS جامد داراي 1 ميلي گرم در ليتر 2,4-D، 2/0 ميلي گرم در ليتر BAP، 3% سوكروز و 8 گرم آگار مي باشد.

2-1-3-3- محيط ريشه زاييمحيط ريشه زايي استفاده شده براي ارقام ميخك به شدت وابسته به نژادگان بوده و نمي توان محيطی عمومي براي ريشه زايي همه ارقام پيشنهاد نمود (Messeguer et al, 1993؛ Salehi 2005). ميروشنچنكو و دولگوو (Miroshnichenko and Dolgov, 2000) محيط MS نيم غلظت داراي 7% آگار و 10 گرم در ليتر سوكروز را مناسب ريشه زايي ريزنمونه هاي برگ و گلبرگ گندزدايي شده رقم 12’Dia ‘ تشخيص دادند. آرچنا و كوتاري (Archana and Kothari, 2002) براي تشكيل ريشه از ريزنمونه هاي برگD. chinensis L. محيط MS نيم غلظت داراي 5/0 ميلي گرم در ليتر IAA را پيشنهاد نمودند. بهترين محيط ريشه زايي با استفاده از شاخساره هاي پرآوري شده از ريزنمونه هاي مريستم انتهايي و مريستم تک گره شامل محيط MS با 1 ميلي گرم در ليتر NAA تشخيص داده شد. در پژوهشي توسط اينتچوا و همكاران (Iantcheva et al, 2005) تشكيل گياهان با پديدگان معمولي و ريشه دهي آسان روي محيط MS حاوي 05/0 ميلي گرم در ليتر BAP و 250 ميلي گرم در ليتر كازيين هيدروليز شده به دست آمد.
آلتورست و همكاران (Altvorst et al, 1992) محيط مناسب برای انگيزش ريشه در شاخساره هاي پرآوري شده از ريزنمونه هاي برگ ميخك انواع ’Sim‘، ’ Mediterrenean ‘، ’ ‘Spray و ’Diantini ‘را محيط MS محتوي 1/0 ميلي گرم در ليتر NAA گزارش نمودند. در بررسی بهترين محيط ريشه زايي براي شاخساره هاي پرآوري شده از ريزنمونه هاي برگ گونه هاي ميخك، محيط MS همراه با 1 ميلي گرم در

متن کامل پایان نامه ها در 40y.ir

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *