تکثیر، اين، كه، RAPD، ژنتیکی، نشانگر

، 2000).
2-10نشانگرهایDNA
تاکنون انواع مختلف نشانگرهای DNA با تفاوت‏های زیاد از نظر تکنیکی و روش تولید، نحوه کاربرد، امتیازبندی، تجزیه و تحلیل و تفسیر نتایج به سرعت ابداع و معرفی گردیده‏اند. در این نشانگرها توالی خاصی از مولکول DNA به راحتی آشکار شده و توارث آن قابل رؤیت است. این نشانگرها اطلاعات مفیدی را در تعیین خصوصیات منابع ژنتیکی گیاهی، ارزیابی تنوع ژنتیکی و روابط خویشاوندی فراهم می‏آورند.استفاده از این نشانگرهای مولکولی، بر پایه چندشکلی طبیعی در DNA می‏باشد و بدون تردید ابداع و معرفی واکنش زنجیره‏ای پلی‏مراز یا PCR، بیشترین نقش را در توسعه و تکامل نشانگرهای DNA داشته است.نشانگرهای مولکولی مبتنی بر DNA بسته به چگونگی نشان دادن چندشکلی، به دو دسته کلی تقسیم می‏شوند.
الف) نشانگرهای DNA غیر مبتنی بر واکنش زنجیره‏ای پلیمراز
ب- نشانگرهای DNA مبتنی بر واکنش زنجیره‏ای پلیمراز
2-11واکنش زنجیره‏ای پلی‏مراز (PCR)
واکنش PCR تکنیک بسیار قوی و نوینی است که در مدت زمان بسیار کوتاهی تکثیر ردیف منتخب و مورد نظر از مولکول DNA را فراهم می‏سازد (بهار و همکاران، 1385 و باسیل و همکاران، 2006). این فرایند در حقیقت تقلیدی از فرایند همانندسازی DNA در طبیعت است. اين تكنيك در سال 1985 به وسيله کری مولیسو همكارانش ابداع شد و اكنون كاربردهاي نامحدودي در تمامي حوزهها يافتهاست (نیکولاس، 1996).
اين تكنيك ساده امكان ايجاد رونوشتهايي نامحدود از قطعات خاصي از DNA را فراهممينمايد. DNA الگوكه PCR روي آن انجام ميگيرد، ميتواند DNA ژنومي و يا قطعهاي از DNA باشد.PCR تقريباً يك ميليون رونوشت از قطعهاي كوچك از DNA الگو ايجاد مينمايد كه اين مقدار براي استفاده در هر نوع مطالعه ژنتيكي (رديف يابي، انتقال ژن، هضم آنزيمي و غيره) كافي است. قبل از انجام PCR لازم است رديف قطعهاي كه بايد تكثير شود و يا حداقل رديف هر دو انتهاي آن شناسايي گردد. با استفاده از اين رديفها دو قطعه‏ی چند نوكلئوتيدي كه هر يك حدود 20 باز طول دارند طراحي و ساخته ميشود كه يكي از آنها مكمل پايانهʹ3يكي از رشتههاي قطعهاي است كه تكثير خواهد شد و ديگري نيز مكمل پايانهʹ3 رشته ديگر ميباشد. از آنجاييكه وجود اين دو قطعه‏ی چند نوكلئوتيدي براي شروع سنتز رشتههاي جديد DNA لازم است، آنها را آغازگر مينامند. DNAالگو، آغازگرها، مقداري دياكسينوكلئوتيدها شامل نوكلئوتيدهاي گوانين ((G ، سيتوزين (C)، تيمين (T) و آدنين (A) و مقداريآنزيم DNAپليمراز در داخل تيوب كوچكي قرارداده ميشوند. براي آنكه DNA الگو واسرشته شدهو دو رشته آن از هم جدا شوند، مخلوط مذكور تا حدود 95 درجه سانتیگراد گرم ميگردد. كاملاً واضح است كه با اين وصف آنزيم DNAپليمراز موجود بايد بتواند دماهاي بالاي اين مرحله را تحمل نمايد. شكلي از اين آنزيم كه معمولاً مورد استفاده قرار ميگردد، تکپليمراز است كه از باكتريگرمادوست Thermus aquaticus حاصل ميگردد. پس از مرحله واسرشتهسازي، دما به حدود60-50 درجه سانتیگراد كاهش داده ميشود تا امكان اتصال آغازگرها به رديفهاي مكمل مربوطه فراهم گردد. اين مرحله را مرحله جفت شدن ميگويند. به محض اتصال آغازگرها، دما به حدود 70 درجهسانتیگراد افزايش داده ميشود. اين دما براي فعاليت آنزيم تکDNAپليمراز مناسب است. در اين مرحله كه مرحله بسطناميده ميشود، آنزيم به انتهايʹ3 هر آغازگر وصل شده و ساخت و بسط رشته جديد را آغاز مينمايد. پس از طي زمان كافي براي ساخت رشتههاي جديد، مجدداً دما تا95 درجهسانتیگراد افزايش داده ميشود و بدين ترتيب چرخهي جديد از واكنش آغاز ميگردد و سه مرحله قبلي اين بار بر روي DNA دو رشتهاي جديد صورت ميگيرد و اين رشتهها خود به عنوان الگو براي چرخههاي بعدي عمل خواهند كرد. طول هر چرخه كه چرخه تكثير ناميده ميشود حدود 5 دقيقه است (نیکولاس، 1996).
چرخههاي تكثير معمولاً در ماشينهاي PCRكه از نظر طول و دماي هر مرحله در هر چرخه دقيقاً قابل برنامهريزي و كنترل هستند، انجام ميگردد. تعداد چرخهها 30 تا 35 بار ميباشد. نتيجه اين تعداد چرخه بين 230 تا 235 رونوشت از قطعه مورد نظر است كه معادل حدود يك ميليون قطعه مشابه ميباشد (اين مقدار رونوشت فرآوردهPCRناميدهميشود). در عمل، اين تكثير نمايي كامل نيست ولي احتمال رسيدن به حداقل يك ميليون بار تكثير و در نتيجه بدست آوردن يك ميكروگرم فرآورده PCR بسيار زياد است (نیکولاس، 1996).
واکنش زنجیره‏ای پلی‏مراز از زمان شروع، در بسیاری از روش‏های استاندارد زیست‏شناسی مولکولی و بیوتکنولوژی انقلاب ایجاد کرده و باعث تولید نشانگرهای مختلفی از قبیل DAF، STS، RAPD، DFLP، SCAR، RGA، ISA، ISSR، PBR، CAPs، ALPs، RT-PCR، AP-PCR، MP-PCR و SSR شده است از نشانگرهای فوق نشانگرهای RAPDs، RFLPs، AFLPs و SSRs بیشترین استفاده را برای مطالعات تاکسونومیک و تکاملی داشته‏اند (کارپ و همکاران، 1997). از نظر کاربردی نشانگرهای بارز برای استفاده در مطالعات تنوع ژنتیکی، همسانه‏سازی مکانی و اشباع سریع نقشه‏های ژنتیکی مناسب‏اند و در مقابل، نشانگرهای هم‏بارز جهت تهیه و افزایش دقت نقشه‏های عمومی برای یک گونه، نقشه‏یابی مقایسه‏ای بین گونه‏ها، نقشه‏یابی جایگاه‏های صفات کمی(QTLs)، تهیه نقشه‏های ژنی و مطالعات ژنتیک کاربرد بیشتری دارند (دوین، 2003). هر کدام از این نشانگرهای DNA مجموعه‏ای از مزایا و معایب را در نوع وراثت، تکرارپذیری، میزان اطلاعات بدست آمده، میزان پیچیدگی روش و همچنین جنبه‏های اقتصادی از قبیل هزینه و زمان مورد نیاز تا حصول نتیجه نهایی را دارا هستند (راکوکزی، 2004). از این رو لازم است که قبل از کاربرد هر کدام از آنها سودمندی و کارایی نشانگر سنجیده و ارزیابی شود (کومار و فیلیپسکی، 2001). یک نشانگر مناسب بایستی قابل دسترس بوده و تفسیر نتایج آسانی داشته، از تکرارپذیری بالایی برخوردار بوده و وراثت هم‏بارز داشته باشد. همچنین باید فراوانی مناسب در ژنوم، دامنه هتروزیگوسیتی بالایی را نشان دهد (دوین، 2003). از میان انواع نشانگرهای مولکولی، ابتدا نشانگرهای RAPD، AFLP، RFLP و SSRکه عمومی‏تر بوده و از اهمیت بیشتری برخوردارند، بطور مختصر توضیح داده شده و نشانگر ریزماهواره نیز جداگانه و به تفصیل شرح داده خواهد شد.
2-12DNA چند شکل تکثیر شده تصادفی (RAPD)
نشانگر RAPD نخستین‏بار در سال 1990 به طور همزمان ولی به صورت مجزا توسط دو گروه ویلیامز و همکاران و نیز ولش و مک‏کللند به عنوان یکی از روش‏های آشکارسازی چندشکلی ژنتیکی در گیاهان معرفی شدند (ویلیامزو همکاران، 1990). این روش مبتنی بر واکنش زنجیره‏ای پلیمراز با یک آغازگردلخواه الیگونوکلئوتیدی به طول 9 تا 10 باز می‏باشد (ولش و مک‏کللند، 1990 و ویلیامز و همکاران، 1990). که معمولا ردیف بازی آغازگرها به طور قراردادی تعیین می‏گردد و طی واکنش یک تک آغازگر نقاط مکمل خود را بر روی رشته DNA پیدا کرده و به آن متصل می‏شود. چنانچه محل اتصال آغازگرها بر روی دو رشته مقابل، به هم نزدیک باشد (اغلب کمتر از bp2000)، قطعه DNA بین آن دو نقطه طی واکنش زنجیره‏ای پلیمراز تکثیر خواهد شد (لیو، 2004). این آغازگرها دارای 80-60 درصد باز G/C می‏باشند و دمای اتصال نیز برای آن‏ها تا اندازه‏ای پایین می‏باشد. قطعات DNA تکثیر یافته با روش RAPD در سراسر ژنوم توزیع یافته است و می‏تواند توالی‏های منحصر به فرد و تکراری را در بر گیرد (ویلیامز و همکاران، 1990). در RAPD فرآورده‏های واکنش PCR معمولا بر روی ژل آگارز از یکدیگر جدا می‏شوند و بوسیله رنگ‏آمیزی با اتیدیوم بروماید قابل مشاهده خواهند بود. بطور معمول هرآغازگر تکثیر چندین جایگاه مختلف را در DNA ژنومی هدایت خواهد کرد. وجود یا عدم وجود یک باند واحد در ژل‏های RAPD حاصل جهش نقطه‏ای در محل اتصال آغازگرها و اضافه یا حذف شدن در ناحیه بین مکان‏های اتصال آغازگرهاست (لیو، 2004).
از مزایای نشانگر RAPD می‏توان به سادگیروش کار، سرعت بالای کاربرد، هزینه کم، عدم نیاز به اطلاعات اولیه در مورد توالی DNA، عدم قرارگیری تحت تأثیر کیفیت DNA، امکان بررسی همزمان چندین جایگاه و عدم نیاز به کاوشگر و مواد رادیواکتیو اشاره نمود (وولی و همکاران، 2000؛ ویرک و همکاران، 2000 و احمدی‏خواه، 2008).قدرت RAPD در نمایش چندشکلی، نسبتاً بالاست و تقریباً برای هر آغازگر 20-5 باند تولید می‏کند، لذا برای بررسی کل ژنوم لازم است آغازگرهای متعددی استفاده شود (لیو، 2004). همچنین مطالعات نشان داده است که بخش زیادی از نوارهای RAPD در صورتی که در آزمایشات با رعایت دقت لازم تکرار انجام شود دارای تکرارپذیری بالاو نتایجقابل اعتمادی خواهد بود (ویسینگ و همکاران، 2005).
از معایب این روش می‏توان به موارد زیر اشاره نمود: 1- ممکن است که قطعات متفاوتی ازDNA با طول مشابه و یکسان، به عنوان یک جایگاه در نظر گرفته شوند، به همین دلیل نباید در مطالعات RAPD به یک گونه یا مجموعه‏ای از گونه‏های نزدیک محدود شد، 2- به دلیل تکرارپذیری کم ناشی از دمای اتصال پایین، احتمال تکثیر تعداد زیادی محصول بی اهمیت انتخابی وجود دارد، 3- حساسیت زیاد به آلودگی و تغییرات شرایط PCR، 4- به دلیل تکرارپذیری پایین این نشانگر، امتیازدهی باندهای آن تا حدودی اختیاری است و نتایج حاصل از آن برای مطالعات تاکسونومیکی در سطح گونه‏ها و تعیین گونه، قابل تردید است که البته امروزه مشکل اخیر به واسطه تکنیک‏های آزمایشگاهی پیشرفته و روش‏هایجدید امتیازدهی باندها تا حدودی مرتفع شده است. 5- همچنین مطالعات انجام شده نشان می‏دهد که نشانگرهای RAPD در مقایسه با سایر نشانگرها، فاصله ژنتیکی افراد غیر خویشاوند را کمتر از مقدار واقعی نشان می‏دهند (لیو، 2004 و پاول و همکاران، 1996).
از مهم‏ترین کاربردهای نشانگرهای RAPDمی‏توان به مطالعه ژنتیکی، تجزیه و تحلیل مجموعه‏های ژرسم‏پلاسم، ارزیابی روابط فیلوژنی و بررسی ژنتیک افراد، شناسایی نشانگرهای پیوسته با صفات مورد نظر، تکمیل نقشه‏های ژنتیکی، ایجاد نقشه‏های فیزیکی، مکان‏یابی و جداسازی ژن‏ها، شناسایی ارقام و مطالعات ژنتیک جمعیت اشاره نمود (نقوی و همکاران، 1386).
2-13چندشکلی طول قطعات برش یافته (RFLPs)
نخستین بار بوتستین و همکاران در سال 1980 روش RFLP را برای تهیه نقشه لینکاژ ژنتیکی در انسان ارائه دادند. در این روش توالی‏هایی که دارای نسخ کمی در ژنوم هستند، توسط رادیوایزوتوپ‏ها یا با استفاده از روش‏های بیوشیمیایی نشاندار شده و به عنوان کاوشگر جهت شناسایی قطعات متناظر در DNA متعلق به نمونه‏های متعدد مورد استفاده قرار می‏گیرند (بوتستین و همکاران، 1980).
در گذشته با استفاده از آزمون لکه‏گذاری سادرن، قطعات از یکدیگر تفکیک و بررسی می‏شدند ولی در روش‏های جدیدتر، تکنیک‏های مبتنی بر PCR جایگزین آن شده است. اگر توالی‏های اطراف جایگاه مورد نظر شناخته شده باشد، قطعات حاوی ناحیه RFLP توسط PCR تکثیر می‏شوند، در صورتیکه چند شکلی طولی، حاصل موتاسیون‏های حذف و اضافه نسبتاً بزرگ (تقریباً بزرگتر از 100 جفت باز)، چندشکلی بر اساس اندازه حاصل می‏شود، در حالی‏که اگر چند شکلی طولی حاصل جایگزینی نوکلئوتید در محل سایت برش آنزیم باشد، محصول PCR بایستی توسط یک آنزیم برشی، برش داده شود تا چندشکلی RFLP بدست آید (لیو، 2004).
از مهمترین مزایای نشانگرهای RFLP این است که این نشانگر، ماهیت وراثت هم‏بارز داشته و از تکرارپذیری و دقت بالا و فراوانی مناسبی برخوردار است. راحتی تفسیر نتایج و امتیازدهی آسان باندها به دلیل تفاوت زیاد اندازه قطعات، از دیگر مزایای این نشانگر محسوب می‏شود (لیو، 2004).
تکنیک RFLP در موارد شناسایی ارقام، تهیه نقشه‏های ژنتیکی، ارزیابی ذخایر ژنتیکی و گزینش غیر مستقیم به کمک نشانگر استفاده می‏شود و هنوز هم با وجود معایبی چون گران بودن، زمان‏بر بودن، نیاز به مقدار نسبتاً زیاد DNA، نشان دادن آلل‏های مشابه در گونه‏های بسیار نزدیک و مهم‏تر از همه، سطح پایین چندشکلی ایجاد شده نسبت به پیچیدگی روش، که باعث محدودیت استفاده از آن می‏شود، از قدرتمندترین و معتبرترین نشانگرهای DNA محسوب می‏شود (لیو، 2004 و تستولین و همکاران، 2004).
2-14چندشکلی طول قطعات تکثیر شده(AFLP)
نشانگر AFLP، تکنیکی مبتنی بر واکنش زنجیره‏ای پلیمراز است که توسط ووس و همکاران معرفی گردید و به نظر می‏رسد بسیاری از محدودیت‏های نشانگرهای پیشین را ندارد (ووس و همکاران، 1995). این نشانگر ترکیبی از روش‏های RFLP و PCR است که قطعات برش یافته توسط آنزیم‏های برشی را به صورت تصادفی تکثیر می‏کند. در این روش پس از اتصالسازگارسازها به انتهای قطعات برش خورده، آغازگرهایی تکثیر را شروع می‏کنند که همولوگ با دنباله‏های مذکور ‏‏باشند. افزودن نوکلئوتیدهای دلخواه به انتهای ʹ3 آغازگرها سبب انتخابی بودن تکثیر می‏شود که علاوه بر انتخابی کردن آغازگر، باعث کاهش پیچیدگی فرآورده‏های حاصل نیز می‏گردد (ووس و همکاران، 1995). در واقع اساس این روش تکثیر انتخابی برخی قطعه‏ها از بین تمام قطعه‏های هضم شده DNA است و سه مرحله مجزا را شامل می‏شود: الف) هضم DNA با دوآنزیم برشی متفاوت و اتصال قطعات حاصله به سازگارسازهای الیگونوکلئوتیدی مناسب، ب) تکثیر اولیه تمامی قطعات DNA حاصل از برش و در ادامه، تکثیر انتخابی دسته‏ای از آن‏ها و ج) جداسازی قطعه‏های حاصل از تکثیر انتخابی بر روی ژل‏های توالی‏یابی و مشاهده آن‏ها با استفاده از رنگ‏آمیزی نیترات نقره. هر یک از این قطعه‏ها که به صورت باندی بر روی ژن ظاهر می‏شوند، می‏توانند به عنوان یک نشانگر ژنتیکی مورد استفاده قرار گیرند. تعداد قطعه‏هایی که با این روش مشاهده می‏شوند، به دقت و توانمندی روش‏های الکتروفورز و تعداد نوکلئوتید اضافه شده به انتهای آغازگر بستگی دارد. معمولاً در این روش حدود 50 تا 10 قطعه حاصل از هضم

Author:

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *