al.,، بیماریزایی، syringae، P.، زهرابه، درختان

R PAGEREF _Toc401957100 h 56جدول 3- 9- سیکل دمایی PCR با آغازگر ef1-α PAGEREF _Toc401957101 h 56جدول 3-10- اسامی و توالی آغازگرهای مورد استفاده برای بررسی بیان ژن ها PAGEREF _Toc401957102 h 57جدول 3-11- سیکل دمایی مورد استفاده در واکنش Real-time RT-PCR PAGEREF _Toc401957103 h 58جدول3-12- نوع و مقدار مواد مورد استفاده در واکنش 20 میکرولیتری Real-time RT-PCR برای ژن های اصلی و کنترلی داخلی PAGEREF _Toc401957104 h 58جدول 4-1- مقایسه میانگین جمعیت باکتری Pss در دو فاز مختلف زایشی و رویشی PAGEREF _Toc401957105 h 63جدول 4-2- مقایسه میانگین بیان ژن PR1 PAGEREF _Toc401957106 h 67جدول 4-3- مقایسه میانگین بیان ژن VSP2 PAGEREF _Toc401957107 h 68جدول 4-4- مقایسه میانگین بیان ژن PDF1.2 PAGEREF _Toc401957108 h 70جدول 4-5- مقایسه میانگین بیان ژن LOX2 PAGEREF _Toc401957109 h 71
فصل اول1-1- مقدمهیکی از مهمترین عوامل بیماریزا در گیاهان باکتری های وابسته به جنس Pseudomonas هستند. این گروه از باکتری ها جزو مهمترین بیمارگرهای گیاهی بوده که نقش عمده ای در پایین آوردن کمیت و کیفیت محصولات کشاورزی داشته و دارای گسترش جهانی نیز می باشند، و بیماری هایی از قبیل لکه برگی، بلایت، پژمردگی آوندی، پوسیدگی نرم، شانکر و گال در گیاهان مختلف ایجاد می کنند.
یکی از بیماری های مهمی که توسط باکتری های این گروه ایجاد می شود شانکر باکتریایی درختان میوه هسته دار می باشد که توسط Pseudomonas syringae pv. syringae (Pss) ایجاد می شود و یکی از معضلات کشاورزان در سراسر جهان به شمار می رود .(Vicente et al., 2004) این بیماری خسارت زیادی وارد می سازد و سبب خشک شدن نهال ها و درختان جوان، کاهش محصول در درختان مسن و گاهی خشکیدگی جوانه ها و گل های درختان بیمار می شود و معمولاً در باغ های جوان موجب نابودی درختان به میزان 10 تا 75 درصد می شود (Agrios, 2005). باکتری عامل بیماری شانکر اولین بار از یاس جداسازی و در سال 1902 به این نام نامگذاری شد (Hirano and Upper, 2000). در ایران اولین بار بیماری شانکر باکتریایی از درختان زردآلو در اصفهان گزارش و میزان خسارت ناشی از آن 22 تا 50 درصد ذکر گردید (بهار و همکاران، 1361).
باکتری Pss علاوه بر بیماری شانکر باکتریایی درختان میوه هسته دار، عامل بیماری های مهمی همچون لکه قهوه ای لوبیا، بلاست مرکبات، لکه باکتریایی سورگوم و نوار قرمز نیشکر می باشد (Gross and Devay, 1977; Hirano, 1995; Rahimian, 1995). این باکتری بعنوان بیمارگر از گندم، ذرت، ارزن، سیب، گلابی، چغندر قند، کیوی و شمار دیگری از گیاهان زراعی و علف های هرز نیز جداسازی شده است(Balestra and Varvaro, 1997; Garden et al., 1991; Lindow, 1982).
در ایران باکتری مذکور تاکنون از گیاهان مختلفی مانند نیشکر (Rahimian, 1995)، درختان میوه هسته دار (بهار و همکاران، 1361؛ مزارعی و قاسمی، 1372) و گندم (افیونیان و صحراگرد، 1375) جداسازی شده است. این باکتری همچنین روی گیاه گوجه فرنگی نیز ایجاد بیماری می کند، اگرچه این بیماری به ندرت عملکرد را کاهش می دهد ولی باعث کاهش کیفیت می شود (Gleason and Edmunds, 2006).
جمعیت این باکتری با مراحل رشدی گیاه ارتباط دارد. به طوریکه در زمان متورم شدن جوانه ها و ظهور شکوفه ها که میزان تراوه های گیاه زیاد است، جمعیت این باکتری نیز بسیار بالاست. در این موقع میزان ترشحات و مواد قندی گیاه فراوان است و باکتری از آنها برای تغذیه خود استفاده نموده و جمعیت خود را افزایش می دهد.
به نظر می رسد سویه هایPss در میزبان های مختلف، دارای نوعی ویژگی تخصص میزبانی نیز هستند. به طور مثال سویه های Pss جدا شده از لوبیا باعث ایجاد واکنش بیماریزایی روی لوبیا می شوند در حالیکه سویه های این باکتری که از سایر میزبان ها جدا شده اند، تولید واکنش های غیر بیماریزایی در لوبیا می نمایند (Little et al., 1998).
نام این باکتری اغلب با سه اصطلاح اپی فیت، بیمارگر و هسته یخ همراه بوده است که نشان دهنده اهمیت حضور Pss روی گیاهان میزبان است (Hirano et al., 1995).
1-2- اهدافبه دلیل اهمیت این باکتری از نظر ویژگی های گستردگی دامنه میزبانی، اپی فیتی، ایجاد هسته یخ و بیماریزایی تحقیقات زیادی روی Pss صورت گرفته است. به طور مثال سیستم های بیماریزایی این باکتری مانند سیستم ترشحی پروتئینی نوع سه، زهرابه های دخیل در بیماریزایی آن مانند سیرینگومایسین و سیرینگوپپتین، ژن های مرتبط با بیماریزایی مانند syr B, syrD, hrp، افکتورهای پرآزاری و ناپرآزاری و … مورد بررسی قرار گرفته اند. با وجود این تحقیقات گسترده و همچنین روش های مدیریتی گوناگون برای کنترل بیماری های ایجاد شده توسط Pss، متاسفانه هنوز روش موثر و کارآمدی وجود ندارد. بنابراین تحقیقات بیشتر جهت دستیابی به روش های موثر و جدید برای کنترل بیماری های ایجاد شده توسط Pss مورد نیاز است. یکی از این زمینه های تحقیقاتی درک مکانیسم مقاومت گیاه به بیمارگر می باشد. از این رو هدف غایی این پژوهش بررسی همکنش بین آرابیدوپسیس- Pss و باز خوانی مسیرهای دفاعی گیاه آرابیدوپسیس به بیمارگر Pss می باشد. اهداف مد نظر این پژوهش در زیر آورده شده است:
بررسی تغییرات بیان چهار ژن PR1, PDF1.2, LOX2 و VSP2 مرتبط با مقاومت در گیاه آرابیدوپسیس آلوده به Pss
بررسی همکنش دو مسیر دفاعی وابسته به سالسیلیک اسید و جاسمونیک اسید در گیاهان آرابیدوپسیس آلوده به Pss
مقایسه پاسخ های دفاعی گیاهان آرابیدوپسیس آلوده به Pss در دو فاز مختلف رویشی و زایشی
بررسی میزان جمعیت باکتریPss در دو فاز رویشی و زایشی گیاه آرابیدوپسیس پس از مایه زنی
فصل دوم: پیشینه پژوهش2-1- خصوصیات کلی Pssاین باکتری میله ای شکل، دارای تاژک قطبی، گرم منفی، هوازی اجباری و همی بیوتروف می باشد. در حضور آرژنین این باکتری می تواند به صورت غیر هوازی نیز رشد کند (Martin-Sanz et al., 2012). در اغلب موارد پرگنه های این باکتری روی محیط کشت NA (Nutrient Agar) به رنگ کرم قابل مشاهده اند. سویه های این باکتری قادر به تجمع بتا هیدروکسی بوترات (PHB) به عنوان منبع کربن نمی باشند. میزان G+C در DNA این باکتری 61-59 درصد می باشد (Stead et al., 2003). اکثر سویه های این باکتری در محیط های دارای کمبود عنصر آهن و نیز روی محیط کشت King’s B تولید رنگدانه ای می کنند که در برابر نور UV (ماوراء بنفش) به صورت فلورسنت در می آید (Warren and Wolber, 1991). بسیاری از سویه ها نیز در دمای 5 درجه سانتیگراد زیر صفر تا دمای 5 درجه سانتیگراد بالای صفر تشکیل هسته یخ می دهند.
از مهمترین گیاهان میزبان این باکتری می توان به درختان میوه هسته دار، درختان میوه دانه دار، گندم، مرکبات و ذرت اشاره کرد. از مهمترین بیماری های ایجاد شده توسطPss نیز می توان به شانکر باکتریایی درختان میوه هسته دار، بلاست درختان میوه دار و سوختگی برگ گیاهان علفی اشاره نمود (Ashoorpour et al., 2008; Hirano et al., 2000; Rahimian, 1995).
2-1-1- موقعیت تاکسونومیکیجنس Pseudomonas در قلمرو Bacteria، زیر رده گاما از رده‌ی Proteobacteria، خانواده Pseudomonadaceae قرار گرفته است (Boon et al., 2001). گونه P. syringae مهمترین گونه جنس سودوموناس می باشد. این گونه دارای بیش از 60 پاتووار مختلف می باشد که در گیاهان مختلف ایجاد بیماری می کند (Kennlly et al., 2007). اولین بار در سال 1902 این باکتری توسط Van Hall از گیاه یاس خوشه‌ای جداسازی شد (Gross and De Vay, 1977). انجام آزمون های بیماریزایی، خصوصیات فنوتیپی، دامنه میزبانی، توانایی تشکیل هسته یخ و تولید زهرابه برای متمایز کردن پاتووارهای مختلف گونه P. syringae لازم می باشد (Hinrichs-Berger, 2004).
2-1-2- تولید فایتوتوکسین توسط Pss
بسیاری از سویه های Pss در گیاه تولید لیپودپسی پپتیدهای حلقوی به عنوان متابولیت های ثانویه می کنند. این متابولیت ها شامل زهرابه های با وزن مولکولی پایین مانند سیرینگومایسین و زهرابه های با وزن مولکولی بالا مانند سیرینگوپپتین می باشند. این زهرابه ها به طور قابل ملاحظه ای در بیماریزایی باکتری Pss نقش دارند (Fiel et al., 2005). اکثر سویه های این باکتری تولید سیرینگومایسین می کنند. این زهرابه باعث ایجاد منافذی در غشای پلاسمایی سلول های گیاهی می شود. اثر این زهرابه روی عمل تراوایی غشا می باشد که در نهایت باعث نشت بسیار زیاد یون های کلسیم که در سیگنال دهی سلول ها نقش دارند می شود (Mo and Gross,1991). بنابراین این زهرابه در بیماریزایی نقش مهمی دارد و همچنین مشخص شده است که این زهرابه ها به کلونیزاسیون باکتری در میزبان و رشد باکتری در فضای بین سلولی کمک می کنند (Giorgio et al., 1996). این زهرابه ها بوسیله سیگنال های گیاهی فعال می شود. سیگنال های اولیه شامل گلیکوزیدهای فنولی ویژه‌ای هستند که در برگ ها، شاخه ها و گل های بسیاری از میزبان های باکتری یافت می شوند (Fiel et al., 2005).
2-1-3- دامنه میزبانیدامنه میزبانی یک سویه خاص بیمارگر ممکن است بر اساس تعاملات مختلف اختصاصی به یک پاتوار و یا یک نژاد در میان گونه های گیاهی مختلف محدود شده باشد که در این میان، افکتورهای بیماریزایی باکتری و محصولات ژن های مقاومت در گیاه میزبان نقش اساسی در تعیین دامنه میزبانی دارند.
گونه P. syringae شامل سویه هایی است که در مجموع صدها گونه گیاهی را آلوده کرده و سبب ایجاد بیماری هایی با علائم مختلف از لکه برگی ها تا شانکرهای ساقه می شوند. سویه های مختلف P. syringae که شناخته شده اند متنوع بوده و تعامل اختصاصی با رقم ها و گونه های گیاهان مختلف دارند. یک سویه خاص از P. syringae ممکن است برای یکی از حدود 50 پاتوار بر اساس دامنه میزبانی در سطح گونه گیاهی اختصاصی شده باشد و سپس بیشتر با یک نژاد بر اساس همکنش های مختلف با رقم های یک گونه گیاهی اختصاصی شده باشد.
2-1-4- بیماریزایی P. syringaeباکتری P. syringae در فضای آپوپلاستیک بین سلولی تکثیر شده و خارج از سلول باقی می ماند. همزمان سلول های گیاه حضور میکروب را درک نموده و پاسخ های دفاعی را برای محدود کردن رشد باکتری فعال می کنند. برای غلبه بر چنین پاسخ ایمنی، بیمارگرهای باکتریایی سازگار یافته دارای سیستم های بیماریزایی مخصوصی اند که با غلبه بر پاسخ های دفاعی گیاه به بیماریزایی کمک می کنند (Gimenez-Ibanez and Rathjen., 2010).
دو سیستم بیماریزایی که نقش کلیدی در ایجاد بیماری توسط P. syringae دارند عبارتند از: سیستم ترشح پروتئینی نوع سه (TTSS)) (Type III secretion sys– که منبعی از پروتئین های بیماریزا و غیربیماریزای باکتریایی را به آپوپلاست و همچنین داخل سلول های میزبان آزاد می کند ( افکتورهای نوع 3) (Alfano and Collmer, 1997; Lindgren, 1997; He, 1998; Preston, 2000) و زهرابه ها، مانند زهرابه کروناتین که تا حدودی شبیه هورمون گیاهی متیل جاسمونات (MeJA) می باشد (Bender et al., 1999; Preston, 2000). بعضی از این مولکول ها مانع پاسخ های ایمنی گیاه به سودوموناس بوسیله تنظیم سیگنالینگ JA/ET، که متعاقبا سرکوب سیگنالینگ SA را به دنبال دارد و در نتیجه افزایش حساسیت به سودوموناس می شود (Ferguson and Mitchell, 1985; Melotto et al., 2008). هر دو این سیستم های بیماریزایی در معرض بافت های گیاهی تحریک می شوند، احتمالا به دلیل اینکه آنها قبل از مواجهه باکتری با سلول های گیاه مورد نیاز نیستند.
زمانیکه P. syringae پروتئین های عملگر نوع سه، که شامل پروتئین های Avr می باشد را از طریق سیستم ترشح پروتئین نوع سه به داخل سلول های گیاه تزریق می کند، بسته به ژنوتیپ P. syringae آلوده کننده و گیاه دو پیامد در پی خواهد داشت. این پیامدها خیلی ظریفانه بوسیله فرضیه ژن برای ژن توضیح داده می شوند. به طور مثال اگر گیاه آلوده شده دارای ژن مقاومت R باشد که عملگرهای نوع سه P. syringae (مثلا پروتئین Avr) را تشخیص دهد، سبب ایجاد یک مکانیسم دفاعی سریع در گیاه می شود. متناوبا اگر گیاه آلوده شده ژن R متناظر را نداشته باشد و یا سویه P. syringae ژن avr نداشته باشد، پاسخ های دفاعی به آهستگی فعال شده، آلودگی ادامه خواهد یافت و گیاه در برابر P. syringae تسلیم شده و بیمار می شود. به دلیل ضعف در تعریف دقیق مفهوم ژن برای ژن در مورد شناسایی افکتورهای باکتریایی توسط گیرنده های پروتئینی مقاومت در گیاه میزبان، اخیرا فرضیه گارد مطرح شده است که محبوبیت بیشتری در مورد نحوه شناسایی افکتورهای باکتریایی دارد.
2-2- آرابیدوپسیسآرابیدوپسیس یک جنس از گیاهان خانواده شب بوئیان (Brassicasceae) می باشد که در سال های اخیر توجهات بسیاری را به خود جلب کرده است (Beets et al., 2012). این گیاه عموما به عنوان مدل در تحقیقات تعامل گیاه و بیمارگر استفاده می‏شود. وجود مجموعه‌ای از موتانت ها و آسانی آنالیز مولکولی و ژنتیکی این گیاه، آن را برای بررسی مکانیسم ایجاد مقاومت مناسب می سازد ((Park et al., 2009. اطلاعات زیادی در مورد پاسخ دفاعی گیاه با انجام تحقیقات روی گیاه مدل Arabidopsis thaliana ممکن شده است. در دسترس بودن تمام توالی ژنوم، همسانه سازی ژن ها را مبتنی بر نقشه آسان تر و اطلاعات را برای محصولات ریز آرایه ها فراهم کرده است. اخیرا به طور گسترده از آرابیدوپسیس برای بررسی همزمان بیان ژن ها طی حمله بیمارگر و تیمارهای غیر زنده استفاده شده است(Maleck et al., 2000; Chen et al., 2002; Mahalingham et al., 2003; Tao et al., 2003; Glawischnig et al., 2004).
2-3- واکنش Real-time RT-PCR
واکنش Real-time RT-PCR از روش های کارآمد برای تکثیر قطعات DNA است. در این روش با استفاده از آغازگرهای الیگونوکلئوتیدی ترادف خاصی از DNA تکثیر شده و کاربردهای وسیعی در تشخیص بالینی و

این نوشته در پایان نامه ها ارسال شده است. افزودن پیوند یکتا به علاقه‌مندی‌ها.

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *