پایان نامه ها

al.,، بیمارگر، سیستمیک، پروتئین، SAR، اکتسابی

تحقیقات زیست مولکولی دارد (Jan et al., 2006). علاوه بر این با استفاده از Real-time RT-PCR می توان مقدار دقیق بیان یک ژن را در نمونه های مورد مطالعه اندازه گیری نمود. در این تکنیک نیز اصول کلی PCR حاکم است ولی نکته حائز اهمیت این است که پس از تکثیر DNA در هر سیکل غلظت دقیق آن اندازه گیری می شود.
در بررسي سطح بيان ژن به وسيله PCR، مقدار و حجم محصول PCR به مقدار اوليه الگو بكار رفته در آزمون واكنش زنجيره اي پليمراز وابسته است (Pfaffl, 2004). روش Real-time RT-PCR يك روش بسيار دقيق جهت تعيين مقدار الگوي اوليه است. حتي نتايج Real-time RT-PCR بسيار دقيق تر از روش سادرن بلات است (Jan et al., 2006). در اين روش مقدار الگوي اوليه به وسيله میزان محصول توليدي در هر سيكل تعيين مي شود (Pfaffl, 2004). به طور معمول از كاوشگرهاي فلورسنس جهت تعيين مقدار افزايش محصول PCR در هر سيكل، استفاده مي شود (Jan et al., 2006). سيستم Real-time RT-PCR بر اساس بررسي كمي ميزان ماده فلورسنس عمل مي كند. اين پيام فلورسنس به نسبت ميزان محصول PCR در واكنش افزايش مي يابد. با ثبت ميزان تابش در هر سيكل مي توان واكنش را در طول فاز نمايي ثبت كرد و آن را با مقدار نمونه الگوي اوليه مطابقت داد. هر چقدر مقدار كپي هاي اوليه نوكلئيك اسيد بيشتر باشد افزايش ميزان فلورسنس و ورود به فاز نمايي زودتر اتفاق مي افتد (Pfaffl, 2004).
2-3-1- بیان ژن (Gen Expression)بیان ژن مرحله ای است که طی آن اطلاعات ژنتیکی DNA به یک محصول عملکردی تبدیل می شود. این محصول در بیشتر مواقع به صورت پروتئین بوده ولی در مورد ژن هایی که محصول پروتئینی ندارند مانند ژن های کد کننده rRNA و یا tRNA این محصول به صورت RNA می باشد. بیان ژن به صورت کلی شامل مراحل مختلف رونویسی، RNA Splicing، ترجمه و تغییرات پس از ترجمه است. با وجود این اغلب موارد منظور از Gen Expression بیان ژن در سطح RNA است. بررسی بیان ژن در سطوح مختلفی با توجه به هدف محقق می تواند انجام شود که شامل آنالیز DNA, mRNA و پروتئین است.
اولین مرحله در بیان ژن انتقال اطلاعات ژنتیکی از DNA به رونوشت RNA است. هدف از بررسی بیان ژن در این سطح بررسی وجود رونوشت مربوط به ژن در نمونه و تعیین مقدار این رونوشت است. مطالعه بیان ژن در سطح RNA می تواند به صورت مستقیم بر RNA و یا به صورت غیر مستقیم از طریق تبدیل RNA به cDNA و تکثیر آن با استفاده از PCR انجام شود.
2-4- دفاع در گیاهانباکتری Pseudomonas syringae در فضای آپوپلاستیک بین سلولی تکثیر شده و خارج از سلول باقی می ماند. همزمان سلول های گیاه حضور میکروب را درک نموده و پاسخ های دفاعی را برای محدود کردن رشد باکتری را فعال می کنند. برای غلبه بر چنین پاسخ ایمنی، باکتری های بیمارگر سازگار یافته، افکتورهای مولکولی بیماریزایی را از طریق دستگاه مخصوص ترشحی نوع سه به داخل سلول گیاه ترشح می کند که با غلبه بر پاسخ های دفاعی گیاه به بیماریزایی کمک می کند. با این وجود افکتورها نیز توسط گیرنده های درون سلولی میزبان تشخیص داده شده و پاسخ ایمنی را فعال می کنند .(Gimenez-Ibanez and Rathjen, 2010)
گیاهان دارای هر دو نوع دفاع فعال و غیر فعال علیه تهاجم بیمارگرها می باشند. موانع از پیش ساخته فیزیکی و شیمیایی مانند کوتیکول برگ، موانع ایجاد شده توسط دیواره های سلولی گیاه، و وجود چندین ترکیب ضد میکروبی آپوپلاستیکی، موانع اولیه برای آلودگی است. ورود بیمارگر به بافت میزبان اولین مرحله حیاتی برای آلودگی است، زیرا مواد روی سطوح برگ بسیار محدود هستند. باکتری سودوموناس دارای تاژک و قدرت حرکت می باشد ولی به این معنی نیست که می تواند به طور مستقیم به اپیدرم برگ نفوذ کند، این باکتری توسط منافذ سطحی طبیعی مانند استوماتا و یا زخم ها وارد می شود. به این دلیل که بیمارگرها می توانند دفاع غیرفعال را بشکافند، گیاهان به ایمنی فعال برای محدود کردن تکثیر بیمارگر متکی هستند (Gimenez- Ibanez and Rathjen, 2010).
گياهان به طور طبيعى در مقابله با بيمارگرهاى مختلف از جمله باکتری ها با بكارگيرى مكانيسم هاى مقاومت، همانند پاسخ فوق حساسيت پاسخ هاى دفاعى از خود نشان مي دهند. مقاومت مستلزم تشخيص باکتری توسط گياه و سيگنال دهى بعد از تشخيص باکتری می باشد. در اين زمينه مى توان به پروتئين هاى مقاومت R در گیاه اشاره نمود که محصول ژن Avr بیمارگرها را به طور مستقيم يا غير مستقيم تشخيص مى دهند. پس از تشخيص بیمارگر توسط ميزبان، عملكرد كمپلكس پروتئين R بايد از حالت تشخيص به انتقال سيگنال تغيير يابد. سپس مسيرهاى سيگنال دهى در گياه بكار مى افتند كه مولكول ها و تركيبات متنوعى در اين مسيرهاى سيگنال دهى ايفاى نقش مى كنند كه از جمله آن ها مى توان به انواع اكسيژن آزاد، نيتريك اكسيد، ساليسيليك اسيد، جاسمونيك اسيد، اتيلن، پلى آمين ها و آبشارهاى MAP كيناز اشاره كرد. به نظر مى رسد كه گياهان با توسعه ارتباط بين اين مسيرها، در صدد محدود نمودن آلودگى ها می باشند.
2-4-1- مقاومت ساختاری و القاییگیاهان با مکانیسم های دفاع ساختاری و القایی به حمله بیمارگرها پاسخ می دهند که شامل مقاومت ذاتی یا مقاومت اختصاصی است (Jones and Dangl, 2006). در مقاومت ذاتی گیاهان حضور بیمارگر را از طریق مکانیسم هایی مانند ایمنی مربوط به الگوهای مولکولی وابسته به بیمارگر تشخیص می دهند. الگوهای مولکولی وابسته به بیمارگر (PAMPs) شامل پلی ساکاریدها و فلاژلین باکتری ها می باشند (Jones and Dangl, 2006; Zipfel, 2009). بیمارگرها برای فرار از مقاومت ذاتی یکسری افکتورهای پروتئینی Avr-proteins تولید می کنند و گیاهان مقاوم، علیه این افکتورها مجهز به سیستم های دفاعی اختصاصی اند. ژن های مقاومت در گیاه مقاوم گیرنده های افکتور یا R-proteins را تولید می کنند. شناسایی Avr proteins توسط R-proteins سبب ایجاد مقاومت اختصاصی می شود. این نوع مقاومت به ایمنی وابسته به افکتور یا ژن برای ژن معروف است. هورمون های SA, JA و اتیلن به عنوان سیگنال های ثانویه در شبکه انتقال سیگنال ایمنی مربوط به الگوهای مولکولی وابسته به بیمارگر نقش بازی می کنند(Jones and Dangl, 2006; Van loon et al., 2006; Zipfel, 2009) که بعد از حمله بیمارگر میزان این هورمون ها در گیاه تغییر می کند.
2-4-1-1- مقاومت القایی
گیاهان در طول زمان زندگی تحت تاثیر تعداد بیشماری حشرات گیاهخوار و بیمارگرهای میکروبی با روش گوناگون حمله قرار دارند. گیاهان برای بقا مجبورند حمله را بوسیله این ارگانیسم های مضر درک کنند و با فعال کردن پاسخ های دفاعی مناسب پاسخ دهند. پاسخ های ایمنی اولیه برای تشخیص خصوصیات رایج و عمومی ارگانیسم هایی که با گیاه همکنش می کنند و تفسیر این تشخیص به یک پاسخ دفاعی که به طور اختصاصی هدایت شده علیه حملات مهاجم تکامل یافته اند (Jones and Dangl, 2006). علاوه بر این برای این پاسخ دفاعی اولیه اختصاصی مهاجم گیاهان می توانند خط دیگری از دفاع که اشاره شده است بعنوان مقاومت القایی را فعال کنند. این نوع مقاومت اغلب به طور سیستمیک در تمام گیاه عمل می کند و علیه طیف وسیعی از مهاجم ها موثر است (Walters et al., 2007). گیاهان قادرند انواع گوناگونی از مقاومت های القا شده بسته به ارگانیسمی که با گیاه همکنش می کند را فعال کنند. از نمونه های مقاومت القایی خوب مطالعه شده، مقاومت سیستمیک اکتسابی (SAR) است که به بیمارگرهای ایجاد کننده آلودگی محدود مانند نکروز فوق حساسیت وابسته است (Durrant and Dong, 2004). همچنین مقاومت سیستمیک القایی (ISR) که به محض کلنیزه شدن ریشه های گیاهان توسط سویه های غیر بیماریزای رایزوباکتری ها(Van Loon et al., 1998) و نیز زخم که به محض خسارت به بافت مانند تغذیه حشرات ایجاد می شود، فعال می شود (Kessler and Baldwin, 2002; Howe, 2004).
2-4-2- مقاومت سیستمیک اکتسابی Sys–ic Aquired Resistance (SAR)مقاومت سیستمیک اکتسابی به طور گسترده توسط راس مشخص شده است، به این صورت که لکه های ایجاد شده توسط آلودگی ثانویه توتون با ویروس موزائیک توتون TMV به طور قابل توجهی کوچکتر از آنهایی بود که توسط آلودگی اولیه ایجاد شده اند. مقاومت سیستمیک اکتسابی (SAR) از آن زمان به بعد در طیف وسیعی از گونه های گیاهان در پاسخ به آلودگی با بیمارگرهای باکتریایی، قارچی و … نشان داده شده است. در حالیکه مقاومت سیستمیک اکتسابی معمولا با یک پاسخ مقاومت فعال در ارتباط است، همچنین معلوم شده است که همکنش های گیاه- بیمارگر (که گیاه به بیمارگر حساس است) می تواند منجر به SAR شود. به این ترتیب در حال حاضر معلوم نیست کدام نوع از همکنش گیاه -بیمارگر برای القائ مقاومت سیستمیک اکتسابی لازم هستند.
یکی از بیشترین مطالعات انجام شده در خصوص پاسخ های دفاع القایی در گیاهان، در زمینه مقاومت سیستمیک اکتسابی است. این نوع از مقاومت مرتبط با آلودگی موضعی بیمارگر است که منجر به نکروز یا واکنش فوق حساسیت می شود و علیه طیف وسیعی از بیمارگرهای گیاهی ایجاد می شود (Ryals et al., 1996). سالیسیلیک اسید (SA) هورمونی کلیدی در ایجاد SAR می باشد که آغاز آن با افزایش موضعی و سیستمیک SA در داخل گیاه (Malamy et al., 1990; Métraux et al., 1990) و افزایش بیان تعداد زیادی از ژن ها(Ward et al., 1991) از جمله ژن هایی که پروتئین های مرتبط با بیماریزایی (PR proteins) را کد می کنند (Van Loon and Van Strien, 1999) همراه است. چندین پروتئین PR فعالیت ضد میکروبی دارند و به دستیابی به مقاومت کمک می کنند.
تجمع سالیسیلیک اسید یکی از اجزای اصلی مقاومت گیاهان به بیماری و انتقال سیگنال وابسته به آن می باشد. این تجمع برای بیان کامل مقاومت به بعضی اما نه تمام بیمارگرهای گیاهی لازم است Delaney et al., 1994; Van der Biezen et al., 2002)) و منجر به تغییراتی در عملکرد میتوکندری و بیان ژن ها می شود Maleck et al., 2000)). تجمع سالیسیلیک اسید همچنین می تواند در پاسخ های ایمنی مانند مقاومت سیستمیک اکتسابی و مقاومت وابسته به سن و بیان ژن های مرتبط کمک کند (Gaffney et al., 1993; Kus et al., 2002).
2-4-2-1- مراحل ایجاد مقاومت سیستمیک اکتسابی (SAR)
مقاومت سیستمیک اکتسابی یک پاسخ دفاعی القایی است که منجر به مقاومت سیستمیک وسیع الطیف بعد از مصونیت آلودگی اولیه می شود SAR .(Kuc, 1982; Chester, 1933) بعنوان یک مکانیسم دفاعی پیشرفته در گیاه میزبان برای واکنش سریع پاسخ های دفاعی بعد از آلودگی ثانویه توصیف شده است(Sequeira, 1983; Hammerschmidt, 1993; Kuc, 1983). شواهدی از توتون، کدوییان و اخیرا از آرابیدوپسیس نشان می دهد که سه مرحله در پاسخ SAR وجود دارد. اولین مرحله مصونیت یا ایمنی است، که در آن یک بیمارگر نکروزکننده پس از آلوده کردن برگ منجر می شود به: 1- تشکیل زخم های نکروتیک موضعی و مقاومت موضعی HR 2- ایجاد علائم نکروتیک (Kuc, 1982). لکه های نکروتیک سبب بیان مجموعه ای از پروتئین های وابسته به بیمارگر PR در توتون، خیار و آرابیدوپسیس می شوند (Kuc, 1982; Ward et al., 1991; Uknes et al., 1992; Uknes et al., 1993). تجمع سالیسیلیک اسید تا چندین برابر سطح پایه افزایش می یابد(Malamy et al., 1990; Metraux et al., 1990; Yalpani et al., 1991; Uknes et al., 1992; Delaney et al., 1995; Lawton et al., 1995) یک سیگنال متحرک نیز در آبکش ها تولید شده و برای تثبیت SAR از برگ مصون شده به بقیه قسمت های گیاه حرکت می کند (Jennes and Kuc, 1979; Guedes et al., 1980; Tuzun and Kuc, 1985).
مرحله تثبیت SAR مستلزم درک سیگنال متحرک در برگ های مایه زنی نشده می باشد و منجر به بروز میزان پایینی از HR می شود، که باعث القائ بیان همان مجموعه ژن های PR در اطراف مکان اولیه آلودگی القا می شود، همچنین تجمع SA تا 2 برابر در آرابدوپسیس (Yalpani et al., 1991; Delaney et al., 1995; Lawton et al., 1995) و در توتون تا 10 برابر افزایش می یابد.
فاز آخر مرحله SAR است، هنگامی که گیاه با بیمارگر دوم مایه زنی می شود، بیمارگر معمولی همان پاسخی را در گیاه ایجاد می کند که یک بیمارگر پرآزار ایجاد می کند(Kuc, 1982).
2-4-2-2- پروتئین‌‌‌‌های مرتبط با بیماریزایی (PRs) Pathogenesis related proteins
تلاش برای درک اساس بیوشیمیایی مقاومت از جمله SAR، منجر به شناسایی انواعی از پروتئین ها شده است و معمولا به پروتئین های مربوط به بیماریزایی (PR) ارجاع داده شده اند که بعد از حمله بیمارگر تولید می شوند. در توتون، تولید هماهنگ 5 خانواده یا بیشتر از پروتئین های PR با توسعه واکنش فوق حساسیت (HR) بعد از آلودگی با TMV در ارتباط است. یک زیر مجموعه ای از ژن ها، پروتئین های PR را پشتیبانی می کنند که به عنوان ژن های ایجاد کننده SAR تعیین شده اند. همچنین هنگام توسعه SAR در برگ های غیر آلوده القایشان افزایش می یابد. از زمانیکه پروتئین های PR شناسایی شدند، ژن هایشان از تعداد زیادی گونه های گیاهی جداسازی شده اند. به طور کلی این ژن ها در فرایند مقاومت سیستمیک و موضعی علیه بیمارگرهای قارچی، باکتریایی و ویروسی القا می شوند.
شواهد اخیر نشان داده است که پروتئین های PR نه تنها نشانگر مناسبی برای SAR هستند بلکه عوامل ضد میکروبی موثری نیز می باشند. بعضی پروتئین های PR-3 نقش آنزیم های لیزوزومی دارند و همچنین کیتینازها، عملکرد ضد باکتریایی را نشان می دهند. بعلاوه، PRs 2,3,4 و 5 در شرایط آزمایشگاهی فعالیت های ضد قارچی ابراز می کنند. همچنین بیان PRs 1,2,3 و5 مقاومت را در گیاهان تراریخت نسبت به چندین بیمارگر قارچی افزایش می دهند. بنابراین، تولید پروتئین های PR ممکن است به طور مستقیم به توسعه SAR و ابقا آن و همچنین کاهش رشد و گسترش بیمارگر طی آلودگی اولیه کمک کنند. با این حال، از آنجایی که بیان پروتئین های

متن کامل پایان نامه ها در 40y.ir

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *