هورمون، میکرولیتر، واکنشهای، AluI، گیرندهی، al.,

و تولیدمثلی
فلکی و همکاران (Falaki et al., 1996) با بررسی چندریختی TaqI در اگزونهای 9 و 10 در گاوهای هلشتاین، نشان دادند که این چندریختی با تولید چربی همراهی دارد. اگری و همکاران (Aggrey et al., 1999) با بررسی چندریختیهای AccI، StuI و AluI در بخش 5′ UTR در گاوهای هلشتاین گزارش کردند که چندریختی AluI با ارزش اصلاحی چربی شیر همراهی معنیدار دارد. مج و همکاران (Maj et al., 2004) گزارش کردند که چندریختیهای NsiI و AccIدر بخش غیر رمزکنندهی گیرندهی هورمون رشد با صفات تولید شیر و ترکیبات شیر همراهی معنیدار دارد. کومیسرک و همکاران (Komisarek et al., 2011) گزارش کردند که همراهی چندریختی VspI در اگزون 8 با درصد چربی، شیر و پروتئین شیر معنی دار است.چند ریختی AluI با جایگزینی باز گوانین با آدنین ایجاد میشود و درپی آن در گیرندهی هورمون رشد، اسید آمینهی سرین جایگزین گلایسین میشود. این تغییر دو آلل A و G ایجاد میکند. دایاس تاسیو و همکاران (Di Stasio et al., 2005) گزراش کردند که چند ریختی AluI در اگزون 10 با صفت افت وزن در گوشت گوسالههای نژاد پایمانتیز رابطه معنی دار دارد. اولنسکی و همکاران (Oleński et al., 2010) گزارش کردند که چندریختی AluI در اگزون 10 با صفات تولید شیر و ترکیبات آن در گاوهای شیری و ارزش اصلاحی گاوهای نر همراهی معنی دار دارد. آلل A برچربی و پروتئین و آلل G بر مقدار تولید شیر موثر بود. کواکس و همکاران (Kovacs et al., 2006) گزارش کردند که چندریختی AluI در اگزون 10 با تولید شیر و فاصلهی زایش در گاوهای هلشتاین همراهی معنی دار ندارد. هاردکا و همکاران (H–ecká et al., 2008) با بررسی چند شکلی AluI در اگزون 10 گزارش کردند که فراوانی آلل A در نژاد هلشتاین1/95 درصد است. بین این چندریختی و ارزش اصلاحی چربی شیر همراهی معنیدار وجود دارد و گاوهای دارای ژنوتیپ GG ارزش اصلاحی کمتری برای چربی شیر نسبت به گاوهایی با ژنوتیپ AA بودند.
فصل سوم

مواد و روشها3-1- محل اجرای پژوهشاین پژوهش با همکاری دو واحد پرورش گاو شیری هلشتاین در استان فارس انجام شد. در این پژوهش، از 130 گاو شیری که دستکم برای یک دورهی شیردهی رکورد تولیدی و تولید مثلی داشتند، با استفاده از ونوجکتهای دارایEDTA خونگیری شد. نمونهها درون یخ قرار داده شدند و در آزمایشگاه مرکزی دانشکده دامپزشکی دانشگاه شیراز، در دمای منفی 20 درجهی سانتیگراد نگهداری شدند. همهی فرآیندهای آزمایشگاهی در آزمایشگاه مرکزی دانشکدهی دامپزشکی انجام شد.
3-2- استخراج DNA
استخراج DNA ژنومیک با استفاده از کیت استخراج DNA شرکت ژن فناوران در چند گامه انجام شد:
1-100 میکرولیتر از نمونهی خون در داخل میکروتیوبهای 5/1 میلیلیتری ریخته شد.
2-400 میکرولیتر مادهی Lysis Reagent به هر نمونه افزوده شد، نمونهها به هم زده شدند تا در ته میکروتیوبها رسوب دیده شود.
3- نمونهها به مدت 5 دقیقه در داخل انکوباتور با حرارت 65 درجه سانتیگراد قرار داده شد.
4- نمونهها از انکوباتور خارج شدند، و 20 میکرولیتر ماده جذب کنندهی Nuclease به هرنمونه افزوده شد، و به مدت 10 دقیقه بههم زده شدند.
5- به مدت 10 ثانیه و در سرعت g 5000 نمونهها سانتریفیوژ شدند، و سپس مایع بالایی آنها دور ریخته شد.
6-200 میکرولیتر ماده Lysis Reagent به رسوب سفید رنگ ته میکروتیوبها افزوده شد، و با ورتکس محیط یکسانی حاصل شدند.
7- به محیط همگن شده، 400 میکرولیتر Saline Buffer افزوده شد و نمونهها چند بار بالا و پایین شدند.
8- نمونهها به مدت 10 ثانیه در سرعت g 5000 سانتریفیوژ شدند، و سپس مایع بالایی آنها دور ریخته شدند.
9- 500 میکرولیتر Saline Buffer به رسوب سفید رنگ ته میکروتیوبها افزوده شد، و با ورتکس محیط یکسانی حاصل شد.
10- نمونهها به مدت 10 ثانیه در سرعتg 5000 سانتریفیوژ شدند.
11- میکروتیوبها به مدت 10 دقیقه به صورت دربباز در انکوباتور با درجهی حرارت 65 درجه قرار داده شدند.
12- بعد از خارج کردن نمونهها از انکوباتور در صورتی که بوی الکل نداشت، 80 میکرولیتر Extra Gene E به هر نمونه اضافه شد و با ورتکس مخلوطی همگن حاصل شد.
13 – نمونهها، به مدت 10 دقیقه، در انکوباتور با دمای 65 درجه سانتیگراد قرار گرفتند.
14- بعد از خارج کردن نمونهها از انکوباتور، با ورتکس محیط همگن شدند.
15- نمونهها به مدت 2 دقیقه با سرعت g 10000 سانتریفیوژ شدند.
16- بخش بالایی میکروتیوبها که دارای DNA بود، به میکروتیوبهای جدید منتقل شد و در دمای منفی 20 درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
3-3- بررسی کمیت و کیفیت استخراج
پس از استخراج DNA، کمیت و کیفیت DNAی استخراج شده، با استفاده از دستگاه نانودراپ (Nanodrop) مدل T100 و الکتروفورز روی ژل آگارز یک درصد بررسی شد.
3-3-1 الکتروفورز DNAی استخراج شده روی ژل آگارز یک درصد
مقدار 1 گرم آگارز در 100 میلیلیتر بافر 1X TAE حل و چند دقیقه جوشانده شد. بعد از اضافه کردن اتیدیوم برماید به محلول (رنگ محلول صورتی پوست پیازی شود)، درون سینی ژل که دو طرف آن بسته شده و شانه مخصوص روی آن گذاشته شده بود، ریخته شد.
بعد از سرد شدن ژل، دو طرف سینی را باز کرده و شانه به آرامی خارج شد. ژل به همراه سینی در تانک دارای بافر 1X TAE قرار داده شد. ارتفاع بافر باید به حدی باشد که سطح ژل را تا چند میلیلیتر بپوشاند.
مقدار 4 میکرولیتر از DNA استخراج شده، با یک میکرولیتر بافر بارگذاری آمیخته و به چاهک ژل انتقال داده شد.
ولتاژ دستگاه در 80 ولت تنظیم و برای 90 دقیقه فرآیند الکتروفورز انجام شد.
پس از پایان الکتروفورز، ژل روی صفحهی U.V. Transilluminator بررسی و از آن عکسبرداری شد.
3-3-2- تهیه بافر 50x TAE
مقدار 2/242 گرم تریس باز، 57 میلیلیتر اسید استیک 99 درصد و 100 میلیلیتر EDTA نیم مولار با pH 5/7 تا 8، با هم مخلوط شدند.
حجم محلول با استفاده از آب مقطر به یک لیتر رسید.
3-3-3-تهیه بافرTAE 1X
برای استفاده از بافر، باید غلظت آن از50x به 1x کاهش یابد. بدین منظور، 20 میلیلیتر از بافر 50x با 980 میلیلیتر آب مقطر مخلوط شد و یک لیتر بافر 1x بدست آمد.
3-4- واکنشهای زنجیرهای پلیمراز(PCR)
3-4-1- ژن هورمون رشد
برای ازدیاد قطعهی 428 جفت بازی از اگزون 5 ژن هورمون رشد از آغازگرهای ارایه شده در جدول 3-1 استفاده شد. در واکنشهای PCR از میکروتیوبهای 25 میکرولیتری استفاده شد. مواد مورد استفاده در واکنشهای PCR در جدول 3-2 ارایه شده است و از دستگاه ترموسایکلر Eppendorf AG Master cycler G–iant مدل 23331 استفاده شد. چرخههای گرمایی مورد استفاده در PCR در جدول 3-3 نشان داده شده است.
جدول 3-1 – آغازگرهای استفاده شده در ازدیاد ژن هورمون رشد ( Lucy et al., 1993)
نام ژن اندازه قطعه آغازگر
هورمون رشد bp 428 F.5′-CCG TGT CTA TGA GAA GC-3′
R.5′-GTT CTT GAG CAG CGC GT-3′
جدول 3-2- مواد استفاده شده در هر واکنش PCR در ازدیاد ژن هورمون رشد
ماده میزان مصرف
آب دیونیزه شده 15/15 میکرولیتر
بافر PCR 10X 5/2 میکرولیتر
dNTP 200 میکرومولار
MgCl2 2/1 میلی مولار
هرآغازگر 400 نانو مولار
آنزیم Taq یک واحد
DNA 60 نانو گرم ( 2 میکرولیتر)
جدول 3-3- چرخهی گرمایی استفاده شده در ازدیاد ژن هورمون رشد
گامه ی واکنش دما(سانتیگراد) زمان شمار چرخه
واسرشته سازی اولیه 94 10 دقیقه 1
واسرشته سازی 94 30 ثانیه 30

همجوشی آغازگر و DNA 56 60 ثانیه بسط 72 35 ثانیه بسط نهایی 72 10 دقیقه 1
3-4-2- ژن گیرندهی هورمون رشد
برای ازدیاد قطعهی 342 جفت بازی از ژن گیرندهی هورمون رشد از آغازگرهای ارایه شده در جدول 3-4 استفاده شد. در واکنشهای PCR، از میکروتیوبهای 25 میکرولیتری استفاده شد. مواد مورد استفاده در واکنشهای PCR در جدول 3-5 ارایه شده است و از دستگاه ترموسایکلر Eppendorf AG Master cycler G–iant مدل 23331 استفاده شد. چرخههای گرمایی مورد استفاده در واکنشهای PCR در جدول 3-6 نشان داده شده است.
جدول 3-4 – آغازگرهای استفاده شده در ازدیاد ژن گیرندهی هورمون رشد (Di Stasio et al., 2005)
نام ژن اندازهی قطعه آغازگر
گیرندهی
هورمون رشد bp 342 F.5′-GCT AAC TTC ATC GTG GAC AAC-3′
R.5′-CTA TGG CAT GAT TTT GTT CAG-3′
جدول 3-5- مواد استفاده شده درهر واکنش PCR در ازدیاد ژن گیرندهی هورمون رشد
ماده میزان مصرف
آب دیونیزه شده 8/15 میکرولیتر
بافر PCR 10X 5/2 میکرولیتر
dNTP 200 میکرومولار
MgCl2 2 میلی مولار
هرآغازگر 400 نانو مولار
آنزیم Taq یک واحد
DNA 60 نانو گرم (2 میکرولیتر)
جدول 3-6- چرخهی گرمایی استفاده شده در ازدیاد ژن گیرندهی هورمون رشد
گامهی واکنش دما (سانتیگراد) زمان(ثانیه) شمار چرخه
واسرشته سازی اولیه 94 5 دقیقه 1
واسرشته سازی 94 45 ثانیه 35

همجوشی آغازگر با DNA 50 30 ثانیه بسط 72 50 ثانیه بسط نهایی 72 5 دقیقه 1
برای بررسی نتیجه واکنشهای PCR، ژل آگارز یک درصد به شیوهی بیان شده در بخش 3-1-1 تهیه شد. سپس، 4 میکرولیتر از فرآوردههای PCR با یک میکرولیتر بافر بارگذاری آمیخته شد، و به چاهک ژل انتقال یافت. ولتاژ دستگاه در 80 ولت تنظیم و برای 90 دقیقه فرآیند الکتروفورز انجام شد. پس از پایان الکتروفورز، ژل روی صفحهی U.V. Transilluminator بررسی و از آن عکسبرداری شد. به کمک خطکشهای DNA که همراه نمونهها در ژل بارگذاری شده بود، قطعات تکثیر شده، اندازهگیری شدند. خطکشهای DNA، قطعاتی از مولکول DNA با وزن مولکولی مشخص و استاندارد هستند که برای تعیین اندازهی قطعات DNA استفاده میشوند.
3-5- هضم محصولات PCR با آنزیمهای برشی
پس از انجام واکنشهای زنجیرهای پلیمراز و بررسی درستی قطعههای مورد نظر (bp 428 برای ژن هورمون رشد و bp 342 برای ژن گیرنده هورمون رشد) با ژل آگارز یک درصد، واکنشهای هضم آنزیمی با آنزیم محدودکنندهی AluI برای هر دو ژن انجام شد. واکنشهای هضم در حجم 15 میکرولیتر و به صورت زیر انجام شد. آنزیم محدودکننده AluI توالی AGCT را شناسایی میکند و اتصال بین باز گوانین و سیتوزین را برش میزند. این آنزیم توسط باکتری گرم مثبت و خاکزی Arthrobacter luteus تولید میشود. پس از افزودن آب دو بار تقطیر، بافر، و آنزیم AluI به میزان مناسب برای هر نمونه (جدول 3-7) و تهیه مخلوط واکنش، برای شمار نمونههای مورد نظر، 10 میکرولیتر از فرآورده PCR به آن افزوده شد. واکنشهای هضم در طول شب در انکوباتور با دمای 37 درجه سانتیگراد انجام شدند.
جدول 3-7- ترکیبهای لازم برای هضم آنزیمی در هر واکنش هضم
ترکیب مقدار
آب دیونیزه 2.1 میکرولیتر
بافر آنزیم 5.1 میکرو لیتر
آنزیم AluI سه واحد
فرآورده PCR 10 میکرولیتر
تهیه ژل 5/2 درصد آگارز مشابه ژل یک درصد است، با این تفاوت که در این حالت، 5/2 گرم آگارز در 100 میلیلیتر بافر TAE 1x ،حل میشود. بعد از انجام واکنشهای هضم، برای بررسی اندازهی قطعات حاصل از هضم آنزیمی، کل حجم هر نمونه با 2 میکرولیتر بافر بارگذاری، آمیخته و به چاهک ژل 5/2 درصد انتقال داده شد. سپس، ولتاژ دستگاه در 75 ولت تنظیم و به مدت 90 دقیقه فرآیند الکتروفورز انجام شد. پس از پایان زمان الکتروفورز، ژل روی صفحه U.V. Transilluminator بررسی و از آن عکسبرداری شد. به کمک خطکشهای DNA که همراه نمونهها در ژل بارگذاری شده بود، قطعات حاصل از برش، اندازهگیری شد.
3-6- واکاوی همراهی چندریختیها با صفات تولیدی و تولیدمثلی
در این پژوهش همراهی چندریختیهای ژن هورمون رشد و گیرندهی آن با صفات تولید شیر، سختزایی، دوقلوزایی، مردهزایی، فاصلهی زایش، شمار روزهای باز، فاصلهی بین زایش تا اولین فحلی و شمار تلقیح به ازای هر آبستنی بررسی شد. مدل آماری استفاده شده، به صورت زیر بود.
yijklm = µ + hysi +pj+ gk +sirel +b1(FCAijklm) + eijklm
yijklm= عملکرد تولیدی یا تولید مثلی حیوان mام، با ژنوتیپ k، در دستهی lامین گاو نر، jامین شکم زایش، iامین دستهی گله- سال- فصل زایش
µ= میانگین کل
hysi= اثر ثابت iامین گله – سال- فصل زایش
pj= اثر ثابت jامین شکم زایش
gk= اثر ثابت kامین ژنوتیپ
sirel= اثر تصادفی lامین گاو نر
b1= ضریب رگرسیون متغیرهای وابسته (صفات) از سن در هنگام اولین زایش
FCAijklm= سن در هنگام اولین زایش در گاو mام، با ژنوتیپ kام، در دستهی l امین گاو نر، j امین شکم زایش، iامین گله – سال – فصل زایش
eijklm= اثر تصادفی باقیمانده با میانگین صفر و توزیع نرمال
واکاوی چندریختیها با صفات تولیدی و تولید مثلی با استفاده از نرمافزارSAS انجام شد. آنالیز همراهی صفات پیوسته با رویهی MIXEDو صفات گسسته با رویهی GENMOD انجام شد. میانگین حداقل مربعات ژنوتیپها در صفات پیوسته، در سطح 5 درصد با هم مقایسه شدند. در واکاوی صفات گسسته، ژنوتیپهای هر ژن با روش رگرسیون لجستیک مقایسه شدند و در آن از معیار نسبت بخت استفاده شد.
دادههای تولید شیر از مرکز اصلاح نژاد دام کشور گرفته شدند و دادههای صفات تولیدمثلی از مدیریت گاوداریهای مورد مطالعه، دریافت شدند. شمار دادهها برای هر یک از صفات تولید شیر، فاصلهی زایش، سختزایی، تعداد تلقیح به ازای هر آبستنی، مردهزایی، دوقلوزایی، نخستین فحلی پس از زایش و رزوهای باز، 452 داده بود. در واکاوی صفات پیوسته، افزون بر مقایسهی میانگین ژنوتیپهای هر ژن، اثر جایگزینی اللها نیز بررسی شد.
فصل چهارم

یافتهها
4-1- DNA ژنومیک
کیفیت و کمیت DNA ژنومیک بوسیله الکتروفورز با ژل آگارز یک درصد و دستگاه نانودراپNanodrop)) مدل T100 بررسی شد. غلظت DNA استخراج شده، 50-30 نانوگرم DNA در هر میکرولیتر بود. نتایج الکتروفورز برخی از نمونههای DNA استخراج شده در نگارهی 4-1 نشان داده شده است.

نگاره 4-1-الکتروفورز چند نمونه از DNA ژنومیک استخراج شده
4-2- فرآوردههای واکنشهای PCR ژنهای هورمون رشد و گیرندهی آن
برای ازدیاد قطعهی 428 جفت بازی از ژن هورمون رشد از آغازگرهای ارایه شده توسط (Lucy, 1993b) و برای ازدیاد قطعهی 342 جفت بازی از ژن گیرندهی هورمون رشد از

این نوشته در پایان نامه ها ارسال شده است. افزودن پیوند یکتا به علاقه‌مندی‌ها.

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *