مرکبات، بازیابی، ناقل، استخراج، پلاسمیدهای، زنجیره‏ای

– دستورالعمل تهیه باکتری‏های مستعد برای پذیرش DNA خارجی…………………………………….95
8-1- تهیه سلول‏های مستعد E.coli……………………………………………………………………………95
8-2- دستورالعمل تراریزش باکتری مستعد به روش شوک حرارتی………………………………………………96
8-3- تهیه‏ی سلول‏های مستعد و انتقال پلاسمید‏های نوترکیب pBI-hrpW و pBI-hrpG به سویه‏های آگروباکتریوم تومفاسینس با استفاده از روش ذوب و انجماد……………………………………………………….97
9- استخراج پلاسمید در مقیاس کم از باکتری E.coli سویه DH5α……………………………………………..99
9-1- استخراج پلاسمید به روش دستی…………………………………………………………99
9-2- استخراج پلاسمید با استفاده از کیت MBST (دکتر شایان)…………………………………….101
9-3- روش تهیه محلول های IPTG و …………………………………………………X-Gal103
9-3-1- تهیه محلول ایزوپروپیل D-B تیوگالاکتوپیرانوزید (IPTG)…………………………………………….103
9-3-2- تهیه 5 برمو-3 کلرو- اتیدولیل D-B گالاکتوزید (X-Gal)………………………………103
10- تهیه مایه تلقیح و بهینه‏سازی شرایط مایه‏زنی گیاه میزبان……………………………………………………..103

فهرست جداول
عنوان صفحه TOC t “جدول,1”
1-1- بیماریزایی فرم‏های مختلف شانکر روی چهار گونه از مرکبات………………………………….12
1-2- مشخصات آغازگرهای اختصاصی برای تکثیر و شناسایی………………………………………….29
2-2- برنامه Multipelex PCR با آغازگر‏های MS+/MS- و Xac01/Xac02………………………30
3-2- ترکیب محلول مادری برای واکنش Multipelex PCR جهت شناسایی باکتری…………….30
4-2- شیب‏ دمایی به‏کار رفته برای تعیین بهترین دمای اتصال با آنزیم Taq………………………….32
5-2- ترکیب محلول مادری برای واکنش زنجیره‏ای پلیمراز با آنزیم pfu دی.ان.آ پلیمراز……….32
6-2- چرخه حرارتی به‏کار ‏رفته برای تکثیر نهایی با آنزیم pfu………………………………………….33
7-2- شرایط واکنش هضم ژن hrpW و ناقل همسانه‏سازی مربوطه (pGEM7zf(-))…………….36
8-2- شرایط واکنش هضم ژن hrpG و ناقل همسانه‏سازی مربوطه (pUC19)……………………..36
9-2- شرایط واکنش دوتایی هضم آنزیمی جهت تایید ناقل‏های همسانه‏سازی ((-)pGEM7zf) و (pUC19)……………………………………………………………………………………………………………..37
10-2– شرایط واکنش هضم دوتایی آنزیمی جهت تایید ناقل بیانی(pBI121)……………………..37
11-2- شرایط واکنش هضم آنزیمی ژن hrpW و pBI121 جهت بازیابی قطعات مورد نظر از روی ژل……………………………………………………………………………………………………………………….38
12-2– شرایط واکنش هضم ژن hrpG و ناقل بیانی جهت بازیابی قطعات مورد نظر از روی ژل………………………………………………………………………………………………………………………….38
13-2- شرایط واکنش اتصال (pBI121-hrpG)…………………………………………………………..40
14-2- شرایط واکنش اتصال (pBI121-hrpW)……………………………………………………………40
15-2- شرایط واکنش اتصال (pUC19-hrpG)…………………………………………………………….41
16-2- شرایط واکنش اتصال (pGEM7zf(-)-hrpW)……………………………………………………41
17-2- چرخه حرارتی به‏کار رفته برای واکنش کلونی PCR به منظور تایید همسانه‏سازی در وکتور بیانی……………………………………………………………………………………………………………………..45
18-2- ترکیبات محلول مادری واکنش زنجیره‏ای کلونی PCR جهت تایید عمل همسانه‏سازی دروکتورهای کلونینگ و بیانی……………………………………………………………………………………45
1-5- مواد و مقدار مورد نیاز جهت تهیه بافر Loading dye………………………………………………91

فهرست شکل‏ها
عنوان صفحه
1-3- تست بیماریزایی روی لیمو………………………………………………………………………………………………482-3- تست (Xaco1 / Xaco2 / MS+/MS) Multiplex PCR……………………………………………………..493-3- اکتروفورزDNA ژنومی استخراج شده بر روی ژل آگارز 1%………………………………………………..504-3- واکنش زنجیره‏ای پلیمراز با Taq دی.ان.آ پلیمراز و گرادیان دمایی جهت بهینه‏سازی بهترین دمای اتصال با پرایمرهای اختصاصی………………………………………………………………………………………………….535-3- واکنش زنجیره‏ای پلیمراز برای تکثیر ژن‏های hrpG , hrpW با آغازگرهای اختصاصی و آنزیم pfu دی.ان.آ پلیمراز………………………………………………………………………………………………………………………..536-3- الکتروفورز محصول هضم آنزیمی ناقل‏های کلونینگ و بیانی با آنزیم‏های برشی نوع II بر روی ژل آگارز 1%………………………………………………………………………………………………………………………………..547-3- هضم آنزیمی فراورده ژن‏هایhrpG و hrpW جهت بازیابی از روی ژل آگارز)الف) و قطعات بازیابی شده(ب)………………………………………………………………………………………………………………………558-3- هضم آنزیمی ناقل‏های کلونینگpUC19 و pGM7zf(-) جهت بازیابی از ژل آگارز(الف) قطعات بازیابی شده(ب)……………………………………………………………………………………………………………………..559-3- واکنش کلونی PCR برای کلون‏های سفید حاصل ازhrpG و hrpW……………………………………5810-3- هضم آنزیمی پلاسمیدهای استخراج شده از کلونی‏های حاصل از واکنش اتصال pGEM و hrpw و همچنینhrpG و pUC19……………………………………………………………………………………………………..5811-3- الکتروفورز محصول واکنش زنجیره‏ای پلیمراز پلاسمیدهای تایید شده بر روی ژل آگارز 1%….5912-3- هضم آنزیمی ناقل بیانی جهت بازیابی از روی ژل آگارز (الف) قطعات بازیابی شده (ب)……..6113-3- فراورده بازیابی شده ناقل بیانی و ژن‏های hrpW/G جهت تعیین نسبت واکنش اتصال…………..6214-3- واکنش کلونی PCR تعدادی از کلون‏های حاصل از مخلوط اتصال وکتور pBI121 و ژن‏های hrpG و hrpW……………………………………………………………………………………………………………………….6315-3- هضم آنزیمی دوتایی پلاسمیدهای نوترکیبpBI.hrpG و pBI.hrpW با آنزیم‏هایXbaI/BamHI XbaI/SacI……………………………………………………………………………………………………………………………..6416-3- واکنش زنجیره‏ای پلیمراز برای پلاسمیدهای نوترکیبpBI.hrpG و pBI.hrpW جهت بررسی حضور ژن‏های مذکور……………………………………………………………………………………………………………..6517-3- پلاسمیدهای نوترکیب استخراج شده……………………………………………………………………………..6618-3- واکنش کلونی PCR تعدادی از کلون‏های حاصل از انتقال پلاسمیدهای نوترکیب pBI.hrpW/G به سویه‏های آگروباکتریوم تومفاسینس…………………………………………………………………………………………. 68 فصل اول
مقدمه و بررسی منابع
مقدمه
مقدمه‏ای بر مرکبات
مرکبات با نام علمی Citrus spp. از خانواده‌ی Rutaceae و زیرخانواده‌ی Auranutideae هستند. مرکبات گیاهانی بوته‌ای، درختچه‌ای با شاخ و برگ متراکم می‏باشند، اغلب گونه‌های مرکبات (مانند پرتقال، گریپ‌فروت و دورگ‌های نارنگی) در نواحی نیمه‌ گرمسیری با زمستان سرد فقط یک ‌بار در سال در اواخر زمستان و اوایل بهار گل می‌دهند. اما در نواحی گرمسیر و ساحلی ممکن است درختان مرکبات مانند لیموها و لایم‌ها که در بهار و تابستان گل می‌دهند، در طول سال چندین مرتبه گل داده و یا اینکه دوره‌ی گلدهی بسیار طولانی داشته باشند (دیویس و همکاران، 1994). در مرکبات گل‌ها 8-4 گلبرگ ضخیم سفید، قرمز یا ارغوانی رنگ، 5-4 کاسبرگ و 32-16 پرچم دارند. تخمدن دارای 14-6 برچه‌ی بیضوی متصل به خامه‌ی خیلی باریک و گاهی متورم و پهن بوده که به کلاله‌ی کروی ختم می‌شود. گل‌ها در مرکبات دو جنسی هستند و همچنین نوع گرده‌افشانی مرکبات برحسب گونه متفاوت است و خودگشن، خودگشن- دگرگشن و پارتنوکارپ هستند. به‏عنوان مثال، لیموترش عموماً خودگشن می‌باشد (کاستل و جمیتر، 1999).
میوه‌ی مرکبات غنی از ویتامین‌های A، B، C، فیبر، کربوهیدرات (قندهای ساده، فروکتوز، گلوکز و ساکارز) و مقادیری کلسیم، پتاسیم، نیاسین و اسیدفولیک می‌باشد که موجب پایین آوردن کلسترول خون، پیشگیری از عفونت‌های ویروسی و احتمال بروز سرطان روده و معده می‌شود (گورنستئین و همکاران، 2001). تولید مرکبات در جهان امروز از اهمیت بسزایی برخوردار است و یکی از منابع مهم ثروت، مبادلات تجاری و اشتغال به کار ساکنین حدود 137 کشور مرکبات‌خیز جهان به‌شمار می‌آید. حدود یک‏صد صنعت در جهان، از مرکبات در تولید فرآورده‌های خود استفاده می‌کنند. از موارد مهم و قابل توجه در صنعت مرکبات بالا بودن ارزش افزوده‌ی این محصول از طریق تولید محصولات جانبی آن است، که شامل مواد اولیه‌ی دارویی، غذایی و آرایشی و بهداشتی می‌شود (اسماعیل و ژانگ، 2004).
کشت و کار مرکبات بین عرض‌های جغرافیایی 40 درجه‌ی شمالی و جنوبی از خط استوا صورت می‌گیرد که در سطوح تجاری مناطق عمده‌ی تولید مرکبات جهان در بین عرض‌های جغرافیایی 5/23-40 درجه‌ی شمالی و جنوبی قرار دارند. حداقل حرارت مورد نیاز برای شروع رشد مرکبات (صفر فیزیولوژیک) 5/12 درجه‌ی سانتی‏گراد و متوسط دمای مناسب جهت رشد مطلوب 5/18 درجه سانتی‏گراد است، مرکبات ماهیانه به 180 ساعت مجموعه‌ی حرارتی نیاز دارند (فتوحی و همکاران، 1385). دما و آب به صورت چشمگیری در تنظیم زمان و دوره‌ی گلدهی، توزیع گل، درصد تشکیل میوه و وضعیت نمو و ریزش میوه‌ی درختان مرکبات تأثیر دارند. مرکبات جهت رشد و نمو در مناطق مرطوب به میزان 750 و در مناطق خشک به 1500 میلی‌متر (15 هزار متر مکعب آب در هکتار) آب در سال نیاز دارند (خوشخوی و همکاران، 1373). سرما و یخبندان از جمله مسائل محیطی خطرساز برای مرکبات در کنار بیماری‌ها و آفات به شمار می‌روند.
بهترین نوع خاک برای کشت و کار مرکبات، خاک شنی- لومی می‌باشد، و همچنین در محدوده‌ی 5/5 تا 5/7 از pH عملکرد خوبی دارند. در بین محصولات باغی، مرکبات حساس‌ترین گروه به شوری خاک می‌باشند (خوشخوی و همکاران، 1364).
تاریخچه‌ی کشت درختان مرکبات در ایران و جهانمنشأ مرکبات را می‌توان جنوب شرق آسیا، چین و مجمع الجزایر هند و از 2400 سال قبل از میلاد مسیح دانست (جمیتر و هو، 1990). از کناره‌های جنوبی دریای مازندران نیز به‏ ‌عنوان دومین کانون گسترش کشت مرکبات نام برده می‌شود (الهی‌نیا ،1383). ورود مرکبات به ایران به جز گونه‌ی بالنگ، سابقه‌ای 400 ساله دارد. به استناد مدارک تاریخی، ایران دروازه‌ی خروج مرکبات از آسیا به سایر مناطق جهان بوده است (الهی‏نیا، 1383).
سطح زیر کشت، میزان تولید و عملکرد درختان مرکبات در ایران و جهانبر اساس گزارش آمار مرکبات وزارت کشاورزی در سال 1392، سطح زیر کشت مرکبات کشور در قالب سه ناحیه‏ی مرکزی، شمالی و جنوبی به میزان 288108 هکتار و میزان تولید 4299247 تن بوده است که این آمار نشانگر تمایل جمعیت برای مصرف و در نتیجه لزوم اهمیت بیشتر به تحقیقات و کشت این محصول در راه تامین نیازهای غذایی جمعیت رو به‏ افزایش کشور است.
تولید مرکبات کشور حدود 4 میلیون تن برآورد شده و 3/86 درصد آن از اراضی آبی حاصل شده است. راندمان تولید مرکبات آبی در کشور 6/16931 کیلوگرم در هکتار است. بیشترین و کمترین عملکرد آبی به ترتیب با 2/21832 و 7/438 کیلوگرم به استان‌های مازندران و لرستان تعلق دارد.
بر اساس آمار فائو در سال 2008، سطح زیر کشت مرکبات در دنیا 7/8 میلیون هکتار بوده و میزان متوسط تولید محصول مرکبات جهان 122 میلیون تن گزارش شده است. بررسی کشورهای عمده‌ی تولیدکننده‌ی مرکبات نشان‌ می‌دهد که از نظر سطح زیر کشت به ترتیب چین، برزیل، نیجریه، مکزیک، آمریکا، هند، اسپانیا و ایران مقام اول تا هشتم را به خود اختصاص داده‌اند. این در حالی است که براساس میزان تولید مرکبات، کشورهای برزیل، آمریکا، چین، مکزیک، اسپانیا، هند، ایتالیا و ایران به‌ترتیب در رده‌های اول

این نوشته در پایان نامه ها ارسال شده است. افزودن پیوند یکتا به علاقه‌مندی‌ها.

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *