–122

دانشگاه آزاد اسلامی واحد آشتیان
پایان نامه کارشناسی ارشد رشته فیزیولوژی گیاهی
خالص سازی جلبک کلرلا و جدا سازی ترکیبات بیولوژیکی فعال درآن جلبک
استاد راهنما:
دکتر معصومه خسروی رینه
استاد مشاور:مهندس مجتبی یزدانی
دانشجو:معصومه اقرعی آهنگرانی فراهانی
1393
سپاس
حمد و سپاس ذات پاک خداوند بلند مرتبه که بار دیگر درلطف و رحمت بیکران خود را بر من گشود.از استاد ارجمندم سرکار خانم دکتر معصومه خسروی رینه به سبب راهنمایی های بی در یغشان کمال تشکر را دارم، همچنین از استادمشاور جناب آقای مهندس مجتبی یزدانی به سبب کمک های ارزنده شان قدر دانی می کنم.
از اساتید و دانشجویان پژوهشکده گیاهان دارویی جهاد دانشگاهی تهران به سبب کمک در انجام امور مربوط به پایان نامه کمال تشکر را دارم.
همچنین از همکلاسی ها و دوستان عزیزم، برای محبت ها و همراهیشان سپاسگزارم و برایشان آرزوی موفقیت دارم.
معصومه اقرعی آهنگرانی فراهانی
تابستان1393
تقدیم به:
تقدیم به عاطفه پاک پدر و مادر عزیزم
که همواره یار و همراه صادق و وفادار من بوده اند
2546985-525145صورتجلسه دفاع
باتأییدات خداوند متعال جلسه دفاع از پایان نامه کارشناسی ارشد خانم/آقای معصومه اقرعی آهنگرانی فراهانی
در رشته فیزیولوژی گیاهیتحت عنوان: خالص سازی جلبک کلرلا و جدا سازی ترکیبات بیولوژیکی فعال درآن جلبک
با حضور استادراهنما، استاد (استادان) مشاور و هیأت داوران در دانشگاه آزاد اسلامی واحد آشتیان در تاریخ 24/6/1393 تشکیل گردید. در این جلسه ، پایان نامه با موفقیت مورد دفاع قرار گرفت.
نامبرده نمره 7/17 با امتیاز بسیار خوب دریافت نمود.

1- استاد راهنما: دکتر معصومه خسروی رینه امضاء تاریخ
2- استاد داور: دکتر شهرام شعاعی امضاء تاریخ
3- مدیر گروه آموزشی: دکتر معصومه خسروی رینه امضاء تاریخ
5- رئیس دانشکده تحصیلات تکمیلی: مهندس مجتبی یزدانی امضاء تاریخ
معاون پژوهشی دانشگاه آزاد اسلامی واحد آشتیان
دکترراضیه محمدی
فرم شماره20
تعهدنامه اصالت رساله یا پایان‌نامه
ایـنجانب معصومه اقرعی آهنگرانی فراهانی دانـش آموخته مقطع کارشناسی ارشد ناپیوسته در رشـــــــته فیزیولوژی گیاهی که در تاریــــــخ 24/6/93 از پـــایـــان نـــامه / رســاله خود تــحت عــــنوان خالص سازی جلبک کلرلا و جدا سازی ترکیبات بیولوژیکی فعال درآن جلبک با کسب نمره 7/17 و درجه بسیار خوب دفاع نموده‌ام بدین وسیله متعهد می‌شوم:
این پایان‌نامه /رساله حاصل تحقیق و پژوهش انجام شده توسط اینجانب بوده و در مواردی که از دستاوردهای علمی پژوهشی دیگران ( اعم از پایان نامه، کتاب، مقاله و …) استفاده نموده ام، مطابق ضوابط و رویه موجود، نام منبع مورد استفاده و سایر مشخصات آن را در فهرست مربوطه ذکر و درج کرده‌ام.
این پایان نامه / رساله قبلا برای دریافت هیچ مدرک تحصیلی (هم سطح،پایین تریا بالاتر) در سایر دانشگاه ها و موسسات آموزش عالی ارائه نشده است.
چنانچه بعد از فراغت از تحصیل، قصد استفاده و هرگونه بهره‌برداری اعم از چاپ کتاب، ثبت اختراع و …. از این پایان‌نامه داشته باشم ، از حوزه معاونت پژوهشی واحد مجوزهای مربوطه را اخذ نمایم.
چنانچه در هر مقطع زمانی خلاف موارد فوق ثابت شود، عواقب ناشی از آن را می پذیرم و واحد دانشگاهی مجاز است با اینجانب مطابق ضوابط و مقررات رفتار نموده و در صورت ابطال مدرک تحصیلی‌ام هیچ گونه ادعایی نخواهم داشت.
نام و نام خانوادگی :
تاریخ و امضاء : معصومه اقرعی آهنگرانی فراهنی

*توجه: این فرم بایستی قبل از فهرست مطالب در پایان نامه صحافی شود.

فهرست
TOC o “1-3” h z u فصل اول مروری بر منابع PAGEREF _Toc403460759 h 11-مروری بر منابع …………………………………………………………………………………………………………… PAGEREF _Toc403460761 h 21-1-ریز جلبک ها ………………………………………………………………………………………………………….. PAGEREF _Toc403460762 h 21-1-1-شرایط رشد ریز جلبک ها ……………………………………………………………………………………. PAGEREF _Toc403460763 h 41-2-تاریخچه Chlorella Vulgaris ……………………………………………………………………………… PAGEREF _Toc403460764 h 51-3- خواص Chlorella Vulgaris ………………………………………………………………………………. PAGEREF _Toc403460765 h 61-4- رده بندی Chlorella …………………………………………………………………………………………….. PAGEREF _Toc403460766 h 81-5- Chlorella Vulgaris و مطالعات زیست پزشکی …………………………………………………….. PAGEREF _Toc403460767 h 81-6- روش های غربالگری، خالص سازی و شناسایی ریز جلبک ها ………………………………….. PAGEREF _Toc403460768 h 101-6-1- روشهای تهیه ریزجلبکها ……………………………………………………………………………………. PAGEREF _Toc403460769 h 111-6-1-1-خریداری ازمراکز فروش ریزجلبکها ………………………………………………………………… PAGEREF _Toc403460770 h 111-6-2-غربالگری …………………………………………………………………………………………………………. PAGEREF _Toc403460771 h 121-6-2-1-غربالگری از خاستگاههای طبیعی …………………………………………………………………….. PAGEREF _Toc403460772 h 121-6-3- غنی سازی محیط کشت ……………………………………………………………………………………. PAGEREF _Toc403460773 h 131-6-4- جداسازی مستقیم …………………………………………………………………………………………….. PAGEREF _Toc403460774 h 141-6-5- تولید کشت خالص ………………………………………………………………………………………….. PAGEREF _Toc403460775 h 151-6-6- شناسایی ریزجلبکهای جداشده ………………………………………………………………………….. PAGEREF _Toc403460776 h 181-6-6-1- شناسایی ریزجلبکها به کمک آنالیز مولکولی 18S rDN……………………………………… PAGEREF _Toc403460777 h 191-6-6-2- انجام عملیات BLAST جهت شناسایی سویه ریزجلبک …………………………………….. PAGEREF _Toc403460778 h 201-7- تکنیک های استخراج از جلبک ها ………………………………………………………………………… PAGEREF _Toc403460779 h 211-7-1- استخراج سیال فوق بحرانی ………………………………………………………………………………. PAGEREF _Toc403460780 h 251-7-2- استخراج مایع تحت فشار ………………………………………………………………………………….. PAGEREF _Toc403460781 h 301-7-3- استخراج با آب داغ تحت فشار(PHWE) ………………………………………………………….. PAGEREF _Toc403460782 h 341-7-4- استخراج با کمک اولترا سوند (UAE) و استخراج با کمک مایکروویو (MAE)………… PAGEREF _Toc403460783 h 361-8- مهمترین ترکیبات فعال زیستی استخراج شده از جلبک ها …………………………………………. PAGEREF _Toc403460784 h 371-8-1- آنتی اکسیدان ها ………………………………………………………………………………………………. PAGEREF _Toc403460785 h 371-8-2-فلاوونوییدها ……………………………………………………………………………………………………. PAGEREF _Toc403460786 h 391-8-2-1- بیوسنتز فلاوونوئیدها …………………………………………………………………………………….. PAGEREF _Toc403460787 h 401-8-2-2- انواع فلاوونوئیدها ………………………………………………………………………………………… PAGEREF _Toc403460788 h 411-9- لیپیدها ………………………………………………………………………………………………………………… PAGEREF _Toc403460789 h 421-10- کربوهیدرات ها ………………………………………………………………………………………………….. PAGEREF _Toc403460790 h 441-11- پپتیدها و پروتیین ها …………………………………………………………………………………………… PAGEREF _Toc403460791 h 44فصل دوم مواد و روش ها PAGEREF _Toc403460792 h 462-2-آماده کردن محیط کشت BG-11 …………………………………………………………………………… PAGEREF _Toc403460794 h 503-2- نحوه خشک کردن نمونه ها …………………………………………………………………………………… PAGEREF _Toc403460795 h 532-3- تهیه عصاره متانولی گیاهان ……………………………………………………………………………………. PAGEREF _Toc403460796 h 532-4- تعیین فلاونوئید کل ………………………………………………………………………………………………. PAGEREF _Toc403460797 h 54فصل سوم نتایج PAGEREF _Toc403460798 h 593-1- نتایج حاصل از سنجش فلاوونوئید کل ……………………………………………………………………. PAGEREF _Toc403460800 h 603-2- نتایج حاصل از سنجش فعالیت روبش رادیکال DPPH ……………………………………………. PAGEREF _Toc403460801 h 623-3- نتایج حاصل از سنجش بتا کارتنوئید ………………………………………………………………………. PAGEREF _Toc403460802 h 633-4- نتایج حاصل از آنالیز آماری …………………………………………………………………………………… PAGEREF _Toc403460803 h 64بررسی نمودار ……………………………………………………………………………………………………………….. PAGEREF _Toc403460804 h 723-4- تفسیر نتایج ………………………………………………………………………………………………………… PAGEREF _Toc403460805 h 74فصل چهارم بحث نتیجه گیری و پیشنهادات PAGEREF _Toc403460806 h 76نتیجه گیری ………………………………………………………………………………………………………………….. PAGEREF _Toc403460811 h 86پیشنهادات …………………………………………………………………………………………………………………….88فهرست منابع PAGEREF _Toc403460813 h 89منابع فارسی ………………………………………………………………………………………………………………….89منابع لاتین ……………………………………………………………………………………………………………………. PAGEREF _Toc403460816 h 91
جداول
جدول2-1- مواد تشکیل دهنده محیط کشت Chu…………………………………………………………………….48
جدول2-2- مواد تشکیل دهنده محیط کشت BG-11………………………………………………………………. 51
جدول 3-1- نتایج حاصل از سنجش فلاوونوئید کل ……………………………………………………………….. 60
جدول3-2- نتایج حاصل از فعالیت روبش رادیکال DPPH …………………………………………………….. 61
جدول3-3-جداول مربوط به آنالیز آماری t-test ……………………………………………………………………… 62
نمودارها
نمودار3-1- نمودار کوئرستین سنجش فلاوونوئید کل …………………………………………………………….. 61
نمودار3-2- نمودار کوئرستین سنجش فعالیت روبش رادیکال DPPH ……………………………………… 62
نمودار3-3-میانگین فعالیت روبش رادیکال DPPH ……………………………………………………………….. 63
نمودار3-4- میانگین جذب آنتی اکسیدان ………………………………………………………………………………. 72
نمودار3-5- میانگین جذب روبش رادیکال DPPH………………………………………………………………… 73
اشکال
تصویر 1-1- شکل شماتیک برای استخراج سیال فوق بحرانی ………………………………………………… 30
تصویر1-2- شکل شماتیک برای استخراج با مایع تحت فشار………………………………………………….. 33
تصویر 1-3- دستگاه تابش اولترا سونیک/مایکرویو ………………………………………………………………… 36
چکیده:
جلبک ها و ریز جلبک ها به عنوان منابع اصلی ترکیبات غذاهای عملکردی مورد استفاده قرار گرفته اند.و این جلبک ها به عنوان اهداف کلیدی برای دستیابی به ترکیبات فعال زیستی مطرح هستند. ترکیبات موجود در این جلبک ها می توانند فعالیت ضد فشار خون بالا، اثرات کاهشی بر روی کلسترول، خواص آنتی اکسیدانی یا اثرات تنظیمی بر روی اشتها داشته باشند که به صورت تجاری هم عرضه می شود. از بین ریز جلبک ها Chlorella Vulgaris یکی از مواد ی است که بیشترین تحقیقات علمی در مورد آن انجام شده است واولین ریز جلبکی بود که به طور گسترده به عنوان منبع غذایی کشت شد. این ریز جلبک سبز تک سلولی دارای ارزش غذایی بالا شامل پروتیین ها، کربو هیدرات ها، لیپیدها، کارتنوییدها، آنتی اکسیدان، ترکیبات محرک ایمنی، ویتامین ها، پلی ساکارید، مواد معدنی، عامل منحصر بفرد CGF (فاکتور رشدکلرلا) است هرگاه یافتن نوع به خصوصی از ریزجلبکها با خصوصیاتی ویژه از خاستگاه و محیط های طبیعی آنها موردنظرباشد باید به روشهای غربالگری متوسل شویم گام اول در جداسازی یک ریزجلبک از خاستگاه طبیعی آن، انتخاب نوع محیط زیست ریزجلبک با شرایطی ویژه بر اساس اهداف نهایی تحقیق است. مرحله اصلی و مهم در غربالگری ایجاد یک کشت خالص است. به عبارت دیگر در این مرحله تلاش می شود نمونه مشخصی از ریزجلبک که فاقد هر نوع ارگانیسم دیگری از جمله باکتری، قارچ، پروتوزوا و غیره باشد، موردکشت قرارگیرد. در مطالعه حاضر نمونه ها به طور مکرر از مناطق مختلف همچون عباس آباد شازند، خنداب، سراب گیان نهاوند و میادین مختلف شهر اراک جمع آوری شد و با واکشت های مختلف در دو محیط کشت مایع و جامد Chu خالص سازی نمونه ها انجام شد.سپس نمونه های جلبکی Chlorella طی مراحلی خشک شد و فرایندهای مربوط به عصاره گیری انجام شد. و مقادیر فلاوونوئید، بتاکاروتنوئید، فعالیت آنتی اکسیدانی سنجیده شد و با استفاده از نرم افزارspss داده ها مورد ارزیابی و آنالیزقرار گرفت. نتایج واکشت های مختلف بهترین شرایط برای رشد Chlorella را در محیط کشت Chu به دست آورد. نتایج جذب با دستگاه اسپکترو فتومتری مقدار 67/494میلی گرم بر میلی لیتر اسید آسکوربیک ، 447/0بتا کاروتنوئید و مقادیر بسیار اندکی از فلاوونوئیدها را برای Chlorella Vulgaris تعیین کرد. مطالعه ای که توسط Wang و همکارانش در سال 2010 انجام شد مقادیر بالایی از لیپید ها و کارتنوئید ها را در جلبکChlorella vulgaris تعیین کرد اما مقدار فلاوونوئید حاصل در این مطالعه بسیار ناچیز بود (019/0) که نتایج مطالعه حاضر را تآیید می کند که ممکن است به دلیل روش های مختلف کشت و نوع حلال های به کار رفته در این بررسی باشد وبرای تعیین مقادیر ترکیبات زیستی به ویژه فلاوونوئیدها روش های استخراج پیشترفته تر و تغییر در شرایط کشت را پیشنهاد می کند.
کلمات کلیدی: Chlorella vulgaris ، محیط کشت Chu و BG-11 فلاوونوئید، بتا کارتنوئید، آنتی اکسیدان
مقدمه
وقوع و شیوع بیماری های مختلفی همچون سرطان، بیماری های قلبی-عروقی، چاقی، و دیابت ممکن است مربوط به رژیم غذایی پر کاری و ترکیبی از سبک زندگی بی تحرک باشد. مفهوم غذاهای عملکردی اولین بار در ژاپن ظاهر شد جایی که این مفهوم به عنوان وسیله ای برای افزایش سلامتی و سالم زیستن در نظر گرفته شده بود. این مفهوم سپس در کشور های اروپایی به میزان زیادی توسعه یافت.محیط دریا که شامل تنوعی از موجودات با خواص زیستی بی نظیر است یکی از عمده ترین منابع غذایی برای دستیابی به مفهوم غذاهای عملکردی می باشد. تا این تاریخ جلبک ها و ریز جلبک ها به عنوان منابع اصلی ترکیبات غذاهای عملکردی مورد استفاده قرار گرفته اند.و این جلبک ها به عنوان اهداف کلیدی برای دستیابی به ترکیبات فعال زیستی مطرح هستند (Ibañez , et al,2012).
جلبکها گروه بزرگی از گیاهان هستند که از لحاظ شکل و اندازه ، تنوع وسیعی دارند. برای اولین بار ، لینه گیاه شناس ، در سال 1754 ، این گیاهان را با نام آلجی معرفی کرد. رومیها از واژه fucus ، چینیها از واژه tsao و مردم هاوایی از واژه limo برای معرفی این گیاهان استفاده می‌کردند. در تقسیمات جهانی گیاهی ، جلبکها 1800 جنس و 21000 گونه دارند. بیشتر جلبکها ، آبزی هستند. در جلبکها هر سلول دارای 1 تا 2 عدد کلروپلاست و بندرت دارای کروماتوفور هستند. در جلبکها ساختارهای تولید مثلی بطور کامل به هاگ یا گامت تبدیل می‌شوند. جلبکها یا یوکاریوت یا پروکاریوت هستند. تولید مثل در جلبکها به دو طریق جنسی و غیر جنسی صورت می‌گیرد. جلبکها فاقد هر نوع منفذ یا روزنه هستند و ریزوئیدها در آنها در صورت وجود بسیار ساده است. اندامهای جنسی در جلبکها تک سلولی یا پرسلولی است . ذخیره غذایی در جلبکها ، نشاسته است و به صورت اتوتروف زندگی می‌کنند و دیواره سلولی در آنها از سلولز تشکیل شده است.
ترکیبات موجود در این جلبک ها می توانند فعالیت ضد فشار خون بالا، اثرات کاهشی بر روی کلسترول، خواص آنتی اکسیدانی یا اثرات تنظیمی بر روی اشتها داشته باشند که به صورت تجاری هم عرضه می شوند.جلبک ها یک گروه ناهمگن و پیچیده از موجوداتی را تشکیل می دهند که به واسطه ماهیت فتوسنتتیک آنها و ساختارهای ساده تولید مثلی شناخته شده اند. جلبک ها بر اساس اندازه خود می توانند به دو گروه موجودات تک سلولی با عنوان میکرو جلبک ها و موجودات پرسلولی با نام ماکروجلبک هاشناخته می شوند. جلبک ها به طور فراوانی در محیط های با میزان زیادی از نور، نمک و دما زندگی می کنند. به منظور سازگاری با این شرایط حاد بیشتر جلبک ها دامنه متنوعی از متابولیت های ثانویه راتولید می کنند که اغلب فعالیت های زیستی بالقوه ای دارند. کشت یا تولید اکثر جلبک ها در مقیاس صنعتی ساده است. بنابراین تولید ترکیبات فعال زیستی مشتق از جلبک ها ممکن است توسط انتخاب شرایط کشت مناسب تنظیم شود. نحوه به دست آوردن ترکیبات زیستی از میکرو و ماکروجلبک ها به عنوان یک منشأ جدید از اهمیت زیادی برخوردار است. در این رابطه یک نیاز اساسی برای ترکیب مناسب، انتخاب، هزینه مؤثر و روشهای استخراج مناسب و سازگار با محیط زیست با در نظر گرفتن ملزومات قانونی برای حلال های مناسب غذایی و روش های صحیح وجود دارد( .(Sharma ,et al 2012 در مطالعه حاضر نمونه برداری جلبک Chlorella vulgaris از مناطق مختلفی همچون عباس آباد شازند، خنداب، پارک های ملایر، سراب گیان نهاوند و میدان شریعتی شهر اراک انجام شد و سپس نمونه ها برای انجام خالص سازی با استفاده از واکشت های مختلف به آزمایشگاه منتقل شد برای رشد این جلبک از محیط کشت های جامد و مایع Chu و BG-11استفاده شد. و مقادیر فلاوونوئید ، کاروتنوئید و فعالیت آنتی اکسیدانی با استفاده از فعالیت روبش رادیو اکتیو سنجیده شد و آزمایش ها در سه تکرار انجام شد در نهایت با استفاده از نرم افزار SPSS نتایج آماری تجزیه و تحلیل شد.
اهداف
هدف از مطالعه حاضر شامل جمع آوری جلبکها شناسایی خصوصیات تاکسونومیکی جنس با استفاده از کلیدهای شناسایی معتبر، تهیه محیط کشت و انتخاب محیط کشت موثر، جداسازی و خالص سازی جنس chlorella، شناسایی و جداسازی ترکیبات فعال بیولوژیکی موجود در جنس(فلاوونوئید، بتاکارتنوئید، انتی اکسیدان(اسیدآسکوربیک))، است.
فصل اولمروری بر منابع1-مروری بر منابع1-1-ریز جلبک هاریز جلبک ها کارخانه های سلولی هدایت شده با نور خورشید هستند که دی اکسید کربن را به سوخت های زیستی بالقوه ، غذا و ترکیبات فعال زیستی با ارزش بالای غذایی تبدیل می کنند. این جلبک ها در مقایسه با فرآورده های رایج غذایی، بهره وری بیشتر، محتوای لیپید و پروتیین نسبتا بالایی دارند و به زمین های مزروعی و آب تازه وابسته نیستند. در دهه گذشته بیوتکنولوژی ریز جلبک ها یک گزینه قابل توجه برای به دست آوردن غذا و مولکولهای زیستی متشکل از پروتیین ها، ویتامین ها، رنگدانه ها، اسیدهای چرب غیر اشباع چندگانه و موادی با فعالیت های ضد توموری و تعدیل کننده سیستم ایمنی بوده است. برخی از فواید ریز جلبک ها شامل کنترل فشار بالا، درمان کولیت اثرات آنتی توموری است. (Yusof, et al, 2013) امروزه علاقمندی زیادی در رابطه با تولید لیپیدها از انواع ریز جلبک ها وجود دارد. از لحاظ تئوری ریز جلبک ها قادر به تولید مقادیر بالاتری از لیپید نسبت به دیگر محصولات مرسوم هستند بنابراین منبع بالقوه ای برای سوختهای زیستی به شمار می روند. همچنین مشخص شده که ریز جلبک ها دارای مقادیر بالایی از آنتی اکسیدان های طبیعی هستند. این ریز جلبک ها به دلیل غنی بودن لیپید هایشان از اسید های چرب امگا-3 با زنجیره بلند EPAو DHA می توانند منبع قابل ملاحظه ای از اسید های چرب تغذیه ای در مقایسه با روغن ماهی فراهم آورند. ریز جلبک ها میکرو ارگانیسم هایی فتوسنتتیک هستند که انرژی نوری، آب و دی اکسید کربن را به توده زیستی جلبک تبدیل می کنند. اصول کشت ریز جلبک ها مشابه کشت در باکتریها، قارچها و مخمرهاست، تنها از لحاظ ترکیبات محیط کشت و جنبه فتوسنتتزی از هم متمایزند. ریز جلبک ها به طور ویژه ای در تبدیل انرژی خورشیدی مؤثر هستند. چندین گونه از ریز جلبک ها غنی از روغن هستند، محتوای روغنی برخی ریز جلبک ها حدود 80% وزن خشک آنها در شرایط محصول کامل است. ریز جلبک ها شامل دو نوع، لیپیدهای خنثی و لیپیدهای قطبی هستند. فسفولیپیدها و گلیکولیپیدها، لیپیدهای قطبی هستند فسفولیپیدها در ساختار غشایی تجمع یافته اند و گلیکولیپیدها در غشای اندامک های فتوسنتز کننده به طور غالب وجود دارند. لیپیدهای خنثی به طور ویژه شامل مونو ، دی و تری اسیل گلیسرول هستند. این لیپیدها به دنبال یک کمبود در اندامک هایی نظیز کلروپلاست ذخیره می شوند. اسیدهای چرب غیر اشباع به ندرت در سلول به صورت آزاد یافت می شوند بلکه عمدتا در ذخایر لیپیدی همچون تری گلیسریدها قرار دارند. ریز جلبک ها از فتوسنتز برای تثبیت دی اکسید کربن با استفاده از آنزیم Rubisco استفاده می کنند.Plaza, et al,2009, Liang, et al, 2009.sharma,2012)).
1-1-1-شرایط رشد ریز جلبک هارشد جلبک تحت تأثیر فاکتور های متعددی همچون ریز مغذی ها، شوری، pH، دما و نور(شدت و مدت زمان) است.در بین این عوامل، نور که به طور مستقیم مکانیسم فتوسنتز را تحت تأثیر قرار می دهد یک عامل مهم در تعریف شرایط مناسب برای کشت است. فتوسنتز فیتوپلانکتون ها توسط فاکتور های طبیعی همچون دما و پرتودهی کنترل می شود. این فاکتورها ارزش غذایی فیتوپلانکتون ها همچون پروتیین، لیپید، کربوهیدرات، اسید های آمینه و ترکیبات رنگدانه دار را متأثر می کنند. مطالعات، اثرات پرتودهی و دوره نوری روی توده زیستی و ترکیب اسید های چرب Chlorella vulgaris را بررسی کرده اند. مدت زمان زیادی است که اثرات زیان آور تابش مستقیم نور بر روی کشت جلبک مشخص شده است. تحت شرایط کشت طبیعی شعاع مستقیم نور خورشید بندرت روی جلبک قرار می گیرد و موقعیت قرار گیری آن چند سانتیمتری داخل آب برای کاهش اثرات مضر کافی است. در زیستگاه های طبیعی جلبک ها به طور غالب در نور کاهش یافته رشد می کنند از اینرو برای اجتناب از تابش مستقیم نور کشت بایستی در پنجره قرار بگیرد.( Ryckebosch, et al,2011).
1-2-تاریخچه Chlorella VulgarisChlorella یکی از قدیمی ترین گیاهان روی کره زمین است. Chlorella بالاترین میزان کلروفیل را در بین گیاهان شناخته شده جهان دارد که همین خصوصیت باعث ایجاد رنگ سبز تیره آن شده است . نام Chlorella بر گرفته از ,واژه یونانی « chloros » به معنی سبز وپسوند لاتین «ella» به معنی کوچک می باشد. با وجود اینکه Chlorella از زمان آغاز حیات بر روی کره زمین وجود داشته است و کشف آن به سال 1890  بوسیله میکرو بیولوژیست آلمانی به نام M.W.Beijerinck   بر می گردد ولی تا سال1940 بطور جدی مورد مطالعه قرار نگرفت. و پروفسور Beijerinck  برای اولین بارChlorella را در آزمایشگاه شخصی اش پرورش داد بیوشیمیست و فیزیولوژیست سلولی آلمانیOtto Heinrich Warburg در سال 1931 برای مطالعه بر روی تنفس سلولی همچنین بررسی فتوسنتز Chlorella موفق به دریافت جایزه نوبل شد و در دهه 1940 ژاپنی‌ها شروع به مطالعه وسیع‌تری درباره آن کردند. شهرت امروزهChlorella بیشتر مرهون تلاش آن‌ها برای شناخت این جلبک است.
ژاپن برای اولین بار در جهان برای گسترش تکنولوژی پرورش Chlorella پیشگام شد. Chlorella به دلیل داشتن دیواره سلولی سخت و نفوذناپذیر ، در صورت مصرف مستقیم سلول غیر قابل استفاده و مواد مغذی داخل آن غیر قابل دسترس می باشد. فرایند منحصر به فرد شکستن دیواره سلولی این گیاه در حالیکه مواد مغذی داخل سلول دست نخورده باقی بماند اولین بار به وسیله یک شرکت ژاپنی با موفقیت انجام شد.(Simon,2000)
1-3- خواص Chlorella Vulgaris
از بین ریز جلبک ها Chlorella Vulgaris یکی از مواد ی است که بیشترین تحقیقات علمی در مورد آن انجام شده است ) واولین ریز جلبکی بود که به طور گسترده به عنوان منبع غذایی کشت شد. این ریز جلبک سبز تک سلولی دارای ارزش غذایی بالا شامل پروتیین ها،کربو هیدرات ها، لیپیدها، کارتنوییدها، آنتی اکسیدان، ترکیبات محرک ایمنی، ویتامین ها، پلی ساکارید، مواد معدنی، عامل منحصر بفرد CGF (فاکتور رشد کلرلا) است2009) . (Morris et al این ریز جلبک به عنوان یک غذای سالم، مکمل غذایی و همچنین در صنعت دارویی و آرایشی کاربرد دارد. به دلیل کامل بودن منابع غذایی Chlorella می توان آنرا به تنهایی به عنوان یک غذای کامل برای یک دوره طولانی استفاده نمود. محققان ناسا نیز در مورد استفاده از آن به عنوان غذای فضا نوردان در طول سفرهای فضایی تحقیقاتی داشته اند.
مکمل به دست آمده از این جلبک می تواند به صورت کپسول ،قرص، مواد افزودنی غذایی یا به صورت عصاره مایع مورد استفاده قرار بگیرد Chlorella vulgarisبه صورت تجاری به عنوان مکمل غذایی یا افزودنی به غذاهایی همچون حبوبات و یولاف عرضه شده است. (Yusof, et al 2012, Morris et al, 2009). گزارش های جدید حاکی از این است که مقادیر تولید Chlorella سالیانه به میزانه 2000 تن است. و توده زیستی آن در غنی سازی پروتیین غذاهای رایج و فرمولاسیون غذاهای عملکردی و مکمل های غذایی کاربردی است . اخیرا برخی از گونه های آن به عنوان منشأ سوخت های دیزلی شناسایی شده اند. مشخصات لیپیدهای توده زیستی به دست آمده از این جنس نشان داده که Chlorella vulgaris به عنوان ماده خام برای سوخت های زیستی مناسب است. جلبک های سبز یکی از گروه های عمده تاکسونومیکی هستند که کاربرد عمده آنها به عنوان منبع تولید سوخت های زیستی به علت غنی بودن آنها از لیپید است و به عنوان منبع ضروری اسیدهای چرب برای تغذیه انسانی و حیوانی به شمار می رود.
یکی از روش های تحقیقی عمده ارزیابی Chlorellaبه عنوان منبع تولید پروتیین بوده است اماChlorella یک دیواره سلولزی قوی دارد و پروتیین حاصل از آن نتایج ضعیفی خواهد داشت. روش هیدرولیز آنزیمی به عنوان یک روش نوید بخش میزان هضم پروتیینی را افزایش داده است. .(Morris et a,2009)
1-4- رده بندی Chlorella
Chlorella یک جنس از جلبک های سبز تک سلولی است. شکل آن کروی و حدود 10-2 میکرومتر قطر دارد و فاقد تاژک می باشد. این ریز جلبک حاوی رنگدانه های فتوسنتزی سبز کلرو فیل a و b در کلروپلاست خودش است و از لحاظ سیستماتیکی متعلق به (سلسله Plantae، شاخه Chlorophyt، رده Trebouxiophyceae، راسته Chlorellales، خانواده Chlorellaceae، جنس Chlorella) است(Gonzalez, et al,2013). و گونه های آن شامل:
Chlorella minutissimaChlorella autotrophicaChlorella variabilisChlorella pyrenoidosaChlorella vulgaris است.
1-5- Chlorella Vulgaris و مطالعات زیست پزشکی
این ریز جلبک توجه قابل ملا حظه ای در برنامه های کاربرد ریز جلبک ها در تغذیه و زیست پژشکی به خود اختصاص داده است. و تأ ثیرات مثبت آن در مطالعات انسانی و جانوری در ژاپن و ایالات متحده شناخته شد. مطالعات نشان داه اند که این نوع جلبک باعث کاهش تکثیر و القا آپوپتوز دودمان سلول های سرطانی کبد می شود. مطالعات در بدن موجود زنده اثرات ضد توموری و ضد سمیتی این جلبک را آشکار ساخته است. همچنین بررسی ها نشان داده اند عصاره حاصل از این جلبک متاستاز ناشی ازتومور فیبروسارکومای موشی را سرکوب می کند.تحقیقات نشان داده عصاره به دست آمده ازChlorella vulgaris در مقایسه با دیگر جنس های ریز جلبک ها از محتوای آنتی اکسیدانی بیشتری برخوردار است.در مطالعات جانوری عصاره گرفته شده از Chlorella vulgaris اثرات ضد التهابی، ضد توموری و ضد کلسترولی را آ شکار ساخت. همچنین مشخص شده است که عصاره Chlorella vulgaris باعث القا آپوپتوسیس می شود. بنابراین گونه های ریز جلبک ها به ویژه Chlorella vulgaris می تواند برای توسعه فرآورده های آنتی اکسیدانی و ضد سرطانی سودمند باشد. ( Wang, et al,2010) عصاره استخراج شده با آب داغ حاصل از Chlorella vulgaris باعث تخریب DNA و القا آپوپتوسیس در سلولهای سرطانی کبد می شود(Yusof, et al,2012 (. در مطالعه ای اثر عصاره Chlorella بر روی بیان پروتیین های تنظیمی آپوپتوسیس در موش های صحرایی القا شده با سرطان کبد به اثبات رسیده استAzamai, et al,2010) ( .
برخی از تحقیقات اثر Chlorella بر روی پوست را به اثبات رسانده اند به طوری که مشخص شده Chlorella اثرات ضد کلاژناز و ضد الاستاز و یک اثر تحریکی بر روی سنتز کلاژن دارد Chlorella باعث افزایش بیان elafin شده و بنابر این از تخریب الاستین جلوگیری می کند همچنین نشان داده شده که Chlorella بر روی پروتیین های اتصالی اپیدرمی دارای اثرات مثبتی است. این نوع ریز جلبک پوست را از اثرات سیستم ایجاد کننده رادیکال های آزاد و در نتیجه پیر شدن پوست حظ می کند.(Smiley, et al,2005).
1-6- روش های غربالگری، خالص سازی و شناسایی ریز جلبک هابا توجه به اهمیت روزافزون ریزجلبکها و به دلیل کاربردهای فراوان آنها در تولید غذای انسان و دام و همچنین به علت ترکیبات ارزشمندی که تولید می کنند، در اینجا لازم است روشهای متداول درجداسازی، شناسایی و کشت این میکروارگانیسمها مختصراً مورد بحث قرارگیرد. Prescott et al1992,Kuzmina,2004).)
1-6-1- روشهای تهیه ریزجلبکهابه طورکلی، جهت به دست آوردن سویه های ریزجلبکی دو راهکار اصلی دنبال می شود. در راهکار اول جنس، گونه و حتی سویه ثبت شده در کلکسیونهای معتبر دنیا را سفارش داده و خریداری می کنند و در راهکار دوم، با استفاده از روشهای غربالگری این قبیل موجودات از طبیعت جداسازی، خالص سازی و مورد شناسایی قرارمی گیرند. Prescott et al1992,Kuzmina,2004).)
1-6-1-1-خریداری ازمراکز فروش ریزجلبکهافهرستی از مراکز معتبر عرضه و فروش ریزجلبکها به همراه آدرس اینترنتی آنها در پیوست آمده است. این مراکز، انواع مختلفی از ریزجلبکهای شناسایی شده و خالص را ارائه می دهند. با سفارش و خریداری از این کلکسیونها که در آنها هر سویه با کُد و شماره ای مشخص می شود می توان منبع کاملاً خالصی از ریزجلبکها را در اختیار گرفت. کلکسیون جلبکها و سیانوباکتریهای دانشگاه تورنتو کانادا یکی از معتبرترین این مراکز است که با داشتن بیش از 500 جنس و گونه مختلف (UTCC) ریزجلبکی به صورت کشت مایع و جامد، سویه های مورد نیاز را در اختیار محققین قرارمی دهد. در ایران هم پارک علم و فناوری خلیج فارس اقدام به جمع آوری و کشت سویه های مختلف جلبکی کرده و به مطالعه محققین می تواند سودمند باشدPrescott et al1992,Kuzmina,2004).)
1-6-2-غربالگریهرگاه یافتن نوع به خصوصی از ریزجلبکها با خصوصیاتی ویژه از خاستگاه و محیط های طبیعی آنها موردنظرباشد باید به روشهای غربالگری متوسل شویم. به عنوان مثال اگر هدف، پیداکردن سویه ریزجلبکی موثر بر آلاینده های محیط زیست باشد یکی از روشهای توصیه شده آن است که در محل آلودگی با آلاینده به جستجوی ریزجلبکهای مقاوم یا تجزیه کننده آن بپردازیم. مرحله پس از یافتن سویه، خالص سازی، شناسایی و کشت بهینه آن در محیط آزمایشگاهی خواهد بود. بررسی چگونگی و میزان حذف آلاینده های طبیعی توسط سویه غربال شده در مرحله بعدی قراردارد. غربالگری به طور عمده در چند مرحله انجام می گیرد که در ادامه بحث می شود(2008.( Jhon DM et al, 2002, Shokravi
1-6-2-1-غربالگری از خاستگاههای طبیعیگام اول در جداسازی یک ریزجلبک از خاستگاه طبیعی آن، انتخاب نوع محیط زیست ریزجلبک با شرایطی ویژه بر اساس اهداف نهایی تحقیق است. به عبارت دیگر، جستجو در زیستگاههای مناسب به منظور افزایش احتمال یافتن نوع خاصی از ریزجلبک، مراحل بعدی بخصوص مرحله خالص سازی یک سویه با ویژگی های مطلوب را آسانتر می سازد. به طور عمده، نمونه های خاک و آب ممکن است از مناطق مختلفی مانند چشمه های آب گرم، یخهای قطبی، فاضلابهای صنعتی، شالیزارها و بسیاری از زیستگاههای دیگر جمع آوری شوند. بنابراین با توجه به هدفی که در نظرگرفته می شود، زیستگاه مناسب جهت جداسازی ریزجلبکها انتخاب می گردد. مثلاً اگر هدف جداسازی یک گونه سرمادوست باشد می توان نمونه را از زیستگاههایی نزدیک مناطق سردسیر تهیه کرد. در مواردی نمونه های حاوی ریزجلبکها جمع آوری شده باید فیلترشوند و در مواردی نیز نمونه مستقیماً و بدون نیاز به انجام مرحله اضافی جهت جداسازی و غربالگری، مورد استفاده قرارمی گیرند. در مواردی که گونه های ریزجلبکی به صخره ها و پوسته صدف ها چسبیده اند باید با تراشیدن، آنها را از سطوح جدا نمود Shokravi ,et al,2007, Bellinger, et al 1992 )).(اسماعیلی ساری و همکاران، 1379).
1-6-3- غنی سازی محیط کشتدر این روش، شرایط مناسب جهت رشد و تکثیر یک گروه خاص مثلاً ریزجلبکهای فتوسنتزکننده فراهم می شود؛ درحالیکه در آن شرایط سایر ریزجلبکها رشدنمی کنند. مثلاً برای جداکردن یک ریزجلبک فتوسنتزکننده از خاک ابتداء 5 تا 10 میلی گرم از نمونه خاک را به 5/2 تا 3 میلی لیتر از محیط کشت مناسب جهت رشد ریزجلبکها اضافه می کنیم و به مدت 3 هفته آنها را در پلیت های میکروبیولوژی، در دمای25 درجه سانتیگراد نگهداری می کنیم. در صورت نوردهی مناسب به همراه دمیدن هوای حاوی 5 درصد دی اکسیدکربن، پس از طی مدت زمانی، آثار رشد ریزجلبکهای موجود قابل مشاهده خواهد بود. سلولهای رشدیافته در پلیت های اولیه را در مرحله بعد به پلیت های جدیدی منتقل می کنیم تا ریزجلبک هدف جداسازی گردد. محیط کشت حاوی املاح و آگار برای جداسازی انواع فتوسنتزکننده و محیط کشت حاوی یک ترکیب آلی کربندار برای رشد انواع میکسوتروف قابل استفاده خواهد بود. به دنبال چند مرحله تکرار روند مذکور و تعویض محیط کشت، در نهایت به جداسازی و خالص سازی یک سویه مشخص از ریزجلبکها خواهیم رسید. در مواردی که نمونه های آب حاوی ریزجلبکها مورد نظر باشد یک تیمار اولیه ضروری است. در این حالت، با عبوردادن نمونه ازصافی مناسب و به دنبال آن شستشوی توده سلولی پشت صافی با آب مقطر استریل، باقیمانده به محیط حاوی آگار اضافه می شود. پس از2 الی3 هفته انکوباسیون در شرایط نوری و دمایی مناسب، کلنی های پدیدارشده به صورت استریل به محیط مایع و استریل منتقل می گردند تا توده زیستی کافی ایجاد گردد. . (Bellinger, et al,1992)
1-6-4- جداسازی مستقیمدر این روش به کمک میکروپیپت یا فیلدوپلاتین سلولهای تکی و یا رشته های تشکیل شده ازریزجلبک هدف از خاستگاه طبیعی آن برداشت شده و بر سطح یک پلیت آگاردار انتقال می یابد. در یک روش مشابه، به کمک نوعی دستگاه اسپری کننده، نمونه برداشته شده از منبع اولیه به صورت قطرات بسیار ریز روی سطح پلیت اسپری می گردد. پس از انکوباسیون، تک کلونیهای پدیدآمده از سطح آگار برداشته شده و به محیط کشت مایع منتقل می گردند. (Bellinger, et al,1992)
1-6-5- تولید کشت خالصمرحله اصلی و مهم در غربالگری ایجاد یک کشت خالص است. به عبارت دیگر در این مرحله تلاش می شود نمونه مشخصی از ریزجلبک که فاقد هر نوع ارگانیسم دیگری از جمله باکتری، قارچ، پروتوزوا و غیره باشد، موردکشت قرارگیرد. از جمله روشهایی که به این منظور استفاده می شود می توان به موارد زیر اشاره کرد.
استفاده از جهت تابش نور: ریزجلبکها به دلیل تمایل بالایی که به نور دارند در معرض نور مناسب تجمع می یابند. البته ذکراین نکته نیز ضروری است که شدت بالای نور امکان ایجادآثار معکوسی نظیر دوری گزینی ریزجلبکها از نور را سبب می شود که در این صورت رشدی مشاهده نمی گردد. در صورت استفاده از روش تیمار نوری، در ظروفی کاملاً پوشیده و تاریک،منفذی باریک جهت تابش نور ایجادمی کنیم. در این صورت فقط دستهای از ریزجلبکها خصوصاً انواع تاژکدار به سمت منفذ نورانی حرکت می کنند و در حوالی آن تجمع مییابند که می توان آنها را به کمک یک پیپت از مناطق مذکور جمع آوری نمود. به دلیل افزایش تراکم سلولهای فتوسنتزکننده در آن مناطق، مراحل بعدی خالص سازی راحت تر و سریعترانجام خواهدشد . (Bellinger, et al,1992 )
1-6-5-1- شستشوی سلول: یکی از علل آلودگی، چسبیدن و اتصال سلولهای دیگر به ریزجلبک مورد نظراست. در این روش، پس از برداشت سلولهای ریزجلبک اولیه به کمک یک میکروپیپت آن را چندین بار به محیطهای مایع و استریل وارد میکنند. تکرار این عمل به محیط کشت تازه و کشیدن مجدد آن می تواند سایر میکروارگانیسمهای آلوده کننده را حذف کند. (Bellinger, et al, 1992)
1-6-5-2- رقیق سازی سریالی : این روش که بطور معمول جهت خالص سازی باکتریها بکارمی رود،براساس شانس و احتمال حضور یک میکروارگانیسم خاص در رقت های بسیار پایین پایه گذاری شده است. برای انجام آن، ابتدا محیط های مایع و استریلی که مخصوص رشد ریزجلبک هدف است فراهم می گردد. نمونه مورد نظر پس از طی مراحل اولیه آماده می شود و به اولین لوله حاوی محیط کشت مایع انتقال می یابد. حجم معینی (مثلاً 2 میلیلیتر) از لوله اول حاوی میکروارگانیسم به لوله بعدی افزوده می شود. پس از همزدن و مخلوط کردن، مجدداً همان حجم معین از لوله دوم به لوله سوم منتقل می گردد تا به آخرین لوله که بالاترین رقت از ارگانیسم هدف فراهم شده باشد این عمل تکرارمی شود. مقادیر مشخصی از مایع درون لوله ها به پلیتهای حاوی آگار و محیط کشت اختصاصی ریزجلبک منتقل می شود و فرصت و شرایط لازم جهت رشد آنها فراهم می گردد. در این صورت احتمال حضور میکروارگانیسم آلوده کننده کمتر خواهدبود. این عمل احتمال خلوص ریزجلبک منتخب را افزایش می دهد. . (Bellinger, et al ,1992)
1-6-5-3- سانتریفوژ شیب چگالی : در صورت ایجاد یک محدوده شیب چگالی به کمک ترکیباتی ویژه و با استفاده از یک سانتریفوژ، امکان جداسازی ریزجلبکها از نمونه وجود دارد. از آنجا که چگالی مربوط به سلولهای ریزجلبکی در مقایسه با باکتریها متفاوت است با استفاده از این تکنیک می توان ریزجلبکها را از باکتریها جدا نمود. در یکی از این روشها از ترکیب سیلیکاسل پرکول به جهت ایجاد شیب چگالی و متعاقب آن، جداسازی ریزجلبکها استفاده می شود.
1-6-5-4- تابش نور ماوراء بنفش: اغلب جلبکها در مقایسه با باکتریها مقاومت بیشتری در برابر تابش نورUV از خود نشان می دهند. بنابراین به دنبال تاباندن اشعه UVسپس شستشو، رقیق سازی نمونه و اسپری کردن بر سطح یک محیط انتخابی حاوی آگار احتمال بدست آوردن یک کشت خالص از ریزجلبک بالا می رود (. (Kuzmina, et al, 2004
1-6-5-5- صاف کردن: جلبکهای بزرگ و ریزجلبکهای رشته ای را می توان به کمک یک فیلتراسیون ساده از باکتریها جداسازی نمود. رشته های جداشده را می توان با استفاده از دستگاه سونیکاتور به رشته هایی با طول کمتر (3 تا 5سلول) تبدیل نمود و سپس نمونه های رقیق شده در پشت فیلتر را به محیط کشت مناسب منتقل کرد(. (Kuzmina, et al, 2004
1-6-5-6- استفاده از آنتی بیوتیکها: چندین نوع آنتی بیوتیک به طور مؤثر در حذف آلودگی باکتریایی از جلبکها مورد استفاده قرارگرفته اند. مثلاً محیط آگاردار حاوی ایمیپنم به میزان( 100 میکروگرم در میلی لیتر) جهت خالص سازی ریزجلبکهای یوکاریوتی و همچنین تک سلولی بکارمی رود.( نیستا نین به میزان 100 میکروگرم در میلی لیتر) و نیز سیکلوهگزیمید برای حذف آلودگیهای قارچی و خالص سازی انواع سیانوباکتریها بکارمی رود . (Kuzmina, et al, 2004)
1-6-6- شناسایی ریزجلبکهای جداشدهمرحله پس از غربالگری اولیه، جداسازی و خالص سازی ریزجلبکها از نمونه های محیطی، شناسایی آنها است. شناسایی اولیه شامل تهیه اسلاید و مشاهده میکروسکوپی می باشد. پس از تهیه اسلایدها مانند آنچه که در روشهای میکروبیولوژی انجام می گیرد از اضافه کردن گلیسیرین هنگام قراردادن لامل روی لام و روش مشاهده مستقیم نمونه توسط میکروسکوپ استفاده می شود. برای مشاهده غلاف اطراف سلولها می توان از روش رنگ آمیزی لوگل استفاده کرد. در صورتی که برای مشاهده میکروسکوپی ریزجلبکها لازم باشد از حرکت سریع آنها جلوگیری کنیم، میتوان از فرمالین 4 درصد یا محلول )فرمالین، اسیداستیک، الکل (جهت تثبیت یا بی تحرک سازی استفاده نمود. در مرحله مقدماتی شناسایی ریزجلبکها از ویژگیهای مورفولوژی یا ظاهری آنها استفاده می شود. منابع معتبر متعددی جهت بررسی کلیدهای شناسایی جلبکها وجود دارند که از میان آنها می توان به کتب بلینگر 2 اشاره کرد ( Bellinger, et al 1992).
1-6-6-1- شناسایی ریزجلبکها به کمک آنالیز مولکولی 18S rDNAاز آنجا که به دلیل تنوع بسیار زیاد گونه های ریزجلبکی ممکن است روشهای معمول مانند مشاهده میکروسکوپی و مطالعات مورفولوژی در شناسایی آنها کافی نباشد و از طرفی با توجه به پیشرفت روزافزون روشهای بیولوژی مولکولی و سرعت بالا و همچنین اطمینان و راحتی شناسایی آنها از طریق مقایسه ژنهای محافظت شده 3 در سطح جنس و گونه ریزجلبکها، رویکرد استفاده از آنالیزمولکولی 18S rDNA روشی مناسب خواهد بود. در دهه های اخیر روشهای آنالیز مولکولی در شناسایی میکروارگانیسمهای مختلف بر اساس بررسی توالی ژن کدکننده زیرواحدهای سازنده RNA های ریبوزومی گسترش قابل توجهی یافته است. ناحیه کدکننده ژن16 S rDNA باکتریها به شدت حفاظت شده است و می توان توالی ژن کدکننده این بخش از ژنوم باکتری را پس از تکثیر به کمک تکنیک PCR توالی یابی کرد . با واردکردن این توالی در بانکهای جهانی ژن میتوان ارگانیسم دارای آن توالی را شناسایی نمود. اخیراً همین روش در خصوص ریز جلبکهای یوکاریوتی با یافتن پرایمرهای مناسب جهت تکثیر ژن کدکننده18srDNA توسعه یافته است. برای این منظور ابتدا باید DNA ریزجلبک را استخراج نمود، ناحیه کدکننده ژن18SrDNA را با استفاده ازPCR تکثیرکرد و سپس توالی ژن را تعیین نمود.در مرحله نهایی با مقایسه این توالی در بانکهای جهانی ژنی، ریزجلبک مورد نظر با احتما ل بالایی شناسایی می شود. (Be– , et al,2005, Simon,etal,2000)
1-6-6-2- انجام عملیات BLAST جهت شناسایی سویه ریزجلبکبه منظور مقایسه میزان شباهت توالی ژن srDNA 18 حاصل از مراحل قبل با توالی ژن های موجود در بانک های جهانی ژن و شناسایی ارگانیسم مورد آزمایش عملیات BLAST انجام می گیرد. یکی از معتبرترین آنهاNCBI است به این منظور، با مراجعه به آدرس http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ وارد سایت شده و گزینه BLAST انتخاب می شود. با انتخاب گزینه Nucleotide BLAST و سپس واردکردن توالی مورد نظر و انتخاب کلیدBLAST فهرستی از ژن های مشابه با ژن هدف و نام ارگانیسمهای مربوطه مشاهده می گردد. در نهایت، توالی این ژن با توالیهای موجود در بانک ژن مقایسه و ارگانیسم هدف مورد شناسایی قرارمی گیرد.. DDBJ بانک ژنی دیگری است که توسط محققان ژاپنی طراحی شده و برای استفاده از آن می توان به سایت http://www.ddbj.nig.ac.jp مراجعه نمود. Doyle, et al, 1990 ) ).
1-7- تکنیک های استخراج از جلبک هاتکنیک های استخراج مرسوم همچون استخراج جامد- مایع، (SLE) ،Soxhlet ، یا استخراج مایع- مایع(LLE) با بکار بردن حجم های بالایی از حلال ها و زمان های استخراج طولانی مشخص شده اند. این تکنیک ها اغلب میزان اندکی از عصاره حاصل از ترکیبات زیستی را به دست می دهند و از قدرت انتخاب پذیری پایینی برخوردار هستند. به علاوه تکنیک های عصاره گیری مرسوم فرآیندهایی خودکار نیستند و بنابراین تکثیرپذیری آنها مورد شک است. استفاده از تکنیک های استخراج جدید همچون استخراج مایع supercritical(SFE)، استخراج مایع با تنظیم فشار،(PLE)، استخراج حلال تسریع کننده (ASE®)، استخراج با آب داغ با تنظیم فشاری (PHWE)، استخراج به کمک اولتراسوند(UAE)، استخراج به کمک مایکروویو(MAE)، در بین سایر تکنیک ها ممکن است یک جایگزین مناسب برای غلبه بر مشکلات استفاده از روش های استخراج رایج باشند. Ibañez et al. , 2011)).
رادیکال های آزاد و گونه های اکسیژن واکنشگر (ROS) ایجاد شده توسط متابولیسم میکروزومال ممکن است استرس اکسیداتیو را توسط تشکیل پراکسید هیدروژن یا آنیون های سوپر اکسید در انسان افزایش دهد. شواهد جمع آوری شده نشان می دهد که رادیکال های آزاد و گونه های اکسیژن واکنشگر می توانند مولکولهای زیستی مهمی همچون DNA ، پروتیین ها، لیپید ها را تحت تأثیر قرار دهد و بیماری های تخریبی مهمی همچون سرطان ، زخم های دستگاه گوارش، آلزایمر، آرتریت را ایجاد کند. اهمیت رژیم غذایی در جلوگیری از بروز برخی از بیماری ها به خوبی مشخص شده است . ترکیبات آنتی اکسیدانی طبیعی در تجارت مواد غذایی و مواد آرایشی به علت ظرفیت های کاهش رادیکال های آزاد وساطت شده با تخریب سلول ها و بافت ها در انسان بسیار قابل توجه است. بنابر این توجه ویژه ای به رژیم غذایی بر پایه گیاهی طبیعی به عنوان عوامل پیشگیری کننده معطوف است. به طور مرسوم منشأ این رژیم غذایی به وسیله استخراج رایج با حلال های طبیعی به دست آمده است. با این وجود تغییرات قابل توجهی در خواص فیزیکو شیمیایی عصاره ها می تواند عملکرد آنها را تحت تأثیر قرار دهد. بنابر این، این فرآیند های استخراج باید در شرایط و محیط مناسب انجام شود. استخراج دی اکسید کربن(SC-CO2) یک تکنولوژی پیشرفته است که مزیت های زیادی شامل اثرات زیست محیطی اندک به واسطه نداشتن هیچ حلال یا استخلاف مضر، فقدان سمیت، عدم خورندگی و جداسازی آسان از عصاره ها دارد. بنابراین این روش در حال حاضر به طور گسترده ای در صنعت دارویی و غذایی مورد استفاده قرار می گیرد. در سال های اخیر ادعا شده است که فعالیت آنتی اکسیدان های طبیعی گیاهی با جذب میوه های تازه ، سبزیجات و دمنوش های طبیعی غنی از آنتی اکسیدان های طبیعی اثرات سودمندی در به تعویق انداختن پیری، پیشگیری از بیماری های قلبی عروقی ،التهاب، بیماری های سیستم عصبی همچنین سرطان ها دارند. علاوه بر این به آنتی اکسیدان های طبیعی گرفته شده از منابع دریایی همچون میکرو جلبک ها بیشر توجه شده است. لیپید های باز یافت شده از ریز جلبک ها با روش های متعددی استخراج می شوند. به دلیل ماهیت ریز جلبک ها روش های استخراج معمول(برای مثال روش استخراج برای غذا) کاربردی نیستند.اول اینکه ریز جلبک ها تک سلولی هستند و توسط دیواره سلولی منحصر به فردی احاطه شده اند. بعلاوه اغلب این جلبک ها حاوی رده های لیپیدی “غیر معمول” و اسید های چرب متفاوتی نسبت به رده های بالاتر گیاهی و جانوری هستند. به این دلایل لازم است تا نگاه عمیقی در رابطه با روشهای استخراج لیپیدها از ریز جلبک ها وجود داشته باشد. (Ryckebosch et al ,2011)
به منظور استخراج این لیپیدها حلال های مختلفی به کار رفته است اما استفاده از بیشتر حلال های آلی کاربردی در صنایع به علت سمیت آنها یا کاهش لایه ازن قدغن شده است. به ویژه ترکیبات آلی فرار (VOCs) که عمدتا از کربن و هیدروژن تشکیل شده اند می توانند به آسانی به شکل گازی در اتمسفر به تروپوسفر برسند و بنابراین باعث کاهش لایه ازن شوند. از طرف دیگر (VOCs), حتی در مقادیر ناچیز هم بر روی سلامتی اثراتی نامطلوب دارند. کاربردسیالات فوق بحرانی به عنوان حلال های استخراج برای جایگزینی به ویژه در زمینه تولید سوخت های زیستی برای بهبود اثرات زیست محیطی راهی امیدوار کننده به نظر می رسد. سیال فوق بحرانی مورد استفاده دی اکسید کربن است این سیال فراوان، غیر قابل احتراق، کند از لحاظ شیمیایی، غیر سمی برای اپراتورها ارزان و دارای نقطه بحرانی در دسترس (31ċ/7.4) مگا پاسکال است. دی اکسید کربن فوق بحرانی می تواند اسیدهای چرب آلی و غیر قطبی را حل و استخراج کند. دستکاری درجه حرارت و فشار بالا نقاط بحرانی خواص دی اکسید کربن فوق بحرانی را تحت تأثیر قرار می دهد و توانایی دی اکسید کربن فوق بحرانی برای نفوذ و استخراج مولکولهای هدف را افزایش می دهد. روش های رایج استفاده شده برای جداسازی جزء به جزء اسیدهای چرب چندگانه غیر اشباع مختلف اشکالاتی عمده دارد. استخراج با حلال، احتمالاهمراه با رزین های کروماتوگرافی HPLC شامل حضور بقایای حلال درفرآورده نهایی است. کارهای تحقیقی متعددی برای مطالعه امکان استخراج لیپید با دی اکسید کربن فوق بحرانی SCCO2 انجام شده است. برای بهبود بهره وری استخراج چربی، پیش تیمار حرارتی می تواند مورد استفاده قرار گیرد. مایکروویو هم به عنوان راهی جایگزین توانایی نفوذ عمقی به ساختار دیواره سلول را دارد. پرتودهی مایکروویو برای استخراج روغن از توده های زیستی مورد استفاده قرار گرفته است. گرمایش سریع منجر به اطمینان از درجه حـرارت داخلی بالا می شود و شیب فشار عمل کننده روی دیواره سلولی ممکن است نرخ انتقال توده را بدون القاء تخریب حرارتی لیپید ها افزایش دهد. Djoy et al.,2011)).
1-7-1- استخراج سیال فوق بحرانیHannay وHogarth اولین بار استخراج سیال فوق بحرانی را به عنوان یک روش استخراج جایگزین در سال 1879 معرفی کردند. با این وجود تا سال 1960 که این روش به طور کامل مورد بررسی قرار گرفت از روش های متعارفی همچون SLEوLLE حاوی مقادیر زیادی از مواد خطرناک همچون حلال های کلرییدی استفاده می کردند.اصول این روش بر مبنای استفاده از حلال هایی در دما و فشار بالای نقاط بحرانیشان است. ( Hosikian et al. 2010 )این تکنیک قبلا برای استخراج دامنه گسترده ای از مواد جالب مرتبط با غذا از جمله جلبک ها بکار رفته است. یکی از مهمترین ویژگی های این روش استفاده کمتر از حلال های آلی سمی است. دی اکسید کربن معمول ترین حلال آلی مورد استفاده برای استخراج ترکیبات فعال زیستی از منابع طبیعی در این روش است. در حقیقت دی اکسید کربن یک سری ویژگی های جالب توجه برای استخراج ترکیبات زیستی فعال دارد، هزینه مناسب ، شرایط بحرانی (73.8و(30.9ċ آن را به راحتی در دسترس قرار می دهند و حلالی است که در صنایع غذایی به عنوان ترکیبی سازگار و سالم برای محیط زیست شناخته شده است. مشکل عمده دی اکسید کربن فوق بحرانی قطبیت اندک آن است، مشکلی که می تواند با به کارگیری ترکیبات قطبی یا حلال های همراه برای تغییر قطبیت سیال فوق بحرانی و افزایش قدرت حل کنندگی آن رفع شود. حلا های دیگری برای این روش پیشنهاد شده اند که شامل پروپان، بوتان، دی متیل اتر است. اما هیچ یک از این حلال ها اصول شیمی سبز ، مهندسی سبز همچنین دی اکسید کربن را اجرا نمی کنند. ( (Herrero et al. 2006 . مزیت کاربرد دی اکسید کربن برای شرایط فوق بحرانی استخراج ترکیبات زیستی از منابع دریایی شامل قدرت انتشار بالای آن و تسهیل نسبی در تغییر دما و فشار کاربردی آن است. به طوری که قدرت و تراکم حلال به آسانی می تواند تعدیل شود. مزیت دیگر این روش این است که در زمان استفاده از دی اکسید کربن می توان عصاره عاری از حلال را به دست آورد. زمانی که روند استخراج به اتمام رسید فشردگی سیستم دی اکسید کربن را از لیپید به گاز تبدیل می کند که بازیابی و احیا استخراج را آسانتر می سازد. این ویژگی ها مسؤول گسترش استفاده از دی اکسید کربن فوق بحرانی برای استخراج ترکیبات زیستی فعال است (. (Björklund et al. 2005پارامترهای زیادی در این روش استخراج تر کیبا ت فعال زیستی از منابع دریایی دخیل هستند و بایستی به طور دقیق اثر دما، فشار، درصد و نوع تعدیل گر اضافه شده ، میزان استخراج شده و اندازه ذرات آن را کنترل کرد. اولین پارامتر مربوط به حلالیت ترکیبات هدف سیال فوق بحرانی هستند زیرا تغییر دما و فشار استخراج تأثیر زیادی روی ویژگی های حلال همچون تراکم آن خواهند داشت. اگرچه حلال های فوق بحرانی خاصیت نفوذپذیری ماورای ماتریکس سیال خود دارند یک کاهش در اندازه ذرات نمونه به طور کلی باعث افزایش در میزان عصاره حاصل می شود. این افزاش نتیجه عمدتا به واسطه افزایش تماس سطحی بین نمونه و حلال است که منجر به افزایش حجم انتقالی می شود. در برخی کاربردها استفاده از عوامل پراکنشی همچون ذرات شن، دانه های شیشه ای ، دیاتومه یا ماتریکس آبی برای جذب آب از نمونه می تواند مفید باشد. یک استخراج کننده سیال فوق بحرانی اصولی از یک تانک فاز متحرک، معمولا دی اکسید کربن، یک پمپ فشرده کننده گاز، یک آون محتوی ظرف استخراج، یک محفظه محدود کننده برای حفظ فشار درون سیستم، و یک ظرف برای به دام انداختن تشکیل شده است. زمانی که سیال فوق بحرانی محتوی ماده حل شده خالی از طریق یک حلال یا بر روی ماده ای جامد یا مایع به درون یک ویال با افت فشار مواجه می شود، عصاره به دام انداخته می شود. عصاره گیری به روش دینامیک، استاتیک یا ترکیبی از هر دو روش انجام می گیرد. در استخراج دینامیک، سیال فوق بحرانی به طور مداوم از میان نمونه ها در ظرف استخراج جریان پیدا می کند و از محفظه محدود کننده به ظرف دام انداز تخلیه می شود. در روش استاتیک، سیال فوق بحرانی قبل از خارج شدن از محفظه محدود کننده به سمت ظرف استخراج برای مدت زمانی در حلقه ای محتوی ظرف استخراج گردش می کند. در روش ترکیبی استخراج انجام شده با روش استاتیک برای یک دوره زمانی مشخص با یک استخراج دینامیک دنبال می شود. همچنین در مقایسه با دیگر روش های استخراج متداول در این روش یک عصاره شفا ف را می توان به دست آورد. با برخی اصلاحات مهندسی ساده همچون چندین ظرف استخراج متصل به هم که بتوان در هر زمان از روند استخراج آن را خاموش کرد می توان به پردازش و بازده اقتصادی بهتری دست یافت. برای مثال در انتهای دوره استخراج(با یک ظرف) جریان دی اکسید کربن می تواند وارد ظرف دیگری شود(که قبلا با ماده استخراجی پر شده بود) در حالی که با وجود ادامه روند استخراج در ظرف دوم، ظرف اول (ماتریکس آن تمام شده) می تواند تخلیه شود و دوباره با نمونه تازه پر شود. (11 Ibañez et al.,20).
علیرغم توانایی بالقوه این روش بازده آن به نوع ترکیب استخراجی از جلبک بستگی دارد. با در نظر گرفتن قطبیت پایین دی اکسید کربن فوق بحرانی، این روش برای استخراج ترکیباتی با قطبیت پایین مناسب تر است. ریز جلبک ها همچنین ترکیبات فرار دفاعی تولید می کنند، معمول است که برخی ریز جلبک ها نیچ(کنام) اکولوژیکی خود را با باکتری ها و دیگر میکروارگانیسم ها به اشتراک می گذارند، بنابراین ترکیبات دفاعی ترشحی توسط ریز جلبک ها دارای فعالیت ضد قارچی، ضد باکتریایی و اغلب فعالیت های ضد پروتوزووا است. برخی مطالعات روی ریزجلبک های سبز نشان داده اند که عصاره این ریز جلبک های جدا شده با روش بالا فعالیت ضد میکروبی بالقوه ای بر روی پاتوژن هایی همچون ایشیریشیاکلی، استافیلوکوک، کاندیدا آلبیکانس و آسپرژیلوس نیجـر دارند.. (Mendiola et al. 2008)
این امر احتمالا به واسطه حضور ترکیبات ایندولیک، ترکیبات مربوط به متابولیسم کاروتن ها و نئو فیتادین در عصاره این ریز جلبک ها است. علاوه بر ترکیبات فرار، لیپیدها ی فعال زیستی هم با این روش استخراج می شوند. در بین ترکیبات *onifi able اسیدهای چرب ضروری را به آسانی می توان با این روش استخراج کرد. به علاوه از این روش برای استخراج کاروتنوییدها، فلاوونوییدها(آنتی اکسیدان) از ریز جلبک Chlorella vulgaris استفاده شده است.. (Cheung 1999 )

تصویر 1-1- شکل شماتیک برای استخراج سیال فوق بحرانی
1-7-2- استخراج مایع تحت فشار
این روش به عنوان استخراج تحت فشار مایع، استخراج حلال شتاب گرفته ، استخراج حلال با فشار بالا، شناخته شده است. این تکنیک برای اولین بار در سال 1996 توصیف شد.(Nieto et al. 2010) این روش فشار کاربردی اجازه استفاده از مایعات در درجه حرارت بالاتر نسبت به نقطه جوش نرمالشان را می دهد. در بین این روش ها استخراج با حلال شتاب گرفته (که در فشار و دمای بالا عمل می کند)، استخراج با آب داغ تحت فشار و استخراج با سیالیت افزایش یافته مطمئن ترین روش ها در استخراج ترکیبت زیستی فعال از مواد خام هستند. کاربرد ترکیبی فشار و دمای بالا فرایند استخراج را تسریع می کند و نیاز به مقادیر کمتری از حلال ها دارد. افزایش دمای استخراج می تواند با افزایش حلالیت پذیری و نرخ انتقال توده حلالیت پذیری بالاتری فراهم کند. علاوه بر این دمای بالا ویسکوزیته و کشش سطحی حلال ها را کاهش می دهد بنابراین سرعت استخراج افزایش می یابد. از سوی دیگر این روش عمدتا به واسطه میزان اندک مصرف حلال های آلی به عنوان تکنیک استخراج سبز شناخته شده است که با اصول مهندسی و شیمی سبزسازگاری دارد. Herrero et al. 2006 ).. (Mendiola et al. 2007,به طور کلی وسایل مورد نیاز برای این روش ساده است در اصل این وسایل شامل یک مخزن حلال همراه با یک پمپ فشار قوی برای وارد کردن حلال به درون سیستم، یک آون و یک محفظه یا دریچه برای حفظ فشار درون سیستم است. عصاره های جمع آوری شده در ویال در انتهای سیستم استخراج قرار دارند. علاوه بر این سیستم می تواند با یک وسیله خنک کننده برای خنک کردن سریع استخراج حاصل تجهیز شود. پس از گرم کردن اولیه، ظرف استخراج با حلال پر شده و و در دما و فشار ثابت برای زمان مشخصی قرار داده می شود. حلال که محتوی آنالیت های استخراجی است در ویال جمع آوری می شود و با گاز نیتروژن پر وتصفیه می شود. کل زمان استخراج به طور نرمال 45-15 دقیقه می باشد اگرچه گاهی اوقات لازم است که زمان استخراج طولانی تر شود. این تکنیک می تواند به هر دو روش استاتیک و دینامیک انجام شود روش استاتیک کاربرد بیشتری دارد احتمالا روش دینامیک می تواند با اجازه دادن به افزایش سطح تماس بین ماتریکس و حلال تازه سرعت عصاره گیری را افزایش دهد که عمدتا با وسایل آزمایشگاهی انجام می شود. (Nieto et al. 2010) در مقایسه با روش استخراج با سیالیت فوق بحرانی این روش چند کاربردی است بنابراین انعطاف پذیری بیشتری برای استخراج ترکیبات فعال زیستی دارد. حلال انتخاب شده در این روش وابسته به قطبیت ترکیبات هدف است.اما با این وجود این روش در مقایسه استخراج سیال فوق بحرانی انتخاب پذیری کمتری دارد. این روش در استخراج کاروتنوییدها از برخی ریز جلبک ها کاربرد داشته است. انواع متعددی از اسیدهای چرب و ترکیبات فرار با فعالیت ضد میکروبی در استخراج های متعدد از جلبک ها و سیانوباکتری ها شناسایی شده اند استخراج ترکیبات فعال از ماکرو جلبک ها بیشترین کاربرد این روش بوده است. با استفاده از حلال هایی همچون آب، اتانول و هگزان در دمای بالا بیشترین ترکیبات به دست آمده کاروتنوییدها و ترکیباتی با خواص ضد میکروبی بودند.به نظر می رسد فعالیت آنتی میکروبی مربوط به حضور اسیدهای چربی همچون لینولیک اسید،α- لینولیک و ترکیبات فراری همچون فیتول یا فورانون باشد. بسته به حلال انتخاب شده این روش می توان یک تکنیک ایده آل برای جداسازی ترکیبات فعال زیستی فنولیک باشد.استخراج از انواع جلبک های دریایی و آب شیرین با این روش مورد مطالعه قرار گرفته است. در این استخراج می توان از جلبک ها بیشترین ترکیبات آنتی اکسیدانی را به دست آورد. این تکنیک می تواند برای استخراج سریع ترکیبات فعال زیستی فنولی از سیانوباکتری های مختلف یا انواع جلبک ها سودمند واقع شود. .(Breithaupt 2004,Herrero et al. 2006)

تصویر1-2- شکل شماتیک برای استخراج با مایع تحت فشار.
1-7-3- استخراج با آب داغ تحت فشار(PHWE)این تکنیک همچنین با عنوان استخراج آب با قطبیت پایین تحت فشار، استخراج با آب فوق داغ شناخته می شود. آب از لحاظ چند کاربردی بودن و اثر محیطی مزیت های زیادی دارد و می تواند در فرایندهای استخراج برای جداسازی اجزا عملکردی از مواد خام گیاهی کاربرد داشته باشد. این تکنیک بر اساس استفاده از آب در دمای بالاتر از نقطه جوش اتمسفری آن استوار شده است. به علاوه ویسکوزیته و کشش سطحی با افزایش دما به مراتب کاهش می یابند در حالی که قابلت انتشار آن افزایش می یابد که هر دو این موارد منجر به افزایش سرعت و کارایی استخراج می شود. همچنین پارامتر حلالیت آب با دما تغییر می کند. آب همچنین یکی از سبز ترین حلال هاست که کاربرد آن با قوانین شیمی و مهندسی سبز همخوانی دارد. شرایط انجام این تکنیک عمدتا وابسته به ترکیبات و هدف کاربرد است. در این مفهوم آب داغ تحت فشار در هر دو شرایط فوق و زیر بحرانی کاربردی است. برای مثال شرایط فوق بحرانی یا نزدیک بحرانی می تواند برای اکسیداسیون آب فوق بحرانی، هیدرولیز، انتقال مولکولی همچون تبدیل توده زیستی استفاده شود در حالی که در شرایط زیر بحرانی استخراج ترکیبات سودمند برای سلامتی انجام می شود. .(Herrero et al. 2006 ) وسایل مورد نیاز برای این تکنیک تقریبا مشابه روش استخراج مایع تحت فشار است اما با توجه به حالت استاتیک و دینامیک بودن و کاربرد تجاری یا خانگی این روش استخراج متفاوت است. روش استاتیک از یک فرایند گروهی با یک یا چندین سیکل استخراج با جایگزینی حلال در مابین سیکل ها انجام می شود. در روش دینامیک حلال استخراج به طور ممتد در یک سرعت جریان انتخابی از طریق ظرف استخراج حاوی نمونه پمپ می شود. از این رو این روش نیازمند اندکی پیشرفت در فشار بالا یا وجود یک پمپ HPLC برای کنترل سرعت جریان آب همچنین محفظه محدود کننده فشار یا دریچه میکرومتر بجای دریچه باز/بسته استاتیک است. مزیت عمده سیستم های خانگی در مقایسه با ساختار تجاری دستگاه احتمال عملکرد هر دو حالت استاتیک و دینامیک استخراج با محدودیت های عملکردی کمتر دستگاه، محدوده دمایی عملکرد و امکان انجام فرآیندهای متعدد(واکنش پذیری، خشک کردن و عصاره گیری) با تغییر حالت پایه ای دستگاه است. همان طور که در روش استخراج با سیال فوق بحرانی گفته شد حلال ها بالاتر از نقطه جوش خود روند سریعتری از استخراج را فراهم می کنند به علاوه استفاده از آب به جای حلال های آلی روند استخراج را سبز تر انجام می دهند. اگرچه این تکنیک امید بخش است اما برای استخراج از منابع دریایی با این تحقیق نیاز به بررسی بیشتری است. استخراج و شناسایی ترکیباتی با خواص آنتی اکسیدانی و فعالیت ضد میکروبی از برخی ریزجلبک ها با استفاده از این تکنیک انجام شده است. شواهد اخیر نشان داده است که این تکنیک در دمای بالا ممکن است ترکیب فعال زیستی جدیدی (آنتی اکسیدان) ایجاد کند همان طور که در ریزجلبک Haematococcus pluvialis دیده شده است. نمونه های طبیعی مختلفی همچون انواع ماکرو جلبک ها و ریز جلبک ها از جمله (( Chlorella vulgaris با این روش مطالعه شده اند. ( King 2006 , Turner and Ibañez , 2011 )
1-7-4- استخراج با کمک اولترا سوند (UAE) و استخراج با کمک مایکروویو (MAE)در روش UAE از حفره های صوتی برای تخریب دیواره سلولی، کاهش اندازه ذره، افزایش سطح تماس بین حلال و ترکیبات هدف استفاده می شود.روش MAE از تابش مایکروویو استفاده می شودکه باعث حرکت مولکول های قطبی و چرخش دو قطبی برای گرم کردن حلال ها و برای پیشبرد انتقال ترکیبات هدف از ماتریس نمونه در حلال می شود.هر دو روش به واسطه احتمال استفاده از چندین حلال با قطبیت های مختلف چند کاربردی هستند در واقع هر دو روش می توانند استخراج و واکنش را در زمان یکسانی با هم همراه کنند. علاوه بر این هر دو تکنیک اجازه استخراج سریع را می دهند که یک نقطه کلیدی برای ممانعت از تخریب ترکیبات مورد نظر می باشد. هر دو تکنیک سریع هستند ، مقادیر اندکی از حلال را بکار می برند و از لحاظ هزینه هم کارآمد می باشند. انواع متعددی از ریز جلبک ها عمدتا برای استخراج کاروتنوییدها، رنگدانه ها با این روش تیمار شده اند. در مقایسه با روش های سنتی در روش مایکروویو یک همگن سازی از لحاظ تنظیم دمای محیطی وجود دارد به طوری که لازم نیست هیچ انتقال گرمایی برای گرم کردن بخش های مرکزی صورت بگیرد.همچنین مشاهده شده که روند استخراج هیچ تاثیری بر روی یکپارچگی و شکل سلول ندارد. اخیرا احیا روغن از انواع مختلف ریز جلبک ها با تکنیک اولتراسوند مطالعه شده است. یکی از مناسب ترین ریز جلبک ها برای تولید روغن در مقیاس وسیع با این روش C. vulgaris است. .(Ying et al. 2011 Ibañez , 2011)

این نوشته در مقالات ارسال شده است. افزودن پیوند یکتا به علاقه‌مندی‌ها.

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *