کشت بافت ارقام استاندارد و مينياتور ميخک و بهينه سازي شرايط انتقال ژن توسط اگروباکتريوم به آن ها

دانشکده کشاورزي
پاياننامه کارشناسي ارشد رشته‌ علوم باغباني
کشت بافت ارقام استاندارد و مينياتور ميخک و بهينه سازي شرايط انتقال ژن توسط اگروباکتريوم به آن ها
توسط:
محمد ايراني پور
استاد راهنما:
دکتر حسن صالحي

اسفند ماه 1388

72644053975
اظهارنامه
اينجانب محمد ايراني پور دانشجوي رشته ي مهندسي كشاورزي گرايش علوم باغباني دانشكده كشاورزي اظهار مي كنم كه اين پايان نامه حاصل پژوهش خودم بوده و در جاهايي كه از منابع ديگران استفاده كرده ام، نشاني دقيق و مشخصات آن را نوشته ام. همچنين اظهار مي كنم كه اين تحقيق و موضوع پايان نامه ام تكراري نيست و تعهد مي نمايم كه بدون مجوز دانشگاه دستاوردهاي آن را منتشر ننموده و يا در اختيار غير قرار ندهم. كليه حقوق اين اثر مطابق آيين نامه مالكيت فكري و معنوي متعلق به دانشگاه شيراز است.
نام و نام خانوادگي: محمد ايراني پور
تاريخ و امضا: 24/12/88

به نام خدا
کشت بافت ارقام استاندارد و مينياتور ميخک و بهينه سازي شرايط انتقال ژن توسط اگروباکتريوم به آن ها
به کوشش
محمد ايراني پور
پايان نامه
ارائه شده به تحصيلات تكميلي دانشگاه به عنوان بخشي از
فعاليت هاي تحصيلي لازم براي اخذ درجه‌ كارشناسي ارشد
در رشته‌:
علوم باغباني (گیاهان زینتی)
از دانشگاه شيراز
شيراز، ايران

اسفند ماه 1388

تقديم به:
روح آسماني مادر بزرگم
آن كه نامش افتخار است و يادش انگيزه
و پدر و مادر عزيزم
به پاس عاطفه سرشار و گرماي اميد بخش وجودشان كه در اين سردترين روزگاران بهترين پشتيبان است
برادران و خواهران عزيزم كه وجودشان باعث دلگرمي من است
و
اسوه علم و اخلاق
استاد راهنماي مهربانم

سپاسگزاری
پرسيد از قلم كه كدامين كلام نغز در مجمع حروف الفبا سر آمد است
فوراً به روي صفحه كاغذ دويد و گفت بعد از خدا محمد و آل محمد است
سپاس يكتا پروردگار را كه فرصتي دست داد تا با اجرا، تدوين و نگارش اين پايان نامه گامي ناچيز در اعتلاي اين رشته برداريم. برخود واجب مي دانم مراتب سپاس و قدرداني خودم را از تمام كساني كه در مراحل مختلف اين پژوهش مرا ياري نمودند اعلام نمايم. از استاد فرزانه، دانشمند و معلم اخلاق، جناب آقاي دكتر حسن صالحي كه زحمت راهنمايي اين پايان نامه را بر عهده داشته و راهنمايي هاي ارزنده ايشان همواره راهگشا و مشوق اينجانب بوده و مي باشد صادقانه قدر داني و تشكر مي نمايم و از خداوند منان توفيق روزافزون ايشان را مسئلت دارم. از اساتيد علم و اخلاق جناب آقاي دكتر مرتضي خوشخوي و جناب آقاي دكتر علي نيازي كه مشاوره اين پژوهش را بر عهده داشتند، به خاطر راهنمايي هاي فراوان علمي و ارزنده اي كه در انجام اين تحقيق مبذول داشتند، نهايت امتنان و سپاس را دارم. سپاس بي پايان خود را به اساتيد محترم بخش علوم باغباني كه افتخار شاگردي ايشان را داشته ام تقديم مي دارم. از كارشناسان و كاركنان بخش علوم باغباني به ويژه جناب آقاي مهندس فرهاد نيكبخت به خاطر همكاري با اينجانب در طي اين پژوهش قدرداني مي نمايم. مايلم مراتب سپاس خود را به دكتر همايون فرهمند، مهندس احمد طهماسبي، مهندس مهدي گودرزي، مهندس محسن اكبري، مهندس فرزاد نظري، مهندس محمدرضا رضايي، مهندس محمدرضا صالحي، مهندس غلامعلي اميدي، مهندس احسان ولي الهي و مهندس مصطفي خوشحال سرمست به دليل مساعدت و همكاري ارزشمندشان تقديم دارم. لازم مي دانم مراتب امتنان خويش را نسبت به همكلاسي هاي خوبم، جناب آقاي سهيل كريمي، الياس امري، صدر اله رمضاني و سركار خانم نارسيس زرشناس حقيقي به پاس همه ي خوبي هايشان ابراز دارم.
محمد ايراني پور
اسفند 1388
چكيده
کشت بافت ارقام استاندارد و مينياتور ميخک و بهينه سازي شرايط انتقال ژن توسط اگروباکتريوم به آن ها
به کوشش
محمد ايراني پور
میخک یکی از محبوب ترین، اقتصادی ترین و مهم ترین گل های بریدنی به سبب پیوسته گلدهی و رقم های چند رنگ و منحصر به فرد می باشد. محدودیت های موجود در روش های بهنژادی سنتی (تلاقی و گزینش) و داشتن ویژگی های هتروزیگوسیتی بالا در این گیاه سبب شده است که کاربرد فنون جدید یاخته ای – مولکولی برای بهبود ویژگی های اقتصادی این گیاه ضرورت پیدا کند. اين پژوهش به منظور بررسي ريزافزايي ارقام استاندارد ’ ‘Rendz-Vousو مینیاتور’Panamera‘ توسط اندام زایی مستقیم و رویان زایی بدنی، تعیین غلظت بهینه ماده گزینشگر کانامیسین و بهينه سازي شرايط انتقال ژن توسط اگروباکتریوم به آن ها انجام شد. بدین منظور آزمایشی به صورت فاکتوریل در قالب طرح به طور کامل تصادفی با 3 تکرار اجرا شد. در این پژوهش، از قطعه های برگ گیاهان رشد یافته در گلخانه با سن 6 تا 8 هفته و پینه برای تهیه ریزنمونه استفاده گردید. انتقال ژن gus به میخک توسط سویه LBA 4404 باکتری Agrobacterium tumefaciens دارای پلاسمید pBI121 بيان كننده ژن بتاگلوكورونيداز انجام شد. نتایج اندام زایی مستقیم نشان داد که میانگین تعداد شاخساره های نابجا برای هر دو رقم با افزایش غلظت BA به 9/0 میلی گرم در لیتر افزایش می یابد در صورتی که با NAA بیشترین تعداد شاخساره های نابجا در غلظت 3/0 میلی گرم در لیتر به دست آمده و با افزایش غلظت آن کاهش می یابد. ارزیابی تأثیر شرایط تاریکی و روشنایی بر باززایی ارقام توسط رویان زایی بدنی در مدت زمان های 30 و 60 روز نشان داد که در شرایط تاریکی مقدار پینه به دست آمده برای هر دو رقم به طور معنی داری بیش از شرایط روشنایی می باشد. نتايج تشکيل پينه و شاخساره نشان داد که رقم ’Panamera‘ بيش از رقم ’Rendz-Vous‘ به کاناميسين مقاوم است. به نظر مي رسد آلودگي باکتريايي تشکيل پينه و شاخساره را به عقب مي اندازد. بدون آلودگي باکتريايي تشکيل شاخساره در غلظت 50 ميلي گرم در ليتر کاناميسين براي رقم ’Rendz-Vous‘ به طور کامل متوقف شد در حالي که براي رقم ’Panamera‘ اين اتفاق در غلظت 100 ميلي گرم در ليتر کاناميسين صورت گرفت. در بهینه سازی انتقال ژن با اگروباکتریوم تأثیر غلظت باکتری، مدت زمان تلقیح ریزنمونه ها با باکتری و مدت زمان هم کشتی بر کارایی انتقال ژن مورد ارزیابی قرار گرفت. آزمون شیمیایی- بافتی و تجزیه PCR پیوستن ژن بتاگلوکورونیداز در شاخساره های تراریخت باززایی شده را اثبات نمود. چگالی نوری 5/0، مدت زمان تلقیح ریزنمونه ها با باکتری به مدت 20 دقیقه و هم کشتی به مدت 3 روز سبب افزایش درصد شاخساره های تراریخت گردید. در این پژوهش رقم استاندارد ’Rendz-Vous‘ نسبت به رقم مینیاتور ’Panamera‘ کارایی انتقال ژن بالاتری نشان داد. اختلاف بین دو رقم در میزان باززایی و کارایی تراریزش به دلیل اندازه کوچکتر ریزنمونه های برگ در رقم مینیاتور ’Panamera‘ قابل توجیه است. گیاهک های باززایی شده از اندام زایی مستقیم، رویان زایی بدنی و تراریزش با اگروباکتریوم در آمیخته پرلایت و ورمیکولیت در شرایط رطوبت نسبی %95 نگهداری و سپس به گلخانه منتقل شدند. این اولین گزارش انتقال ژن به میخک در ایران می باشد.

فهرست مطالب
عنوان صفحه
فصل اول: TOC o “1-1” h z t “Heading 2,1,Heading 3,1” مقدمه PAGEREF _Toc355911420 h 21-1- منشاء PAGEREF _Toc355911421 h 31-2- اصطلاح‌شناسي PAGEREF _Toc355911422 h 41-3- انواع ميخك PAGEREF _Toc355911423 h 4١-4- گياه‌شناسي و ريخت‌شناسي ميخك PAGEREF _Toc355911424 h 5١-5- روش‌هاي افزايش ميخك PAGEREF _Toc355911425 h 71-6- اهميت و اهداف پژوهش PAGEREF _Toc355911426 h 7فصل دوم: مروري بر پژوهش هاي پيشين PAGEREF _Toc355911427 h 102-1- ريزافزايي و کشت بافت ميخک PAGEREF _Toc355911428 h 102-1-1- گزينش ريزنمونه و گندزدايي سطحي آن PAGEREF _Toc355911429 h 102-1-2- ريخت زايي و باززايي PAGEREF _Toc355911430 h 122-1-3- رويان زايي بدني PAGEREF _Toc355911431 h 132-1-3-1- تنظيم کننده هاي رشد PAGEREF _Toc355911432 h 142-1-3-2- محيط پينه زايي PAGEREF _Toc355911433 h 162-1-3-3- محيط ريشه زايي PAGEREF _Toc355911434 h 172-1-3-4- سن مواد گياهي و شرايط كاشت PAGEREF _Toc355911435 h 182-1-4- مسيرهاي رويان زايي بدني PAGEREF _Toc355911436 h 192-2- انتقال ژن توسط اگروباكتريوم PAGEREF _Toc355911437 h 192-2-1- اساس ايجاد گال و پلاسميد Ti PAGEREF _Toc355911438 h 202-2-2- انتقال T- DNA PAGEREF _Toc355911439 h 202-2-3- عوامل مؤثر بر انتقال توسط اگروباكتريوم PAGEREF _Toc355911440 h 222-2-3-1- نژادگان (ژنوتيپ) PAGEREF _Toc355911441 h 222-2-3-1-1- ريزنمونه هاي شروع كننده PAGEREF _Toc355911442 h 222-2-3-1-2- سويه باكتري PAGEREF _Toc355911443 h 242-2-3-1-3- چگالي نوري PAGEREF _Toc355911444 h 252-2-3-1-4- انگيزاننده هاي ژن هاي بيماري زا PAGEREF _Toc355911445 h 262-2-3-1-5- مدت زمان هم كشتي PAGEREF _Toc355911446 h 272-2-3-1-6- گزینش با کانامیسین PAGEREF _Toc355911447 h 28فصل سوم: مواد و روش‌ها PAGEREF _Toc355911448 h 303-1- كشت بافت PAGEREF _Toc355911449 h 303-١-1- مواد گياهي PAGEREF _Toc355911450 h 303-١-2- قسمت‌هاي گياهي مورد استفاده در كشت بافت PAGEREF _Toc355911451 h 303-١-٣- گندزدايي ريزنمونه‌ها و وسايل PAGEREF _Toc355911452 h 313-١-4- آماده‌سازي ريزنمونه‌ها برای استقرار PAGEREF _Toc355911453 h 323-١-5- محيط كشت PAGEREF _Toc355911454 h 323-2- انتقال توسط اگروباکتریوم PAGEREF _Toc355911455 h 343-2-1- مواد PAGEREF _Toc355911456 h 343-2-1-1- بافر STET PAGEREF _Toc355911457 h 343-2-1-2- بافر الكتروفورز PAGEREF _Toc355911458 h 343-2-1-3- بافر CTAB PAGEREF _Toc355911459 h 353-2-1-4- بافر TE PAGEREF _Toc355911460 h 353-2-1- 5- بافر سنجش GUS PAGEREF _Toc355911461 h 353-2-1-6- بافر بارگذاری PAGEREF _Toc355911462 h 353-2-1-7- محلول ذخيره آنتي بيوتيك كاناميسين PAGEREF _Toc355911463 h 363-2-1-8- محلول ذخيره آنتي بيوتيك ريفامپيسين PAGEREF _Toc355911464 h 363-2-1-9- محلول ذخیره آنتی بیوتیک سفاتاکسیم PAGEREF _Toc355911465 h 363-2-1-10- محلول ذخیره استوسیرینگون PAGEREF _Toc355911466 h 363-2-1-11- محلول ذخیره نفتالن استیک اسید PAGEREF _Toc355911467 h 373-2-1-12- محلول ذخیره بنزیل آدنین PAGEREF _Toc355911468 h 373-2-1-13- محيط كشت LB (Luria-Bertani) PAGEREF _Toc355911469 h 373-2-1-14- سويه A. tumefaciens PAGEREF _Toc355911470 h 373-3- روش ها PAGEREF _Toc355911471 h 383-3-1- تهیه ریزنمونه PAGEREF _Toc355911472 h 383-3-2- تهيه محيط هاي كشت بافت گياهي PAGEREF _Toc355911473 h 383-3-3- آغازگرها PAGEREF _Toc355911474 h 403-4- روش ها PAGEREF _Toc355911475 h 403-4-1- آماده سازي باكتري براي انجام انتقال ژن به ريزنمونه ها PAGEREF _Toc355911476 h 403-4-2- استخراج DNA پلاسمیدهای نو ترکیب PAGEREF _Toc355911477 h 413-4-3- آماده سازي ريزنمونه ها و اگروباكتريوم برای انتقال ژن به میخک PAGEREF _Toc355911478 h 423-4-4- پیش آماده سازی ریزنمونه ها PAGEREF _Toc355911479 h 433-4-5- روش کار انتقال ژن به گیاه PAGEREF _Toc355911480 h 433-4-6- گزینش و باززايي گياهان تراریخت PAGEREF _Toc355911481 h 443-4-7- استخراج DNA از بافت هاي گياهي با استفاده از محلول CTAB PAGEREF _Toc355911482 h 453-4-9- روش کار PAGEREF _Toc355911483 h 473-4-10- آزمون زنجیره ای پلیمراز ((PCR PAGEREF _Toc355911484 h 493-4-11- تهيه ژل آگارز و انجام الکتروفورز براي بررسي نتايج آزمون PCR PAGEREF _Toc355911485 h 513-4-12- آزمون شيميايي- بافتي برای تعيين فعاليت تراریخت GUS در شاخسارههاي تراریخت PAGEREF _Toc355911486 h 513-4-13- واکاوی داده ها PAGEREF _Toc355911487 h 52 فصل چهارم: نتايج و بحث PAGEREF _Toc355911488 h 544-1- کشت بافت PAGEREF _Toc355911489 h 544-1-1- تشکیل شاخساره نابجا از ریزنمونه های برگ ارقام استاندارد و مینیاتور میخک PAGEREF _Toc355911490 h 544-1-1-1- مواد گیاهی PAGEREF _Toc355911491 h 544-1-1-2- گندزدایی PAGEREF _Toc355911492 h 544-1-1-3- ریزنمونه ها و محیط باززایی PAGEREF _Toc355911493 h 554-2- انتقال ژن با واسطه اگروباکتریوم PAGEREF _Toc355911494 h 564-2-1- آزمايش مقدماتي PAGEREF _Toc355911495 h 584-2-1-1- گزينش با کاناميسين PAGEREF _Toc355911496 h 584-2-2- توليد گياهان تراریخت PAGEREF _Toc355911497 h 614-2-3- تأييد گياهان تراریخت با سنجش فعاليت GUS PAGEREF _Toc355911498 h 634-3- آناليز PCR PAGEREF _Toc355911499 h 644-4- تأثير غلظت باکتري PAGEREF _Toc355911500 h 674-5- تاثير زمان مايه زني PAGEREF _Toc355911501 h 714-6- تاثير مدت زمان هم کشتي بر کارايي انتقال ژن PAGEREF _Toc355911502 h 694-7- برهمكنش سه عامل چگالي نوري باکتري، مدت زمان مايه زني ريزنمونه ها با باکتري و مدت زمان هم کشتي PAGEREF _Toc355911503 h 73پيشنهادها PAGEREF _Toc355911504 h 77منابع PAGEREF _Toc355911505 h 78

فهرست جدولها
عنوان صفحه TOC h z t “Caption,1”
جدول 1-3- مواد تشکیل دهنده محلولهاي پايه محيط كشت MS. PAGEREF _Toc371790627 h 34جدول 2-3- انواع محیط های کشت مورد استفاده. PAGEREF _Toc371790628 h 40جدول 3-3- مواد مورد نياز براي استخراج DNA ژنومی 47
جدول 4-3- مواد لازم در واكنش PCR. PAGEREF _Toc371790629 h 51جدول 5-3- دوره

Author:

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *