کشت بافت ارقام استاندارد و مینیاتور میخک و بهینه سازی شرایط انتقال ژن توسط اگروباکتریوم به آن ها

دانشکده کشاورزی
پایاننامه کارشناسی ارشد رشته‌ علوم باغبانی
کشت بافت ارقام استاندارد و مینیاتور میخک و بهینه سازی شرایط انتقال ژن توسط اگروباکتریوم به آن ها
توسط:
محمد ایرانی پور
استاد راهنما:
دکتر حسن صالحی

اسفند ماه 1388

72644053975
اظهارنامه
اینجانب محمد ایرانی پور دانشجوی رشته ی مهندسی کشاورزی گرایش علوم باغبانی دانشکده کشاورزی اظهار می کنم که این پایان نامه حاصل پژوهش خودم بوده و در جاهایی که از منابع دیگران استفاده کرده ام، نشانی دقیق و مشخصات آن را نوشته ام. همچنین اظهار می کنم که این تحقیق و موضوع پایان نامه ام تکراری نیست و تعهد می نمایم که بدون مجوز دانشگاه دستاوردهای آن را منتشر ننموده و یا در اختیار غیر قرار ندهم. کلیه حقوق این اثر مطابق آیین نامه مالکیت فکری و معنوی متعلق به دانشگاه شیراز است.
نام و نام خانوادگی: محمد ایرانی پور
تاریخ و امضا: 24/12/88

به نام خدا
کشت بافت ارقام استاندارد و مینیاتور میخک و بهینه سازی شرایط انتقال ژن توسط اگروباکتریوم به آن ها
به کوشش
محمد ایرانی پور
پایان نامه
ارائه شده به تحصیلات تکمیلی دانشگاه به عنوان بخشی از
فعالیت های تحصیلی لازم برای اخذ درجه‌ کارشناسی ارشد
در رشته‌:
علوم باغبانی (گیاهان زینتی)
از دانشگاه شیراز
شیراز، ایران

اسفند ماه 1388

تقدیم به:
روح آسمانی مادر بزرگم
آن که نامش افتخار است و یادش انگیزه
و پدر و مادر عزیزم
به پاس عاطفه سرشار و گرمای امید بخش وجودشان که در این سردترین روزگاران بهترین پشتیبان است
برادران و خواهران عزیزم که وجودشان باعث دلگرمی من است
و
اسوه علم و اخلاق
استاد راهنمای مهربانم

سپاسگزاری
پرسید از قلم که کدامین کلام نغز در مجمع حروف الفبا سر آمد است
فوراً به روی صفحه کاغذ دوید و گفت بعد از خدا محمد و آل محمد است
سپاس یکتا پروردگار را که فرصتی دست داد تا با اجرا، تدوین و نگارش این پایان نامه گامی ناچیز در اعتلای این رشته برداریم. برخود واجب می دانم مراتب سپاس و قدردانی خودم را از تمام کسانی که در مراحل مختلف این پژوهش مرا یاری نمودند اعلام نمایم. از استاد فرزانه، دانشمند و معلم اخلاق، جناب آقای دکتر حسن صالحی که زحمت راهنمایی این پایان نامه را بر عهده داشته و راهنمایی های ارزنده ایشان همواره راهگشا و مشوق اینجانب بوده و می باشد صادقانه قدر دانی و تشکر می نمایم و از خداوند منان توفیق روزافزون ایشان را مسئلت دارم. از اساتید علم و اخلاق جناب آقای دکتر مرتضی خوشخوی و جناب آقای دکتر علی نیازی که مشاوره این پژوهش را بر عهده داشتند، به خاطر راهنمایی های فراوان علمی و ارزنده ای که در انجام این تحقیق مبذول داشتند، نهایت امتنان و سپاس را دارم. سپاس بی پایان خود را به اساتید محترم بخش علوم باغبانی که افتخار شاگردی ایشان را داشته ام تقدیم می دارم. از کارشناسان و کارکنان بخش علوم باغبانی به ویژه جناب آقای مهندس فرهاد نیکبخت به خاطر همکاری با اینجانب در طی این پژوهش قدردانی می نمایم. مایلم مراتب سپاس خود را به دکتر همایون فرهمند، مهندس احمد طهماسبی، مهندس مهدی گودرزی، مهندس محسن اکبری، مهندس فرزاد نظری، مهندس محمدرضا رضایی، مهندس محمدرضا صالحی، مهندس غلامعلی امیدی، مهندس احسان ولی الهی و مهندس مصطفی خوشحال سرمست به دلیل مساعدت و همکاری ارزشمندشان تقدیم دارم. لازم می دانم مراتب امتنان خویش را نسبت به همکلاسی های خوبم، جناب آقای سهیل کریمی، الیاس امری، صدر اله رمضانی و سرکار خانم نارسیس زرشناس حقیقی به پاس همه ی خوبی هایشان ابراز دارم.
محمد ایرانی پور
اسفند 1388
چکیده
کشت بافت ارقام استاندارد و مینیاتور میخک و بهینه سازی شرایط انتقال ژن توسط اگروباکتریوم به آن ها
به کوشش
محمد ایرانی پور
میخک یکی از محبوب ترین، اقتصادی ترین و مهم ترین گل های بریدنی به سبب پیوسته گلدهی و رقم های چند رنگ و منحصر به فرد می باشد. محدودیت های موجود در روش های بهنژادی سنتی (تلاقی و گزینش) و داشتن ویژگی های هتروزیگوسیتی بالا در این گیاه سبب شده است که کاربرد فنون جدید یاخته ای – مولکولی برای بهبود ویژگی های اقتصادی این گیاه ضرورت پیدا کند. این پژوهش به منظور بررسی ریزافزایی ارقام استاندارد ’ ‘Rendz-Vousو مینیاتور’Panamera‘ توسط اندام زایی مستقیم و رویان زایی بدنی، تعیین غلظت بهینه ماده گزینشگر کانامیسین و بهینه سازی شرایط انتقال ژن توسط اگروباکتریوم به آن ها انجام شد. بدین منظور آزمایشی به صورت فاکتوریل در قالب طرح به طور کامل تصادفی با 3 تکرار اجرا شد. در این پژوهش، از قطعه های برگ گیاهان رشد یافته در گلخانه با سن 6 تا 8 هفته و پینه برای تهیه ریزنمونه استفاده گردید. انتقال ژن gus به میخک توسط سویه LBA 4404 باکتری Agrobacterium tumefaciens دارای پلاسمید pBI121 بیان کننده ژن بتاگلوکورونیداز انجام شد. نتایج اندام زایی مستقیم نشان داد که میانگین تعداد شاخساره های نابجا برای هر دو رقم با افزایش غلظت BA به 9/0 میلی گرم در لیتر افزایش می یابد در صورتی که با NAA بیشترین تعداد شاخساره های نابجا در غلظت 3/0 میلی گرم در لیتر به دست آمده و با افزایش غلظت آن کاهش می یابد. ارزیابی تأثیر شرایط تاریکی و روشنایی بر باززایی ارقام توسط رویان زایی بدنی در مدت زمان های 30 و 60 روز نشان داد که در شرایط تاریکی مقدار پینه به دست آمده برای هر دو رقم به طور معنی داری بیش از شرایط روشنایی می باشد. نتایج تشکیل پینه و شاخساره نشان داد که رقم ’Panamera‘ بیش از رقم ’Rendz-Vous‘ به کانامیسین مقاوم است. به نظر می رسد آلودگی باکتریایی تشکیل پینه و شاخساره را به عقب می اندازد. بدون آلودگی باکتریایی تشکیل شاخساره در غلظت 50 میلی گرم در لیتر کانامیسین برای رقم ’Rendz-Vous‘ به طور کامل متوقف شد در حالی که برای رقم ’Panamera‘ این اتفاق در غلظت 100 میلی گرم در لیتر کانامیسین صورت گرفت. در بهینه سازی انتقال ژن با اگروباکتریوم تأثیر غلظت باکتری، مدت زمان تلقیح ریزنمونه ها با باکتری و مدت زمان هم کشتی بر کارایی انتقال ژن مورد ارزیابی قرار گرفت. آزمون شیمیایی- بافتی و تجزیه PCR پیوستن ژن بتاگلوکورونیداز در شاخساره های تراریخت باززایی شده را اثبات نمود. چگالی نوری 5/0، مدت زمان تلقیح ریزنمونه ها با باکتری به مدت 20 دقیقه و هم کشتی به مدت 3 روز سبب افزایش درصد شاخساره های تراریخت گردید. در این پژوهش رقم استاندارد ’Rendz-Vous‘ نسبت به رقم مینیاتور ’Panamera‘ کارایی انتقال ژن بالاتری نشان داد. اختلاف بین دو رقم در میزان باززایی و کارایی تراریزش به دلیل اندازه کوچکتر ریزنمونه های برگ در رقم مینیاتور ’Panamera‘ قابل توجیه است. گیاهک های باززایی شده از اندام زایی مستقیم، رویان زایی بدنی و تراریزش با اگروباکتریوم در آمیخته پرلایت و ورمیکولیت در شرایط رطوبت نسبی %95 نگهداری و سپس به گلخانه منتقل شدند. این اولین گزارش انتقال ژن به میخک در ایران می باشد.

فهرست مطالب
عنوان صفحه
فصل اول: TOC o “1-1” h z t “Heading 2,1,Heading 3,1” مقدمه PAGEREF _Toc355911420 h 21-1- منشاء PAGEREF _Toc355911421 h 31-2- اصطلاح‌شناسی PAGEREF _Toc355911422 h 41-3- انواع میخک PAGEREF _Toc355911423 h 4١-4- گیاه‌شناسی و ریخت‌شناسی میخک PAGEREF _Toc355911424 h 5١-5- روش‌های افزایش میخک PAGEREF _Toc355911425 h 71-6- اهمیت و اهداف پژوهش PAGEREF _Toc355911426 h 7فصل دوم: مروری بر پژوهش های پیشین PAGEREF _Toc355911427 h 102-1- ریزافزایی و کشت بافت میخک PAGEREF _Toc355911428 h 102-1-1- گزینش ریزنمونه و گندزدایی سطحی آن PAGEREF _Toc355911429 h 102-1-2- ریخت زایی و باززایی PAGEREF _Toc355911430 h 122-1-3- رویان زایی بدنی PAGEREF _Toc355911431 h 132-1-3-1- تنظیم کننده های رشد PAGEREF _Toc355911432 h 142-1-3-2- محیط پینه زایی PAGEREF _Toc355911433 h 162-1-3-3- محیط ریشه زایی PAGEREF _Toc355911434 h 172-1-3-4- سن مواد گیاهی و شرایط کاشت PAGEREF _Toc355911435 h 182-1-4- مسیرهای رویان زایی بدنی PAGEREF _Toc355911436 h 192-2- انتقال ژن توسط اگروباکتریوم PAGEREF _Toc355911437 h 192-2-1- اساس ایجاد گال و پلاسمید Ti PAGEREF _Toc355911438 h 202-2-2- انتقال T- DNA PAGEREF _Toc355911439 h 202-2-3- عوامل مؤثر بر انتقال توسط اگروباکتریوم PAGEREF _Toc355911440 h 222-2-3-1- نژادگان (ژنوتیپ) PAGEREF _Toc355911441 h 222-2-3-1-1- ریزنمونه های شروع کننده PAGEREF _Toc355911442 h 222-2-3-1-2- سویه باکتری PAGEREF _Toc355911443 h 242-2-3-1-3- چگالی نوری PAGEREF _Toc355911444 h 252-2-3-1-4- انگیزاننده های ژن های بیماری زا PAGEREF _Toc355911445 h 262-2-3-1-5- مدت زمان هم کشتی PAGEREF _Toc355911446 h 272-2-3-1-6- گزینش با کانامیسین PAGEREF _Toc355911447 h 28فصل سوم: مواد و روش‌ها PAGEREF _Toc355911448 h 303-1- کشت بافت PAGEREF _Toc355911449 h 303-١-1- مواد گیاهی PAGEREF _Toc355911450 h 303-١-2- قسمت‌های گیاهی مورد استفاده در کشت بافت PAGEREF _Toc355911451 h 303-١-٣- گندزدایی ریزنمونه‌ها و وسایل PAGEREF _Toc355911452 h 313-١-4- آماده‌سازی ریزنمونه‌ها برای استقرار PAGEREF _Toc355911453 h 323-١-5- محیط کشت PAGEREF _Toc355911454 h 323-2- انتقال توسط اگروباکتریوم PAGEREF _Toc355911455 h 343-2-1- مواد PAGEREF _Toc355911456 h 343-2-1-1- بافر STET PAGEREF _Toc355911457 h 343-2-1-2- بافر الکتروفورز PAGEREF _Toc355911458 h 343-2-1-3- بافر CTAB PAGEREF _Toc355911459 h 353-2-1-4- بافر TE PAGEREF _Toc355911460 h 353-2-1- 5- بافر سنجش GUS PAGEREF _Toc355911461 h 353-2-1-6- بافر بارگذاری PAGEREF _Toc355911462 h 353-2-1-7- محلول ذخیره آنتی بیوتیک کانامیسین PAGEREF _Toc355911463 h 363-2-1-8- محلول ذخیره آنتی بیوتیک ریفامپیسین PAGEREF _Toc355911464 h 363-2-1-9- محلول ذخیره آنتی بیوتیک سفاتاکسیم PAGEREF _Toc355911465 h 363-2-1-10- محلول ذخیره استوسیرینگون PAGEREF _Toc355911466 h 363-2-1-11- محلول ذخیره نفتالن استیک اسید PAGEREF _Toc355911467 h 373-2-1-12- محلول ذخیره بنزیل آدنین PAGEREF _Toc355911468 h 373-2-1-13- محیط کشت LB (Luria-Bertani) PAGEREF _Toc355911469 h 373-2-1-14- سویه A. tumefaciens PAGEREF _Toc355911470 h 373-3- روش ها PAGEREF _Toc355911471 h 383-3-1- تهیه ریزنمونه PAGEREF _Toc355911472 h 383-3-2- تهیه محیط های کشت بافت گیاهی PAGEREF _Toc355911473 h 383-3-3- آغازگرها PAGEREF _Toc355911474 h 403-4- روش ها PAGEREF _Toc355911475 h 403-4-1- آماده سازی باکتری برای انجام انتقال ژن به ریزنمونه ها PAGEREF _Toc355911476 h 403-4-2- استخراج DNA پلاسمیدهای نو ترکیب PAGEREF _Toc355911477 h 413-4-3- آماده سازی ریزنمونه ها و اگروباکتریوم برای انتقال ژن به میخک PAGEREF _Toc355911478 h 423-4-4- پیش آماده سازی ریزنمونه ها PAGEREF _Toc355911479 h 433-4-5- روش کار انتقال ژن به گیاه PAGEREF _Toc355911480 h 433-4-6- گزینش و باززایی گیاهان تراریخت PAGEREF _Toc355911481 h 443-4-7- استخراج DNA از بافت های گیاهی با استفاده از محلول CTAB PAGEREF _Toc355911482 h 453-4-9- روش کار PAGEREF _Toc355911483 h 473-4-10- آزمون زنجیره ای پلیمراز ((PCR PAGEREF _Toc355911484 h 493-4-11- تهیه ژل آگارز و انجام الکتروفورز برای بررسی نتایج آزمون PCR PAGEREF _Toc355911485 h 513-4-12- آزمون شیمیایی- بافتی برای تعیین فعالیت تراریخت GUS در شاخسارههای تراریخت PAGEREF _Toc355911486 h 513-4-13- واکاوی داده ها PAGEREF _Toc355911487 h 52 فصل چهارم: نتایج و بحث PAGEREF _Toc355911488 h 544-1- کشت بافت PAGEREF _Toc355911489 h 544-1-1- تشکیل شاخساره نابجا از ریزنمونه های برگ ارقام استاندارد و مینیاتور میخک PAGEREF _Toc355911490 h 544-1-1-1- مواد گیاهی PAGEREF _Toc355911491 h 544-1-1-2- گندزدایی PAGEREF _Toc355911492 h 544-1-1-3- ریزنمونه ها و محیط باززایی PAGEREF _Toc355911493 h 554-2- انتقال ژن با واسطه اگروباکتریوم PAGEREF _Toc355911494 h 564-2-1- آزمایش مقدماتی PAGEREF _Toc355911495 h 584-2-1-1- گزینش با کانامیسین PAGEREF _Toc355911496 h 584-2-2- تولید گیاهان تراریخت PAGEREF _Toc355911497 h 614-2-3- تأیید گیاهان تراریخت با سنجش فعالیت GUS PAGEREF _Toc355911498 h 634-3- آنالیز PCR PAGEREF _Toc355911499 h 644-4- تأثیر غلظت باکتری PAGEREF _Toc355911500 h 674-5- تاثیر زمان مایه زنی PAGEREF _Toc355911501 h 714-6- تاثیر مدت زمان هم کشتی بر کارایی انتقال ژن PAGEREF _Toc355911502 h 694-7- برهمکنش سه عامل چگالی نوری باکتری، مدت زمان مایه زنی ریزنمونه ها با باکتری و مدت زمان هم کشتی PAGEREF _Toc355911503 h 73پیشنهادها PAGEREF _Toc355911504 h 77منابع PAGEREF _Toc355911505 h 78

فهرست جدولها
عنوان صفحه TOC h z t “Caption,1”
جدول 1-3- مواد تشکیل دهنده محلولهای پایه محیط کشت MS. PAGEREF _Toc371790627 h 34جدول 2-3- انواع محیط های کشت مورد استفاده. PAGEREF _Toc371790628 h 40جدول 3-3- مواد مورد نیاز برای استخراج DNA ژنومی 47
جدول 4-3- مواد لازم در واکنش PCR. PAGEREF _Toc371790629 h 51جدول 5-3- دوره

این نوشته در پایان نامه ها ارسال شده است. افزودن پیوند یکتا به علاقه‌مندی‌ها.

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *