کشت بافت ارقام استاندارد و مینیاتور میخک و بهینه سازی شرایط انتقال ژن توسط اگروباکتریوم به آن ها

دانشکده کشاورزی
پایاننامه کارشناسی ارشد رشته‌ علوم باغبانی
کشت بافت ارقام استاندارد و مینیاتور میخک و بهینه سازی شرایط انتقال ژن توسط اگروباکتریوم به آن ها
توسط:
محمد ایرانی پور
استاد راهنما:
دکتر حسن صالحی

اسفند ماه 1388

72644053975
اظهارنامه
اینجانب محمد ایرانی پور دانشجوی رشته ی مهندسی کشاورزی گرایش علوم باغبانی دانشکده کشاورزی اظهار می کنم که این پایان نامه حاصل پژوهش خودم بوده و در جاهایی که از منابع دیگران استفاده کرده ام، نشانی دقیق و مشخصات آن را نوشته ام. همچنین اظهار می کنم که این تحقیق و موضوع پایان نامه ام تکراری نیست و تعهد می نمایم که بدون مجوز دانشگاه دستاوردهای آن را منتشر ننموده و یا در اختیار غیر قرار ندهم. کلیه حقوق این اثر مطابق آیین نامه مالکیت فکری و معنوی متعلق به دانشگاه شیراز است.
نام و نام خانوادگی: محمد ایرانی پور
تاریخ و امضا: 24/12/88

به نام خدا
کشت بافت ارقام استاندارد و مینیاتور میخک و بهینه سازی شرایط انتقال ژن توسط اگروباکتریوم به آن ها
به کوشش
محمد ایرانی پور
پایان نامه
ارائه شده به تحصیلات تکمیلی دانشگاه به عنوان بخشی از
فعالیت های تحصیلی لازم برای اخذ درجه‌ کارشناسی ارشد
در رشته‌:
علوم باغبانی (گیاهان زینتی)
از دانشگاه شیراز
شیراز، ایران

اسفند ماه 1388

تقدیم به:
روح آسمانی مادر بزرگم
آن که نامش افتخار است و یادش انگیزه
و پدر و مادر عزیزم
به پاس عاطفه سرشار و گرمای امید بخش وجودشان که در این سردترین روزگاران بهترین پشتیبان است
برادران و خواهران عزیزم که وجودشان باعث دلگرمی من است
و
اسوه علم و اخلاق
استاد راهنمای مهربانم

سپاسگزاری
پرسید از قلم که کدامین کلام نغز در مجمع حروف الفبا سر آمد است
فوراً به روی صفحه کاغذ دوید و گفت بعد از خدا محمد و آل محمد است
سپاس یکتا پروردگار را که فرصتی دست داد تا با اجرا، تدوین و نگارش این پایان نامه گامی ناچیز در اعتلای این رشته برداریم. برخود واجب می دانم مراتب سپاس و قدردانی خودم را از تمام کسانی که در مراحل مختلف این پژوهش مرا یاری نمودند اعلام نمایم. از استاد فرزانه، دانشمند و معلم اخلاق، جناب آقای دکتر حسن صالحی که زحمت راهنمایی این پایان نامه را بر عهده داشته و راهنمایی های ارزنده ایشان همواره راهگشا و مشوق اینجانب بوده و می باشد صادقانه قدر دانی و تشکر می نمایم و از خداوند منان توفیق روزافزون ایشان را مسئلت دارم. از اساتید علم و اخلاق جناب آقای دکتر مرتضی خوشخوی و جناب آقای دکتر علی نیازی که مشاوره این پژوهش را بر عهده داشتند، به خاطر راهنمایی های فراوان علمی و ارزنده ای که در انجام این تحقیق مبذول داشتند، نهایت امتنان و سپاس را دارم. سپاس بی پایان خود را به اساتید محترم بخش علوم باغبانی که افتخار شاگردی ایشان را داشته ام تقدیم می دارم. از کارشناسان و کارکنان بخش علوم باغبانی به ویژه جناب آقای مهندس فرهاد نیکبخت به خاطر همکاری با اینجانب در طی این پژوهش قدردانی می نمایم. مایلم مراتب سپاس خود را به دکتر همایون فرهمند، مهندس احمد طهماسبی، مهندس مهدی گودرزی، مهندس محسن اکبری، مهندس فرزاد نظری، مهندس محمدرضا رضایی، مهندس محمدرضا صالحی، مهندس غلامعلی امیدی، مهندس احسان ولی الهی و مهندس مصطفی خوشحال سرمست به دلیل مساعدت و همکاری ارزشمندشان تقدیم دارم. لازم می دانم مراتب امتنان خویش را نسبت به همکلاسی های خوبم، جناب آقای سهیل کریمی، الیاس امری، صدر اله رمضانی و سرکار خانم نارسیس زرشناس حقیقی به پاس همه ی خوبی هایشان ابراز دارم.
محمد ایرانی پور
اسفند 1388
چکیده
کشت بافت ارقام استاندارد و مینیاتور میخک و بهینه سازی شرایط انتقال ژن توسط اگروباکتریوم به آن ها
به کوشش
محمد ایرانی پور
میخک یکی از محبوب ترین، اقتصادی ترین و مهم ترین گل های بریدنی به سبب پیوسته گلدهی و رقم های چند رنگ و منحصر به فرد می باشد. محدودیت های موجود در روش های بهنژادی سنتی (تلاقی و گزینش) و داشتن ویژگی های هتروزیگوسیتی بالا در این گیاه سبب شده است که کاربرد فنون جدید یاخته ای – مولکولی برای بهبود ویژگی های اقتصادی این گیاه ضرورت پیدا کند. این پژوهش به منظور بررسی ریزافزایی ارقام استاندارد ’ ‘Rendz-Vousو مینیاتور’Panamera‘ توسط اندام زایی مستقیم و رویان زایی بدنی، تعیین غلظت بهینه ماده گزینشگر کانامیسین و بهینه سازی شرایط انتقال ژن توسط اگروباکتریوم به آن ها انجام شد. بدین منظور آزمایشی به صورت فاکتوریل در قالب طرح به طور کامل تصادفی با 3 تکرار اجرا شد. در این پژوهش، از قطعه های برگ گیاهان رشد یافته در گلخانه با سن 6 تا 8 هفته و پینه برای تهیه ریزنمونه استفاده گردید. انتقال ژن gus به میخک توسط سویه LBA 4404 باکتری Agrobacterium tumefaciens دارای پلاسمید pBI121 بیان کننده ژن بتاگلوکورونیداز انجام شد. نتایج اندام زایی مستقیم نشان داد که میانگین تعداد شاخساره های نابجا برای هر دو رقم با افزایش غلظت BA به 9/0 میلی گرم در لیتر افزایش می یابد در صورتی که با NAA بیشترین تعداد شاخساره های نابجا در غلظت 3/0 میلی گرم در لیتر به دست آمده و با افزایش غلظت آن کاهش می یابد. ارزیابی تأثیر شرایط تاریکی و روشنایی بر باززایی ارقام توسط رویان زایی بدنی در مدت زمان های 30 و 60 روز نشان داد که در شرایط تاریکی مقدار پینه به دست آمده برای هر دو رقم به طور معنی داری بیش از شرایط روشنایی می باشد. نتایج تشکیل پینه و شاخساره نشان داد که رقم ’Panamera‘ بیش از رقم ’Rendz-Vous‘ به کانامیسین مقاوم است. به نظر می رسد آلودگی باکتریایی تشکیل پینه و شاخساره را به عقب می اندازد. بدون آلودگی باکتریایی تشکیل شاخساره در غلظت 50 میلی گرم در لیتر کانامیسین برای رقم ’Rendz-Vous‘ به طور کامل متوقف شد در حالی که برای رقم ’Panamera‘ این اتفاق در غلظت 100 میلی گرم در لیتر کانامیسین صورت گرفت. در بهینه سازی انتقال ژن با اگروباکتریوم تأثیر غلظت باکتری، مدت زمان تلقیح ریزنمونه ها با باکتری و مدت زمان هم کشتی بر کارایی انتقال ژن مورد ارزیابی قرار گرفت. آزمون شیمیایی- بافتی و تجزیه PCR پیوستن ژن بتاگلوکورونیداز در شاخساره های تراریخت باززایی شده را اثبات نمود. چگالی نوری 5/0، مدت زمان تلقیح ریزنمونه ها با باکتری به مدت 20 دقیقه و هم کشتی به مدت 3 روز سبب افزایش درصد شاخساره های تراریخت گردید. در این پژوهش رقم استاندارد ’Rendz-Vous‘ نسبت به رقم مینیاتور ’Panamera‘ کارایی انتقال ژن بالاتری نشان داد. اختلاف بین دو رقم در میزان باززایی و کارایی تراریزش به دلیل اندازه کوچکتر ریزنمونه های برگ در رقم مینیاتور ’Panamera‘ قابل توجیه است. گیاهک های باززایی شده از اندام زایی مستقیم، رویان زایی بدنی و تراریزش با اگروباکتریوم در آمیخته پرلایت و ورمیکولیت در شرایط رطوبت نسبی %95 نگهداری و سپس به گلخانه منتقل شدند. این اولین گزارش انتقال ژن به میخک در ایران می باشد.

فهرست مطالب
عنوان صفحه
فصل اول: TOC \o “1-1” \h \z \t “Heading 2,1,Heading 3,1” مقدمه PAGEREF _Toc355911420 \h 21-1- منشاء PAGEREF _Toc355911421 \h 31-2- اصطلاح‌شناسی PAGEREF _Toc355911422 \h 41-3- انواع میخک PAGEREF _Toc355911423 \h 4١-4- گیاه‌شناسی و ریخت‌شناسی میخک PAGEREF _Toc355911424 \h 5١-5- روش‌های افزایش میخک PAGEREF _Toc355911425 \h 71-6- اهمیت و اهداف پژوهش PAGEREF _Toc355911426 \h 7فصل دوم: مروری بر پژوهش های پیشین PAGEREF _Toc355911427 \h 102-1- ریزافزایی و کشت بافت میخک PAGEREF _Toc355911428 \h 102-1-1- گزینش ریزنمونه و گندزدایی سطحی آن PAGEREF _Toc355911429 \h 102-1-2- ریخت زایی و باززایی PAGEREF _Toc355911430 \h 122-1-3- رویان زایی بدنی PAGEREF _Toc355911431 \h 132-1-3-1- تنظیم کننده های رشد PAGEREF _Toc355911432 \h 142-1-3-2- محیط پینه زایی PAGEREF _Toc355911433 \h 162-1-3-3- محیط ریشه زایی PAGEREF _Toc355911434 \h 172-1-3-4- سن مواد گیاهی و شرایط کاشت PAGEREF _Toc355911435 \h 182-1-4- مسیرهای رویان زایی بدنی PAGEREF _Toc355911436 \h 192-2- انتقال ژن توسط اگروباکتریوم PAGEREF _Toc355911437 \h 192-2-1- اساس ایجاد گال و پلاسمید Ti PAGEREF _Toc355911438 \h 202-2-2- انتقال T- DNA PAGEREF _Toc355911439 \h 202-2-3- عوامل مؤثر بر انتقال توسط اگروباکتریوم PAGEREF _Toc355911440 \h 222-2-3-1- نژادگان (ژنوتیپ) PAGEREF _Toc355911441 \h 222-2-3-1-1- ریزنمونه های شروع کننده PAGEREF _Toc355911442 \h 222-2-3-1-2- سویه باکتری PAGEREF _Toc355911443 \h 242-2-3-1-3- چگالی نوری PAGEREF _Toc355911444 \h 252-2-3-1-4- انگیزاننده های ژن های بیماری زا PAGEREF _Toc355911445 \h 262-2-3-1-5- مدت زمان هم کشتی PAGEREF _Toc355911446 \h 272-2-3-1-6- گزینش با کانامیسین PAGEREF _Toc355911447 \h 28فصل سوم: مواد و روش‌ها PAGEREF _Toc355911448 \h 303-1- کشت بافت PAGEREF _Toc355911449 \h 303-١-1- مواد گیاهی PAGEREF _Toc355911450 \h 303-١-2- قسمت‌های گیاهی مورد استفاده در کشت بافت PAGEREF _Toc355911451 \h 303-١-٣- گندزدایی ریزنمونه‌ها و وسایل PAGEREF _Toc355911452 \h 313-١-4- آماده‌سازی ریزنمونه‌ها برای استقرار PAGEREF _Toc355911453 \h 323-١-5- محیط کشت PAGEREF _Toc355911454 \h 323-2- انتقال توسط اگروباکتریوم PAGEREF _Toc355911455 \h 343-2-1- مواد PAGEREF _Toc355911456 \h 343-2-1-1- بافر STET PAGEREF _Toc355911457 \h 343-2-1-2- بافر الکتروفورز PAGEREF _Toc355911458 \h 343-2-1-3- بافر CTAB PAGEREF _Toc355911459 \h 353-2-1-4- بافر TE PAGEREF _Toc355911460 \h 353-2-1- 5- بافر سنجش GUS PAGEREF _Toc355911461 \h 353-2-1-6- بافر بارگذاری PAGEREF _Toc355911462 \h 353-2-1-7- محلول ذخیره آنتی بیوتیک کانامیسین PAGEREF _Toc355911463 \h 363-2-1-8- محلول ذخیره آنتی بیوتیک ریفامپیسین PAGEREF _Toc355911464 \h 363-2-1-9- محلول ذخیره آنتی بیوتیک سفاتاکسیم PAGEREF _Toc355911465 \h 363-2-1-10- محلول ذخیره استوسیرینگون PAGEREF _Toc355911466 \h 363-2-1-11- محلول ذخیره نفتالن استیک اسید PAGEREF _Toc355911467 \h 373-2-1-12- محلول ذخیره بنزیل آدنین PAGEREF _Toc355911468 \h 373-2-1-13- محیط کشت LB (Luria-Bertani) PAGEREF _Toc355911469 \h 373-2-1-14- سویه A. tumefaciens PAGEREF _Toc355911470 \h 373-3- روش ها PAGEREF _Toc355911471 \h 383-3-1- تهیه ریزنمونه PAGEREF _Toc355911472 \h 383-3-2- تهیه محیط های کشت بافت گیاهی PAGEREF _Toc355911473 \h 383-3-3- آغازگرها PAGEREF _Toc355911474 \h 403-4- روش ها PAGEREF _Toc355911475 \h 403-4-1- آماده سازی باکتری برای انجام انتقال ژن به ریزنمونه ها PAGEREF _Toc355911476 \h 403-4-2- استخراج DNA پلاسمیدهای نو ترکیب PAGEREF _Toc355911477 \h 413-4-3- آماده سازی ریزنمونه ها و اگروباکتریوم برای انتقال ژن به میخک PAGEREF _Toc355911478 \h 423-4-4- پیش آماده سازی ریزنمونه ها PAGEREF _Toc355911479 \h 433-4-5- روش کار انتقال ژن به گیاه PAGEREF _Toc355911480 \h 433-4-6- گزینش و باززایی گیاهان تراریخت PAGEREF _Toc355911481 \h 443-4-7- استخراج DNA از بافت های گیاهی با استفاده از محلول CTAB PAGEREF _Toc355911482 \h 453-4-9- روش کار PAGEREF _Toc355911483 \h 473-4-10- آزمون زنجیره ای پلیمراز ((PCR PAGEREF _Toc355911484 \h 493-4-11- تهیه ژل آگارز و انجام الکتروفورز برای بررسی نتایج آزمون PCR PAGEREF _Toc355911485 \h 513-4-12- آزمون شیمیایی- بافتی برای تعیین فعالیت تراریخت GUS در شاخسارههای تراریخت PAGEREF _Toc355911486 \h 513-4-13- واکاوی داده ها PAGEREF _Toc355911487 \h 52 فصل چهارم: نتایج و بحث PAGEREF _Toc355911488 \h 544-1- کشت بافت PAGEREF _Toc355911489 \h 544-1-1- تشکیل شاخساره نابجا از ریزنمونه های برگ ارقام استاندارد و مینیاتور میخک PAGEREF _Toc355911490 \h 544-1-1-1- مواد گیاهی PAGEREF _Toc355911491 \h 544-1-1-2- گندزدایی PAGEREF _Toc355911492 \h 544-1-1-3- ریزنمونه ها و محیط باززایی PAGEREF _Toc355911493 \h 554-2- انتقال ژن با واسطه اگروباکتریوم PAGEREF _Toc355911494 \h 564-2-1- آزمایش مقدماتی PAGEREF _Toc355911495 \h 584-2-1-1- گزینش با کانامیسین PAGEREF _Toc355911496 \h 584-2-2- تولید گیاهان تراریخت PAGEREF _Toc355911497 \h 614-2-3- تأیید گیاهان تراریخت با سنجش فعالیت GUS PAGEREF _Toc355911498 \h 634-3- آنالیز PCR PAGEREF _Toc355911499 \h 644-4- تأثیر غلظت باکتری PAGEREF _Toc355911500 \h 674-5- تاثیر زمان مایه زنی PAGEREF _Toc355911501 \h 714-6- تاثیر مدت زمان هم کشتی بر کارایی انتقال ژن PAGEREF _Toc355911502 \h 694-7- برهمکنش سه عامل چگالی نوری باکتری، مدت زمان مایه زنی ریزنمونه ها با باکتری و مدت زمان هم کشتی PAGEREF _Toc355911503 \h 73پیشنهادها PAGEREF _Toc355911504 \h 77منابع PAGEREF _Toc355911505 \h 78

فهرست جدولها
عنوان صفحه TOC \h \z \t “Caption,1”
جدول 1-3- مواد تشکیل دهنده محلولهای پایه محیط کشت MS. PAGEREF _Toc371790627 \h 34جدول 2-3- انواع محیط های کشت مورد استفاده. PAGEREF _Toc371790628 \h 40جدول 3-3- مواد مورد نیاز برای استخراج DNA ژنومی 47
جدول 4-3- مواد لازم در واکنش PCR. PAGEREF _Toc371790629 \h 51جدول 5-3- دوره های دمایی واکنش های PCR. PAGEREF _Toc371790630 \h 51جدول 1-4- اثر غلظت های مختلف BA و NAA بر تعداد شاخساره های نابجای باززایی شده از ریزنمونه های برگ رقم استاندارد’Rendz-Vous‘ . PAGEREF _Toc371790631 \h 57جدول 2-4- اثر غلظت های مختلف BA و NAA بر تعداد شاخساره های نابجای باززایی شده از ریز نمونه های برگ رقم ’Panamera‘. PAGEREF _Toc371790632 \h 57جدول 3-4- اندام زایی از ریزنمونه های برگ دو رقم میخک روی محیط دارای کانامیسین با و بدون آلودگی توسط Agrobacterium tumefaciens LBA 4404. PAGEREF _Toc371790633 \h 60جدول4-4- مقایسه تعداد و درصد شاخساره های تراریخت به دست آمده در تیمار چگالی های نوری مختلف باکتری. PAGEREF _Toc371790636 \h 70جدول 5-4- مقایسه تعداد و درصد شاخساره های تراریخت به دست آمده در مدت زمان های مایه زنی ریز نمونه ها با باکتری. PAGEREF _Toc371790637 \h 71جدول6-4- مقایسه تعداد و درصد شاخساره های تراریخت به دست آمده در مدت زمان های هم کشتی مختلف ریز نمونه ها با باکتری PAGEREF _Toc371790638 \h 74جدول 7-4- مقایسه درصد شاخساره های تراریخت به دست آمده در سه عامل چگالی نوری باکتری، زمان مایه زنی با باکتری و مدت هم کشتی ریز نمونه ها با باکتری در سه سطح مختلف برای رقم ’Rendz-Vous‘ PAGEREF _Toc355914554 \h 76جدول 8-4- مقایسه درصد شاخساره های تراریخت به دست آمده در سه عامل چگالی نوری باکتری، زمان مایه زنی با باکتری و مدت هم کشتی ریز نمونه ها با باکتری در سه سطح مختلف برای رقم ’Panamera‛ PAGEREF _Toc371790639 \h 77

فهرست نگارهها
عنوان صفحه
TOC \h \z \t “Title,1” نگاره1-3. جایگاه های برشی پلاسمید pBI121 PAGEREF _Toc355915305 \h 43نگاره1-4- ایجاد شاخساره و پینه پس از گذشت 8 تا 10 هفته از مایه کوبی برای رقم Rendz-Vous63نگاره 2-4- سنجش ژن GUS در رقم ‘Rendz-Vous‘ PAGEREF _Toc355915307 \h 64نگاره 3-4- سنجش ژن GUS در رقم ‘Panamera‘ PAGEREF _Toc355915308 \h 65نگاره 4-4- نتایج آزمون PCR در رقم ’Rendz-Vous‘. وجود گیاهان تراریخت میخک با جفت آغازگرهای ژن GUS برای تأیید وجود این ژن. چاهک M نشانگر kb10، چاهک 1 کنترل منفی، چاهک 2 تا 7 نمونه های مربوط به گیاهان تراریخت و چاهک 8 و 9 مربوط به گیاهان ناتراریخت….66
نگاره 5-4- نتایج آزمون PCR در رقم ‘Panamera‘. گیاهان تراریخت میخک با جفت آغازگرهای ژن gus برای تأیید وجود این ژن. چاهک M نشانگر kb10، چاهک 1 کنترل منفی، چاهک 2 تا 4 نمونه های مربوط به گیاهان تراریخت و چاهک 5 تا 7 مربوط به گیاهان ناتراریخت PAGEREF _Toc355915309 \h 67نگاره 6-4- سنجش ژن GUS در ریزنمونه های پینه (A,B,C) و اندام های گل (D) باززایی شده در رقم ‘Rendz-Vous‘ PAGEREF _Toc355915310 \h 68 TOC \o “1-1” \h \z \u

کوتاههها
6- بنزیل آمینو پیورین (6-benzyl amino-9-(tetrahydropyran-2– yl)-9H-purine) BAP
پیشبر ویروس موزائیک گل کلم (Cauliflower mosaic virus promotor) CaMV 35S
آب دوبار تقطیر (Double distilled water) DDW
توفوردی (2و4- دیکلروفنوکسی استیک اسید) (2,4-dichlorophenoxy acetic acid) 2,4-D
اتیلن دیآمین تترا استیک اسید (Ethylene diamine tetra acetic acid) EDTA
بتاگلوکورونیداز (β-Glucuronidase) GUS
محیط کشت لوریا – برتانی (Luria-Bertani Medium) LB
محیط کشت موراشیگی و اسکوگ (Murashige and Skoog Medium – 1962) MS
نفتالن استیک اسید (Naphthalene acetic acid) NAA
ژن نئومایسین فسفوترانسفراز (Neomycin phosphotransferase gene) nptІІ
پلیوینیلپیرولیدون (Polyvinylpyrolidone) PVP
بافر سوکروز تریس اتیلن دی آمین تترا استیک اسید تریتون (Sucrose tris EDTA tritone buffer) STET
بافر تریس بورات اتیلن دیآمین تترا استیک اسید (Tris burate EDTA buffer) TBE
بافر تریس اتیلن دیآمین تترا استیک اسید (Tris EDTA buffer) TE
DNA منتقل شونده (Transferred DNA) T-DNA
تیدیازرون (Thidiazuron) TDZ
وزن / حجم (Weigh / Volume) W/V
فصل اول

1- مقدمهگل هدیه‌ای است به بشر از جانب خالق هستی و موهبتی است برای تعالی روان، اندیشه و خرد انسان. اگر نگاهی به تمدن چندین هزار ساله ایران داشته باشیم، نقش داریوش بزرگ در مجموعه تخت‌ جمشید که یک دسته گل در دست دارد نشان‌دهنده این است که فرهنگ مصرف گل از سال‌های دور در بین ایرانی‌ها مرسوم بوده است.
میخک بیش از ٢٠٠٠ سال است که به دست بشر کاشته می‌شود. این گل یکی از مهم‌ترین محصولات گلکاری دنیا می‌باشد که هم به جهت زیبایی و گوناگونی رنگ و هم از نظر اقتصادی از اهمیت قابل توجهی برخوردار است (لارسون، 1375؛ Burich, 1996). در ایران کشت و کار میخک از سال‌ها پیش متداول بوده است و در حال حاضر برای تولید گل بریدنی در سطح وسیع کشت می‌شود (خلیقی، 1380).
کوشش‌های وسیعی در سراسر جهان برای بهبود کمیت و کیفیت میخک در جریان است. امروزه اهداف بهنژادی آن شامل: افزایش دامنه رنگ گل‌ها، معرفی شکل‌های جدید گل‌ها، افزایش تحمل به نور کم و دامنه وسیع‌تر دما، بهبود شاخه‌دهی در انواع مینیاتور، افزایش پراکندگی تولید، طولانی کردن عمر پس از برداشت، قوی کردن ساقه، مقاومت به حشرات و بیماری‌ها و افزایش عطر آن می‌باشد (Bunt and Cockshull, 1985).

1-1- منشاءمیخک با نام علمی Dianthus caryophyllus L. یکی از گیاهان بسیار قدیمی است و پیشینه کشت و کار طولانی دارد (خلیقی، 1380). عقیده براین است که میخک بومی نواحی مدیترانه است (لارسون، 1375). میخک‌ها بومی نواحی سرد کوهستانی از جنوب اروپا تا هند می‌باشند. گونه‌های بومی آن تنها در فصل بهار به علت افزایش دما و طول روز گل می‌دهند (لارسون، 1375، Tutin et al, 1993). ارقام جدید میخک ویژگی پیوسته گلدهی داشته و در شمال‌غربی اروپا و آمریکای شمالی و در مناطق مدیترانه‌ای در گلخانه‌های پلاستیکی بدون سیستم گرمایش برای تولید گل بریدنی پرورش داده می‌شوند (Bunt and Cockshull, 1985) هم‌چنین در مناطق استوایی در صورت مناسب بودن عرض جغرافیایی که موجب کاهش دمای هوا می‌شود (مانند کلمبیا و کنیا) می‌تواند کشت شود (Bunt and Cockshull, 1985). بشر از قرن شانزدهم روی میخک بومی کار بهنژادی انجام داده است. بهنژادی برای پیوسته گلدهی نژاد میخک در سال ١٨۴٠ در فرانسه انجام و در سال ١٨۵٢ در آمریکا معمول شد. معروف‌ترین ارقام خارجی میخک از رقم ’William Sim‘ که در سال ١٩٣٨ یا ١٩٣٩ توسط ویلیام سیم تولید گردید، بدست آمده‌اند (خلیقی، 1380). میخک‌های امروزی شباهت بسیار کمی به اسلاف خود دارند. این میخک‌ها در تمام طول سال گل می‌دهند و دارای ساقه‌های بلند و محکم با گل‌های درشت و پُر پر و رنگ‌های گوناگون می‌باشند (لارسون، 1375).

1-2- اصطلاح‌شناسیدر حدود ٣٠٠ سال پیش از میلاد مسیح تئوفراستوس در باره میخک مطالبی نوشته است که ترجمه آن از زبان یونانی گل خدایان معنی می‌دهد که دلیل نامگذاری آن بوی خوش این گل است. نام زیرگونه‌های گونه caryophyllus به احتمال منشعب از واژه Coronation (تاجگذاری) می‌باشد، شاید به آن جهت که در اساطیر یونان تاج گلی از این گیاه برای قهرمانان درست می‌شده است (لارسون، 1375). نام انگلیسی میخک Carnation می باشد. این نام گرفته شده از واژه لاتین Carnis می باشد که اشاره به رنگ صورتی کم رنگ بعضی ارقام آن دارد (Brickell, 1997). در یونان Dianthus به معانی گل خوشبخت و گل خدایان می‌باشد. هم‌چنین عقیده براین است که نام Dianthus از واژه‌های یونانی Dios به معنای خدا و Anthus به معنای گل گرفته شده است )لارسون، 1375؛ Bunt and Marjorie, 1982).
1-3- انواع میخکبانت و کاکشول (Bunt and Cockshull, 1985) میخک را بر اساس شکل ساقه گل‌دهنده آن دسته‌بندی کردند. در نوع استاندارد ساقه گل‌دهنده منشعب نبوده و تنها یک گل انتهایی درشت در انتهای ساقه قرار دارد. در نوع دیگر گل‌های جانبی بیشتری تشکیل شده است که در پایان تولید یک ساقه منشعب گل‌دهنده می‌‌نماید. این دسته را مینیاتور می‌نامند. رقم‌های ویژه‌ای برای تولید نوع مینیاتورگزینش شده‌اند، ولی این ارقام در مقایسه با نوع استاندارد استحکام ساقه کمتری داشته و گل‌های کمتری در زمستان تولید می‌کنند.
Carnations و Pinks نام‌های متداول باغبانی برای گونه‌های مختلف جنس Dianthus می‌باشند. از انواع Pinks می‌توان به Cottage، Rockery، Annual و Cluster-head اشاره کرد.
گونه‌های متداول Pink شامل Dianthus plumarius، D. alpinus، D. sylvestris،D. chinensis ، D. deltrorides، D. superbus، D. armeria و … می‌باشند. این‌ها از D. barbatus به وجود آمده اند و به آسانی بوسیله برگ‌های شمشیری شکل و گل‌های خوشه‌ای تشخیص داده می‌شوند.
Carnations نیز به چندین نوع دسته‌بندی می‌گردند که سه نوع آن یعنی Annual carnation، Border carnation و Perpetual-flowering carnation بیشتر متداول هستند (Brickell, 1997). میخک زیر کشت با نام علمی Dianthus caryophyllus L. که به عنوان Wild carnation یا Clove pink شناخته می‌شود از اجداد Border carnations می‌باشد (Brickell, 1997).
١-4- گیاه‌شناسی و ریخت‌شناسی میخکاین گیاه متعلق به تیره میخک‌سانان می‌باشد. این تیره شامل ٨٠ جنس و ٢٠٠٠ گونه است که روی کره زمین پراکنده‌اند (صانعی شریعت پناهی، 1372).
چندین گونه از میخک به عنوان گیاه زینتی برای تزیین باغ، گل بریدنی و یا به عنوان گل گلدانی کشت می‌شوند، اما بیشترین گونه‌ای که به صورت تجاری کشت می‌شود گونه caryophyllus می باشد (Bunt and Cockshull, 1985). این گیاه چند ساله تابستان گل می‌باشد اما انواع یکساله یا دو ساله آن‌ها نیز وجود دارد، که به دلیل تولید گل‌های فراوان زیاد کشت می‌شوند. قرنفل که دو ساله است برای تزیین باغچه مناسب است (Brickell, 1997). گیاهان گونه caryophyllus علفی و دارای برگ‌های ساده و متقابل بوده که پهنک آن‌‌ها اغلب باریک است. گل‌آذین آن گرزن دو سویه است. گل ها دوجنسه بوده و گرده‌افشانی آن ها توسط حشرات انجام می‌گیرد. اغلب گیاهان این تیره دارای گلبرگ می‌باشند ولی جام گل حقیقی نبوده و از تغییر شکل نافه گل به وجود آمده است (Brickell, 1997). کاسگل میخک از پنج کاسبرگ بهم پیوسته تشکیل شده و به شکل لوله کوچکی قاعده گلبرگ‌ها را می‌پوشاند. جام گل از پنج گلبرگ تشکیل یافته که لبه آن‌ها به سمت خارج برگشته و دندانه‌دار است. تعداد پرچم‌های آن ١٠ عدد می باشد. مادگی از دو برچه بهم پیوسته تشکیل شده و دارای تخمک‌های متعدد است. میوه پوشینه است که از بالا شکاف خورده و بذر از آن بیرون می‌ریزد (صانعی شریعت پناهی، 1372 : وزوایی، 1375).
بلیک (Blake, 1962) گل کامل میخک را این گونه توصیف می‌کند: دارای دو جفت براکته که به یک کاسگل ۵ قسمتی متصل بوده و تشکیل یک فنجان ۵ دندانه‌ای می‌دهد. یک گل متوسط دارای ۶٠ گلبرگ (٢٠) و حداکثر ٣٠ پرچم می‌باشد و دارای یک تخمدان بزرگ ٢ تا ٣ برچه‌ای است.

١-5- روش‌های افزایش میخکافزایش این گیاه بیشتر به صورت رویشی و توسط قلمه‌گیری از ساقه‌های سبز آن صورت می‌گیرد. قلمه باید عاری از وجود بیماری‌ها، آفات و نماتد باشد. به همین منظور روش های پیشرفته‌ای در این زمینه به کار گرفته شده‌اند. کاشت بُرش نازکی از یک قلمه در محلول‌های مغذی برای تشخیص بیماری‌های آوندی و به کاربردن بلوک‌های هسته‌ای که کلیه گیاهان موجود در آن از طریق کاشت جوانه انتهایی تأمین می‌شود همگی جزیی از این روش ها می‌باشند (خلیقی،1380: Hartmann et al, 2002). افزایش از طریق بذر تنها در تولید ارقام جدید بکار می‌رود. D. barbatus و D. plumarius را به طور معمول با بذر می‌افزایند. هرچند که آن‌ها را می‌توان براحتی به روش قلمه در تابستان افزود، که در این صورت زودتر به گل می‌روند (Bunt and Cockshull, 1985). افزایش گونه‌های حاشیه‌ای به روش افکندن در اواخر تابستان صورت می‌گیرد از فنون کشت بافت و ریزافزایی نیز می‌توان برای تولید انبوه و هم‌چنین قلمه‌های عاری از بیماری استفاده نمود. (Brickell, 1997).
1-6- اهمیت و اهداف پژوهشمیخک یکی از محبوب‌ترین، اقتصادی‌ترین و مهم‌ترین گل های بریدنی به سبب پیوسته گلدهی (Mii, 1994) و رقم‌های چند رنگ و منحصر به فرد است (Dole and wilkins, 2005؛ Burich et al, 1996). این گیاه یکی از محصولات با ارزش برای صنعت گل بریدنی بوده و تقاضا برای ارقام جدید و بهبود یافته آن رو به افزایش است. به هر حال، تراریختی ژنتیکی میخک به تازگی به دلیل کمبود یک تکنیک معمول کارا محدود شده است. محدودیت‌های موجود در روش‌های بهنژادی سنتی (تلاقی و گزینش) و داشتن ویژگی‌های هتروزیگوسیتی بالا در این گیاه سبب شده است که کاربرد فنون جدید یاخته ای- مولکولی برای بهبود ویژگی‌های اقتصادی این گیاه ضرورت پیدا کند. کاربردی شدن فنون مولکولی خود نیازمند گسترش روش‌های مختلف کشت بافت است. به طور معمول یک یا چند ویروس، باکتری و یا قارچ قلمه‌های ساقه این گیاه را آلوده می‌کنند (لارسون، 1375). همچنین از دیگر مشکلات میخک می توان به از بین رفتن تعداد زیادی از قلمه های این گیاه در حین افزایش اشاره کرد. برخی از روش‌های کشت بافت و ریز افزایی می‌توانند مشکلات ناشی از ویروس، باکتری و سایر عوامل بیماری‌زا را برطرف ساخته و در تولید انبوه گیاهان یک شکل، عاری از بیماری و مناسب صدور به کشورهای اطراف به ما کمک ‌نمایند. همچنین از کشت بافت می‌توان به عنوان ابزاری برای انتقال ژن استفاده نمود و ویژگی‌های مطلوبی را گزینش و به گیاه منتقل کرد. در محصولات گلکاری انتقال ژن های گزارشگر مانند GUS با استفاده از Agrobacterium tumefaciens در داوودی، میخک(Lu et al, 1991) و ورد (Firoozabady et al, 1991) به دست آمده است. این بررسی ها ممکن است مدل های مفیدی زمانی که ژن های مطلوب به جای ژن های گزارشگر یا نشانگر گزینشگر به درون گیاهان هدف انتقال می یابند، ارائه دهد (Stachel et al, 1986). این پژوهش به منظور انجام کشت بافت دو رقم استاندارد و مینیاتور میخک و ارزیابی شرایط بهینه انتقال ژن با استفاده از tumefaciens Agrobacterium به آن ها صورت گرفته است.

فصل دوم

2- مروری بر پژوهش های پیشین2-1- ریزافزایی و کشت بافت میخک2-1-1- گزینش ریزنمونه و گندزدایی سطحی آناولین گام در هر برنامه کشت بافت موفق، گزینش یک منبع ریزنمونه مناسب و به دنبال آن تعیین بهترین تیمار گندزدایی است. به صورت فراگیر هر بافت یا اندام گیاهی را می توان به عنوان ریزنمونه به کار گرفت، اما درجه موفقیت به سیستم کشت به کار رفته، گونه کشت شده و حذف آلوده گرهای سطحی از ریزنمونه بستگی دارد. صالحی (ُSalehi, 2006)، تیمار گندزدایی سطحی مناسب برای ریزنمونه های نوک شاخساره میخک را چنین گزارش کرد: ریزنمونه ها پس از شستشوی ابتدایی به مدت 10 دقیقه در محلول شوینده (ریکا) قرار گرفته، سپس به مدت 1 ساعت در زیر آب جاری قرار داده شده و سپس به مدت 5/0 یا 1 دقیقه در اتانول 70% و به دنبال آن 15 دقیقه در کلراکس 10% گندزدایی شدند. دلجو و همکاران (Delju et al., 2006)، تیمار گندزدایی جهت جوانه های گل نابالغ 4 رقم میخک را شامل گندزدایی سطحی با اتانول 70% به مدت 30 ثانیه و استفاده از ماده شوینده تجاری 2% به مدت 20 دقیقه و در پایان 3 بار آبکشی با آب مقطر گندزدایی شده را مناسب تشخیص دادند. نانتاسواتسری و همکاران (Nontaswatsri et al 2002) شاخساره های 5 رقم میخک به طول 5 تا 8 سانتی متر را از گیاهان مادری رشد یافته در گلخانه جدا نموده و به مدت 15 دقیقه در محلول کلراکس 10% همراه با یک قطره Tween-20 قرار دادند، سپس 2 بار و هر بار 10 دقیقه در آب گندزدایی شده آبکشی گردیدند. آلتورست و همکاران (Altworst et al. 1994) از ریزنمونه های برگ به عنوان مواد شروع کننده برای باززایی گیاه استفاده کردند. در پژوهشی از بذرهای رقم ’Chabaud‘ میخک و رقم ’Tall Double Mix‘ قرنفل به عنوان ریزنمونه استفاده شد. بذرها نخست به مدت 3 تا 4 دقیقه در محلول کلرید نقره 1/0% گندزدایی سطحی شده و سپس 3 مرتبه با آب مقطر گندزدایی شده آبکشی شدند (Pareek and Kothari, 2003).
واتاد و همکاران (Watad et al. 1996) ریزنمونه های ساقه میخک را پس از گندزدایی سطحی به مدت 15 دقیقه در محلول هیپوکلریت سدیم 2% حاوی 01/0% Tween-20 و به دنبال آن 3 بار آبکشی هر بار به مدت 2 دقیقه با آب گندزدایی شده به کار بردند. مسگوئر و همکاران (Messeguer et al, 1993) از برگ و قطعات پایه ای گل و گلبرگ به عنوان ریزنمونه استفاده کردند. مسن ترین برگ ها دور ریخته شده و جوانه های گل و قلمه ها در محلول شوینده تجاری حاوی هیپوکلریت سدیم 5% به مدت 20 دقیقه گندزدایی سطحی شده و به دنبال آن 3 مرتبه با آب مقطر گندزدایی شده آبکشی گردیدند. آن ها بیان داشتند که گلبرگ های نابالغ و قطعات پایه ای گل ظرفیت ریخت زایی بالایی دارند.
آلتورست و همکاران (Altvorst et al, 1992) از برگ و گلبرگ گیاهان کشت بافتی به عنوان منبع ریزنمونه برای تشکیل شاخساره نابجا استفاده کردند. آن ها نتوانستند رابطه ای بین ظرفیت باززایی برگ ها و گلبرگ های ارقام مختلف پیدا کنند. باززایی از ریزنمونه های برگ بیشتر موفق بود و شاخساره ها در مدت کمتری از ریزنمونه های برگ نسبت به گلبرگ باززایی شدند.
کانتیا و کوساری (Kantia and Kothari, 2002) بیان داشتند که نوع ریزنمونه استفاده شده برای افزونگری همگروهی احتمال تغییرات ژنتیکی را تحت تأثیر قرار می دهد. ریزنمونه های برگ مواد مناسبی برای تشکیل شاخساره نابجا و آزمایشات انتقال ژن توسط اگروباکتریوم می باشند. آن ها همچنین بیان داشتند موقعیت (مکان) برگ ها روی گیاه در باززایی بعدی مهم می باشد و جوان ترین برگ ها تنها زیر مریستم انتهایی بهترین باززایی را نشان دادند.
2-1-2- ریخت زایی و باززایی باززایی گیاه، با کشت قطعه ای از بافت گیاهی عاری از بافت مریستمی از پیش تشکیل شده (منشأ نابجا)، یا از کشت یاخته ای و بافت پینه امکان پذیر است. باززایی گیاه به روش پرآوری جوانه جانبی بر مبنای وجود بافت مریستمی از پیش تشکیل شده می باشد. در مقابل، باززایی نابجا از مکان های غیرمعمول از یک بافت کشت شده مانند سطح برگ، لپه، میانگره، دمبرگ و … که بافت مریستمی به طور طبیعی در این مناطق وجود ندارد، صورت می پذیرد (Chawla, 2000). آلتورست و همکاران (Altvorst et al, 1995) نشان دادند که باززایی تنها در ناحیه انتقالی از ساقه به برگ یعنی پایه برگ امکان پذیر است. آن ها همچنین بیان داشتند که موقعیت یا مکان برگ روی گیاه برای باززایی بعدی دارای اهمیت است و جوان ترین برگ ها بیشترین توانایی باززایی را دارند. نانتا سواتسری و فوکای (Nontaswatsri and Fukai, 2005) نشان دادند که ریزنمونه های گره ای پتانسیل بیشتری برای تولید شاخساره نسبت به ریزنمونه های برگ دارند.
امیرعلی و همکاران (Amirali et al, 2008) پیشنهاد کردند که کاربرد مریستم انتهایی در مقایسه با مریستم گره ای برای پرآوری شاخساره مناسب تر است. آلتورست و همکاران (Altvorst et al, 1992)، جوان ترین برگ های گسترش یافته زیر مریستم انتهایی را مناسب ترین ریزنمونه برای باززایی تشخیص دادند.
مسگوئر و همکاران (Messeguer et al, 1993) نشان دادند که باززایی شاخساره تنها در نواحی پایه ای قطعه های گلبرگ امکان پذیر می باشد. فیشر و همکاران (Fisher et al. 1992) اثبات نمودند که شرایط کاشت بیش از ظرفیت ریخت زایی قسمت های مختلف گلبرگ برای باززایی شاخساره اهمیت دارند.
2-1-3- رویان زایی بدنی رویان زایی بدنی عبارتست از تشکیل رویان از یاخته های بدنی در شرایط درون شیشه ای به طوری که این رویان ها شبیه به رویان معمولی درون بذر می باشند و قادرند به صورت گیاه کامل نمو پیدا کنند. از این روش کشت بافت می توان به صورت ابزاری برای بررسی های پایه نظیر بیوشیمی، فیزیولوژی، مورفولوژی و تشریح که در بسیاری از دستاوردهای فناوری زیستی مانند انتقال ژن، حفظ ژرم پلاسم، تولید بذر مصنوعی، تولید متابولیت های ثانویه، ایجاد گوناگونی ژنتیکی و حذف ویروس از گیاه استفاده نمود (Chawla, 2000). گزارش های بسیاری نشان داده اند که گیاه میخک از راه تشکیل شاخساره نابجا روی ریزنمونه های مختلف مانند ساقه، برگ، گلبرگ، نهنج، تخمدان و تخمک باززایی شده است (Edtington et al. 1984)، در حالی که گزارش های اندکی در مورد باززایی این گیاه از راه رویان زایی بدنی انتشار یافته است (Fery et al, 1992،,1998 Vicient and Martinez). برخی اوقات رویان های بدنی نسبت به دیگر روش های افزایش رویشی مطلوب تر می باشند که به سبب احتمال تنظیم افزایش با استفاده از بیوراکتورها می باشد (Vicient and Martinez, 1998).
بیشتر رویان های بدنی یا کشت های رویانی می توانند در دمای 196- درجه سلسیوس نگهداری شوند (Von Arnold et al., 2002) که این روش امکان ایجاد بانک های ژنی را فراهم می سازد. افزون بر این، رویان زایی بدنی شرطی مهم برای شماری از ابزارهای فناوری زیستی برای بهبود ژنتیکی می باشد (Sankhla et al, 1995). همچنین رویان های بدنی نقشی کلیدی در روش های انتقال ژن بازی می کنند (Yantcheva et al, 1995.).
فری و همکاران (Fery et al, 1992) ایجاد رویان بدنی از پینه های حاصل از ریزنمونه های ساقه گیاه میخک را گزارش کردند. در این پژوهش ویژگی های ریخت شناسی و تشریحی پینه های غیر رویان زا و پینه های رویان زا به دست آمده از ریزنمونه های گلبرگ و رویان های بدنی گیاه میخک شرح داده شده است. دلجو و همکاران (Deljou, 2006)، اثر غلظت های مختلف سوکروز بر رویان زایی بدنی 4 رقم میخک را مورد بررسی قرار دادند. در پژوهش ایشان از ریزنمونه های گلبرگ ارقام میخک استفاده شد. در این پژوهش مشخص شد که با افزایش غلظت سوکروز در محیط کشت، رویان زایی بدنی گسترش می یابد. بیشترین میزان پینه های رویان زا، از محیط کشت دارای 9 و 12 درصد سوکروز به دست آمد، در حالی که در غلظت های بالاتر از 15 و 18 درصد کاهش یافت. نتایج این پژوهش نشان داد که غلظت های بالاتر سوکروز بلوغ رویان های بدنی را بهبود می بخشد.
از جمله عوامل مؤثر بر انگیزش رویان های بدنی و نمو بعدی گیاه می توان به موارد زیر اشاره کرد:
2-1-3-1- تنظیم کننده های رشدافزودن تنظیم کننده های رشد به ویژه اکسین و یا اکسین به همراه سیتوکینین برای شروع رشد و انگیزش رویان زایی ضروری است (Feher et al, 2003). به هر حال، نمو رویان در رویان های بدنی در نبود تنظیم کننده های رشد نیز گزارش شده است (Choi et al, 1998). انگیزاننده های غیر هورمونی همچنین برای افزایش رویان زایی بدنی استفاده می شوند. برخی از این انگیزاننده ها شامل غلظت های بالای سوکروز یا تنش اسمزی (Kamada et al, 1993)، یون های فلزات سنگین (Pasternak et al, 2002) و دمای بالا (Kamada et al, 1989) می باشد. دلجو و همکاران (Deljou, 2006) اثر مانیتول بر رشد رویان های بدنی تولید شده از پینه رویان زای میخک را بررسی کردند. آن ها بیان داشتند که در محیط کشت حاوی مانیتول بدون سوکروز رویان بدنی ایجاد نشد. اگر چه نقش دقیق مانیتول روی افزایش تعداد رویان ها از پینه های رویان زای میخک مشخص نیست اما با توجه به این که وجود سوکروز در محیط حاوی مانیتول برای رویان زایی ضروری است می توان نتیجه گرفت که اثر مانیتول روی افزایش تعداد رویان ها به عنوان منبع تأمین کربن مؤثر نبوده، بلکه به احتمال با تغییرات پتانسیل اسمزی ناشی از حضور مانیتول در ارتباط است. اثر 2,4-D و پس از آن NAA بر رویان زایی بدنی بیش از دیگر اکسین ها می باشد. آن ها در تسریع بلوغ رویان، به ویژه در رشد لپه ها مؤثر هستند. در برخی مواقع سیتوکینین ها برای رشد رویان و تبدیل آن به گیاهچه لازمند (Tanaka et al, 2000).
به هر حال، در داوودی کاینتین در ترکیب با یک اکسین به ویژه IAA برای تحریک رویان زایی بدنی گزارش شده است (Tanaka et al, 2000). تیدیازورون به تنهایی یا در ترکیب با دیگر تنظیم کننده های رشد برای تحریک رویان زایی بدنی در تعدادی از گونه های گیاهی گزارش شده است (Zhang et al, 2005).
اینتچوا و همکاران (Iantcheva et al, 2005) باززایی گیاه از راه اندام زایی مستقیم و رویان زایی بدنی دو رقم میخک مینیاتور را مورد بررسی قرار دادند. در این پژوهش محیط موراشیگی و اسکوگ (MS)( Murashige and Skoog, 1962) جامد حاوی BAP و NAA برای انگیزش مستقیم شاخساره های نابجا استفاده شد. محیط کشت مناسب برای باززایی هر دو رقم شامل محیط MS حاوی 9/0 میلی گرم در لیتر BAP و 9/0 میلی گرم در لیتر NAA بوده است. در این پژوهش وجود 2,4-D در ترکیب با BAP و کازیین هیدرولیزشده به طور موفقیت آمیزی در انگیزش پینه رویان زا مؤثر واقع شد.
2-1-3-2- محیط پینه زاییپینه یک بافت گیاهی کم و بیش سازمان نیافته است که در زخم های بافت ها و اندام های تمایز یافته، به وجود می آید. بنابراین پینه یک بافت سازمان نیافته با تمایز خیلی پایین است (Chawla, 2000). تشکیل پینه زیر تأثیر مواد تنظیم کننده رشد برون زا که به محیط کشت افزوده می شوند، قرار می گیرد. نوع ماده تنظیم کننده رشد مورد نیاز و غلظت مصرفی آن در محیط کشت به شدت به نژادگان و محتوای هورمونی درون ریزنمونه بستگی دارد (Chawla, 2000). در پژوهشی روی میخک تشکیل پینه روی محیط کشت MS دارای 30 گرم در لیتر سوکروز، 2 میلی گرم در لیتر2,4-D و 2/0 میلی گرم در لیتر BA حاصل شد (Karami and Kordestani, 2007 ).
آرچنا و کوتاری (Archana and Kothari, 2002) در بررسی برای تشکیل جوانه های شاخساره نابجا همراه با تشکیل پینه، از ریزنمونه های برگ میخک کشت شده روی محیط کشت MS حاوی 5/0 میلی گرم در لیتر BAP و 1 میلی گرم در لیتر 2,4-D استفاده کردند.
در پژوهش های بسیاری (Altvorst et al, 1996) اثر قسمت انتهای نزد پاهنگ برگ در باززایی تایید شده است. اینتچوا و همکاران (Iantcheva et al, 2005) پیشنهاد کردند که محیط کشت مناسب برای انگیزش پینه شامل MS جامد دارای 1 میلی گرم در لیتر 2,4-D، 2/0 میلی گرم در لیتر BAP، 3% سوکروز و 8 گرم آگار می باشد.

2-1-3-3- محیط ریشه زاییمحیط ریشه زایی استفاده شده برای ارقام میخک به شدت وابسته به نژادگان بوده و نمی توان محیطی عمومی برای ریشه زایی همه ارقام پیشنهاد نمود (Messeguer et al, 1993؛ Salehi 2005). میروشنچنکو و دولگوو (Miroshnichenko and Dolgov, 2000) محیط MS نیم غلظت دارای 7% آگار و 10 گرم در لیتر سوکروز را مناسب ریشه زایی ریزنمونه های برگ و گلبرگ گندزدایی شده رقم 12’Dia ‘ تشخیص دادند. آرچنا و کوتاری (Archana and Kothari, 2002) برای تشکیل ریشه از ریزنمونه های برگD. chinensis L. محیط MS نیم غلظت دارای 5/0 میلی گرم در لیتر IAA را پیشنهاد نمودند. بهترین محیط ریشه زایی با استفاده از شاخساره های پرآوری شده از ریزنمونه های مریستم انتهایی و مریستم تک گره شامل محیط MS با 1 میلی گرم در لیتر NAA تشخیص داده شد. در پژوهشی توسط اینتچوا و همکاران (Iantcheva et al, 2005) تشکیل گیاهان با پدیدگان معمولی و ریشه دهی آسان روی محیط MS حاوی 05/0 میلی گرم در لیتر BAP و 250 میلی گرم در لیتر کازیین هیدرولیز شده به دست آمد.
آلتورست و همکاران (Altvorst et al, 1992) محیط مناسب برای انگیزش ریشه در شاخساره های پرآوری شده از ریزنمونه های برگ میخک انواع ’Sim‘، ’ Mediterrenean ‘، ’ ‘Spray و ’Diantini ‘را محیط MS محتوی 1/0 میلی گرم در لیتر NAA گزارش نمودند. در بررسی بهترین محیط ریشه زایی برای شاخساره های پرآوری شده از ریزنمونه های برگ گونه های میخک، محیط MS همراه با 1 میلی گرم در لیتر NAA گزارش شد.
صالحی (Salehi 2005) بیان داشت که ممکن است بتوان یک محیط عمومی برای پرآوری شاخساره ارقام میخک ارائه نمود، اما برای ریشه زایی بیان چنین روش کاری امکان پذیر نیست. بر این اساس در این پژوهش بهترین



قیمت: 11200 تومان

Leave a Reply

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *