پایان نامهi– (203)

دانشگاه آزاد اسلامی
واحد دامغان
دانشکده کشاورزی
پایان نامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد در رشته مهندسی کشاورزی علوم باغبانی
گرایش فیزیولوژی و اصلاح گیاهان دارویی ومعطر
عنوان
بررسی تغییرات اسانس حاصل از گیاه بهلیمو در شرایط کشت بافت و مزرعه
استاد راهنما
دکتر کمال قاسمی بزدی
استاد مشاور
دکتر بهاره کاشفی
نگارنده
میثم گل‌پرور
زمستان 1392
سپاسگزاری
سپاس خدای را که سخنوران، در ستودن او بمانند و شمارندگان، شمردن نعمت‌های او ندانند و کوشندگان، حق او را گزاردن نتوانند. و سلام و دورد بر محمّد و خاندان پاک او، طاهران معصوم، هم آنان که وجودمان وامدار وجودشان است…
بدون شک جایگاه و منزلت معلم، اجّل از آن است که در مقام قدردانی از زحمات بی‌شائبه‌ی او، با زبان قاصر و دست ناتوان، چیزی بنگاریم. اما از آنجایی که تجلیل از معلم، سپاس از انسانی است که هدف و غایت آفرینش را تامین می‌کند و سلامت امانت‌هایی را که به‌دستش سپرده‌اند، تضمین؛ برحسب وظیفه: ازپدر و مادر عزیزم این دو معلم بزرگوارم، که همواره بر کوتاهی و درشتی من، قلم عفو کشیده و کریمانه از کنار غفلت‌هایم گذشته‌اند و در تمام عرصه‌های زندگی یار و یاوری بی چشم داشت برای من بوده‌اند؛ از استاد با کمالات و شایسته؛ جناب آقای دکتر کمال قاسمی بزدی که در کمال سعه صدر، با حسن خلق و فروتنی، از هیچ کمکی در این عرصه بر من دریغ ننمودند و زحمت راهنمایی این رساله را بر عهده گرفتند؛ از استاد صبورم ، سرکار خانم دکتر بهاره کاشفی که زحمت مشاوره این رساله را در حالی متقبل شدند که بدون مساعدت ایشان، این پروژه به نتیجه مطلوب نمی‌رسید؛ و از استاد فرزانه و دلسوز؛ جناب آقای دکتر شهرام رضوان بیدختی که زحمت داوری این رساله را متقبل شدند؛ از همسر خوب و مهربانم که با دلگرمی در پیشرفت این مرحله از زندگی‌ام همراهم بودند و همچنین تمامی دوستان گرامی که در امر نگارش این رساله یاری‌ام نمودند کمال تشکر و قدردانی را دارم.
باشد که این حقیر، بخشی از زحمات آنان را سپاس گوید .
فهرست مطالب
عنوان صفحه
چکیده ……………………………………………………………………… 1
فصل اول: مقدمه و کلیات 1-1 گیاهان دارویی …………………………………………………………… 2
1-1-1 اهمیت کشت گیاهان دارویی ……………………………………………… 2
1-1-2 تاریخچه گیاهان دارویی …………………………………………………. 3
1-2 به‌لیمو …………………………………………………………………… 5
1-2-1 تاریخچه و معرفی بهلیمو………………………………………………….. 5
1-2-2 بهلیمو (Lemon verbena) از نظر ردهبندی گیاهی ……………………………….. 6
1-2-3 گیاهشناسی بهلیمو ………………………………………………………. 6
1-2-4 نامهای دیگر بهلیمو ……………………………………………………… 6
1-2-5 گونه‌های دیگر به‌لیمو ……………………………………………………. 6
1-2-6 منشأ و پراکنش بهلیمو در ایران ……………………………………………. 7
1-2-7 اهمیت اقتصادی بهلیمو …………………………………………………… 8
1-2-8 روش پرورش گیاه بهلیمو ………………………………………………… 8
1-2-9 زمان جمعآوری بهلیمو …………………………………………………… 9
1-2-10 خواص دارویی و کاربردهای بهلیمو ……………………………………….. 10
1-2-11 مواد تشکیلدهنده اسانس بهلیمو ………………………………………….. 10
1-2-12 فرمولهای شیمیایی و شکل نمایی از برخی مواد تشکیل دهندهی اسانس به‌لیمو …….. 11
1-3 کشت بافت ……………………………………………………………… 12
1-3-1 کشت کالوس ………………………………………………………….. 14
1-3-2 تولید متابولیتهای ثانویه ………………………………………………… 14
1-3-3 باززایی گیاه …………………………………………………………… 15
1-4 کشت بافت گیاهان دارویی ………………………………………………….. 15
1-5 اهمیت تکثیر بهلیمو از طریق کشتبافت ……………………………………….. 17
1-6 اهداف تحقیق ……………………………………………………………. 17
فصل دوم: مروری بر تحقیقات انجام شده 2-1 گیاهان دارویی …………………………………………………………… 18
2-2 کشت بافت بهلیمو ………………………………………………………… 20
2-3 کشت بافت در سایر گیاهان …………………………………………………. 21
2-4 میزان ماده موثره بهلیمو ……………………………………………………… 22
2-5 خواص ضدمیکروبی بهلیمو ………………………..………………………… 23
2-6 تغذیه و کودهای زیستی ……………………………………………………. 24
فصل سوم: مواد و روش‌ها 3-1 زمان و مکان انجام آزمایش ………………………………………………….. 30
3-2 مواد گیاهی ……………………………………………………………… 30
3-3 عملیات کشت بافت ……………………………………………………….. 30
3-3-1 ترکیبات هورمونی بکار رفته در محیط کشت …………………………………. 30
3-3-2 طرز تهیه محلول‌های ذخیره‌ای ترکیبات محیط کشت …………………………… 31
3-3-3 آمادهسازی تنظیم کنندههای رشد گیاهی ……………………………………… 32
3-3-3-1 تهیه محلول پایه BAP ………………………….……………………… 32
3-3-3-2 تهیه محلول پایه کینتین …………………………….…………………… 32
3-3-3-3 تهیه محلول پایه2,4-D …………………………….………………….. 32
3-3-3-4 تهیه محلول پایه NAA……………………………..…………………… 32
3-3-4 آماده‌سازی محیط کشت‌های مختلف ………………….……………………… 32
3-3-4-1 آماده سازی محیط کشت جامد ……………………………….…………… 34
3-3-4-2 آماده سازی محیط کشت مایع …………………………….……………… 34
3-3-5 تهیه و سترون سازی ریزنمونههای بهلیمو ……………………………………. 34
3-3-6 کشت ریزنمونههای بهلیمو ……………………………………………….. 35
3-3-7 روش یادداشتبرداری و صفات مورد مطالعه …………………………………. 35
3-3-8 تجزیه و تحلیل آماری …………………………………………………… 36
3-4 کشت آزمایش مزرعه‌ای به‌لیمو ………………………………………………. 36
3-4-1 آمادهسازی مزرعه ……………………………………………………….. 36
3-4-2 آزمایش خاک …………………………………………………………… 37
3-4-3 تهیه و انتقاال نهالهای بهلیمو ……………………………………………… 37
3-4-5 آبیاری مزرعه …………………………………………………………… 37
3-4-6 اعمال تیمارهای کودی ……………………………………………………. 37
3-4-7 یادداشتبرداری صفات مورد مطالعه ………………………………………… 38
3-4-8 روش برداشت و خشککردن بهلیمو …………………………..……………. 38
3-4-9 اسانسگیری …………………………………………………………… 39
3-4-10 تجزیه و تحلیل آماری طرح مزرعه …………………………………………. 40
فصل چهارم: نتایج و بحث 4-1 نتایج حاصل از کشت ریزنمونههای به‌لیمو برروی محیط کشتهای MS حاوی 4 نوع ترکیب هورمونی NAA و BAP …………………………………………..……………… 41
4-2 نتایج حاصل از کشت ریزنمونههای به‌لیمو برروی محیط کشتهای MS حاوی 6 نوع ترکیب هورمونی NAA و 2,4-D وBAP و کینتین …………………………………………… 45
4-3 نتایج حاصل از کشت ریزنمونههای به‌لیمو برروی محیطکشتهای MS حاوی 5 نوع ترکیب هورمونی NAA و BAP ………………………………………………..………… 48
4-4 نتایج بهترین حالت‎های کشت بافت برای گیاه به‌لیمو در شرایط آزمایشگاهی…………………. 52
4-5 نتایج حاصل از بررسی تاثیر کودی بر عملکرد و خصوصیات مورفولوژیکی بهلیمو در شرایط مزرعه ………………………………………………………………………. 52
4-4-1 آزمون خاک …………………………………………………………… 52
فصل پنجم: نتیجه‌گیری 5-1 نتیجه‌گیری و جمع‌بندی …………………………………………………….. 55
5-2 نتایج آزمایش‌های درون شیشه‌ای …………………………………………….. 55
5-2-1 آزمایش اول …………………………………………………………… 55
5-2-2 آزمایش دوم …………………………………………………………… 58
5-2-3 آزمایش سوم …………………………………………………………… 60
5-3 آزمایش مزرعه‌ای …………………………………………………………. 61
5-4 پیشنهادات ……………………………………………………………….. 63
فهرست منابع ………………………………………………………………… 64
چکیده انگلیسی ………………………………………………………………. 69
فهرست جداول
عنوان صفحه
جدول 3-1 نوع و غلظت ترکیبات بکاررفته در محیط کشتهای مورد استفاده در تحقیق …….. 31
جدول 3-2 مواد تشکیلدهنده محلولهای پایه جهت تهیه محیط کشت MS بههمراه ویتامینهای B5 ………………………………………………………………………… 33
جدول 4-1 نتایج تجزیه واریانس حاصل از بررسی تاثیر زمان یادداشتبرداری و ترکیبات هورمونی محیط کشت و اثرات متقابل این عوامل بر میزان ریشهزایی، ساقهزایی، کالوسزایی، زندهمانی، تغییررنگ و تغییر شکل گیاه بهلیمو ………………………………………… 41
جدول 4-2 نتایج مقایسه میانگین حاصل از بررسی تاثیر زمان یادداشتبرداری بر واکنش ریزنمونههای بهلیمو به روش آزمون LSD…………………………………………. 42
جدول 4-3 نتایج مقایسه میانگین حاصل از بررسی تاثیر ترکیبات مختلف هورمونی بر واکنش ریزنمونههای بهلیمو به روش آزمون LSD………………………………………….. 42
جدول 4-4 نتایج مقایسه میانگین حاصل از بررسی اثر متقابل زمان یادداشتبرداری و ترکیبات هورمونی محیطکشت در واکنش ریزنمونههای بهلیمو به روش آزمون LSD……………….. 44
جدول 4-5 نتایج تجزیه واریانس حاصل از بررسی تاثیر زمان یادداشتبرداری و ترکیبات هورمونی محیط کشت و اثرات متقابل این عوامل بر میزان ریشهزایی، ساقهزایی، کالوسزایی، زندهمانی، تغییررنگ و تغییر شکل گیاه بهلیمو ………………………………………… 45
جدول 4-6 نتایج مقایسه میانگین حاصل از بررسی تاثیر زمان یادداشتبرداری بر واکنش ریزنمونههای بهلیمو به روش آزمون LSD…………………………………………. 46
جدول 4-7 نتایج مقایسه میانگین حاصل از بررسی تاثیر ترکیبات مختلف هورمونی بر واکنش ریزنمونههای بهلیمو به روش آزمون LSD …………………………………………. 46
جدول 4-8 نتایج مقایسه میانگین حاصل از بررسی اثر متقابل زمان یادداشتبرداری و ترکیبات هورمونی محیطکشت در واکنش ریزنمونههای بهلیمو به روش آزمون LSD………………. 48
جدول 4-9 نتایج تجزیه واریانس حاصل از بررسی تاثیر زمان یادداشتبرداری و ترکیبات هورمونی محیط کشت و اثرات متقابل این عوامل بر میزان ریشهزایی، ساقهزایی، کالوسزایی، زندهمانی، تغییررنگ و تغییر شکل گیاه بهلیمو ……………………………………….. 49
جدول 4-10 نتایج مقایسه میانگین حاصل از بررسی تاثیر زمان یادداشتبرداری بر واکنش ریزنمونههای بهلیمو به روش آزمون LSD………………………………………….. 49
جدول 4-11 نتایج مقایسه میانگین حاصل از بررسی تاثیر ترکیبات مختلف هورمونی بر واکنش ریزنمونههای بهلیمو به روش آزمون LSD…………………………………………… 50
جدول 4-12 نتایج مقایسه میانگین حاصل از بررسی اثر متقابل زمان یادداشتبرداری و ترکیبات هورمونی محیطکشت در واکنش ریزنمونههای بهلیمو به روش آزمون LSD……………….. 51
جدول 4-13 جدول مربوط به آزمون خاک قبل و بعد از اعمال تیمارهای کودی ……………. 53
جدول 4-14 نتایج تجزیه واریانس حاصل از بررسی تاثیر تیمارهای مختلف کود ازت و NPK بر عملکرد و تعدادی از خصوصیات مورفولوژیکی گیاه بهلیمو …………………………… 54
جدول 4-15 نتایج مقایسه میانگین حاصل از بررسی اثر تیمارهای مختلف کودی بر روی تعدادی از خصوصیات مورد بررسی گیاه به‌لیمو به روش آزمون LSD………………………….. 54
فهرست شکل‌ها
عنوان صفحه
شکل 1-1 نمایی از گیاه به‎لیمو به همراه گل‌های سفید…………………………………….. 5
شکل 1-2 فرمول شیمیایی برخی از مواد تشکیل دهنده‌ی اسانس به‌لیمو …………………… 12
شکل 3-1- تهیه‌ی و آماده‌سازی هورمون‌ها جهت اضافه کردن به محیط کشت‌های جامد و مایع… 32
شکل 3-2 کشت به‌لیمو در محیط‌های کشت مایع و جامد ……………………………… 34
شکل 3-3- کشت به‌لیمو در شیشه‌های کشت .………………………………………. 35
شکل 3-4 زمان یادداشت‌برداری از ریزنمونه‎های رشد یافته به‌لیمو ….…………………… 36
شکل 3-5 بستر آماده شده جهت کشت به‌لیمو پس از شخم زدن مزرعه …………………… 37
شکل 3-6 نمایی از کرت‎های مختلف به‎لیمو پس از استقرار در مزرعه …………………… 38
شکل 3-7 یادداشتبرداری صفات مورد مطالعه به‌لیمو در کرت‎های حاوی تیمارهای مختلف کودی ………………………..……………………………………………… 38
شکل 3-8 برداشت به‌لیمو به صورت شاخه بریده و برگ‌های خشک شده ………………… 39
چکیده
جنس Lippia دارای بیش از 200 گونه است که در این بین گونه Lippia citriodora L. دارای ارزش بالای دارویی میباشد. این گیاه به دلیل اهمیت فراوان اقتصادی در صنایع غذایی، داروسازی و عطرسازی در قسمت‌های مختلفی از ایران کشت و کار میشود و گونههای بومی نیز از جنس Lippia در مناطق گرمسیری و نیمهگرمسیری کشور وجود دارد. بدین منظور دو آزمایش جداگانه در شرایط درون شیشه‌ای و مزرعه‌ای انجام شد. در شرایط آزمایشگاهی سه آزمایش جداگانه با استفاده از طرح کاملا تصادفی با 4 تکرار انجام شد و در آن اثر 13 تیمار مختلف هورمونی (BAP، NAA، 2,4-D و کینتین) و اثر زمان بر میزان کالوس‌زایی و باززایی ریزنمونه‌های به‌لیمو بررسی گردید. با توجه به نتایج تجزیه واریانس در آزمایش درون شیشه‌ای در غلظت‎های مختلف هورمونی، صفت‎های ریشه‎زایی، ساقه‎زایی، کالوس‎زایی، تغییررنگ، تغییرشکل در سطح یک درصد معنی‌دار شدند. در مقایسه‌ی میانگین بین تیمارهای مورد بررسی مشخص شد که محیط کشت MS12 حاوی 3/0 میلی‌گرم بر لیتر اکسین NAA بدون سیتوکنین برای صفت‌های ریشه‌زایی، کالوس‌زایی، زنده‌مانی، تغییر رنگ و تغییرشکل به‌ترتیب با 8/63، 6/91، 100، 2/97 و 2/92 درصد بهترین تیمار هورمونی بود، ولی در مورد ساقه‌زایی، محیط کشت MS بدون هورمون با 3/68 درصد بیشترین تعداد نوساقه‌ها را ایجاد نمود. در آزمایش مزرعه‌ای نیز از بین چهار سطح کودی مختلف شامل صفر، 50 و 100 کیلوگرم در هکتار ازته و غلظت سه در هزار NPK بر روی صفات مورفولوژیکی و میزان عملکرد گیاه بهلیمو، تیمار 50 کیلوگرم در هکتار کود ازته بهترین نتایج را در بر داشت.
کلید واژه: به‌لیمو، کالوس‌زایی، ساقه‌زایی، ریشه‌زایی، ترکیبات هورمونی، کود ازته.
فصل اول
مقدمه و کلیات
1-1 گیاهان دارویی
1-1-1 اهمیت کشت گیاهان دارویی
با ظهور داروهای شیمیایی و بیولوژیک، نقش و اهمیت گیاهان دارویی در تأمین سلامت بشر، در معرض فراموشی قرار گرفت. اما با گذشت زمان، استقبال از گیاهان دارویی با رشد قابل توجهی روبرو شده است. بهنظر میرسد مردم جهان از یک سری نارساییهای طب مدرن خسته شدهاند و به‌طور روز افزون به‌سمت داروهای گیاهی روی میآورند. اصولاً زمانی که قانون ابنسینا را در غرب به آتش کشیدند و ادعا کردند شیمی، مولکول و فیزیولوژی را شناختهاند، طب به انحراف کشیده شد. بهطوری که هماکنون طب مدرن توانایی حل بسیاری از مشکلات بشر را ندارد و طی سالهای اخیر در کتب درسی به این موضوع اعتراف کردهاند. بههمین دلیل، امروزه حدود 50 درصد داروهای تولید شده در جهان منشاء طبیعی دارند که با تغییراتی بهعنوان دارو مورد استفاده قرار میگیرند. که نیمی از این مقدار از منابع معدنی، حیوانی و باکتریایی بدست میآید و نیمی دیگر منشاء گیاهی دارد. برای مثال، تمام هورمونهای مصرفی گیاهی هستند و از گیاهان مختلفی نظیر سیبزمینی مکزیکی، شنبلیله و غیره بهدست میآیند. همچنین ترکیباتی مثل وینبلاستین و وینکریستین که از داروهای ضدسرطان هستند از گیاه بدست میآیند و یا گلیکوزیدهای قلبی از جمله این گروه داروها محسوب میشوند (قاسمی دهکردی و همکاران، 1380).
گیاهان دارویی یکی از مهم‌ترین منابع دارویی میباشند که از هزاران سال پیش کاربرد داشتهاند. سازمان بهداشت جهانی تخمین زده است که بیش از 80 درصد از مردم بهصورت سنتی و یا مدرن از گیاهان دارویی استفاده میکنند. بعلاوه برخی از داروهای شیمیایی نیز با الگوبرداری از مواد گیاهی ساخته شدهاند (تریپاتی و تریپاتی، 2003).
در قرن اخیر دانشمندان به زیانهای ناشی از سموم شیمیایی، مواد افزودنی، اسانس و طعمدهندههای مصنوعی کاملاً پیبردهاند و بروز انواع سرطانها و بیماریهای مختلف تأییدکننده این موضوع میباشند. بر این اساس کشورهای پیشرفته که دارای امکانات تحقیقاتی گسترده‌ای در مورد شناسایی این مواد مضر بوده‌اند، تصمیم گرفتهاند که در چند سال اخیر کلیهی مواد مصرفی شیمیایی را از مواد غذایی، دارویی، آرایشی و بهداشتی بتدریج حذف نموده و بجای آن از منابع گیاهی استفاده کنند .کشور ما دارای غنیترین منابع گیاهی از نظر مقدار و تنوع در سطح جهان میباشد .هماکنون کشورهای پیشرفته پی به ارزش گیاهان دارویی و صنعتی برده و درصدد کشت و پرورش آنها در سایر کشورهای فقیر شدهاند. شناسایی گیاهان اسانسدار گامی مهم در جهت اهلی کردن و ترویج شیوههای صحیح بهرهبرداری و استفاده از این گیاهان می‎باشد. گیاهان دارویی اسانسدار نقش مهمی در زندگی انسان دارند و در ایران از سابقه طولانی برخوردار میباشند (موسویان و بصیری، 1378).
در گذشته گیاهان دارویی جمعآوری شده از طبیعت برای رفع نیازهای بازار کافی بود، طی سالیان گذشته تعدادی از گونههای پرمصرف در خطر انقراض قرار گرفتهاند، برای رفع نیازهای فزاینده به داروهای گیاهی، گیاهان بایستی کشت شوند، علاوه بر اطمینان از منابع کافی کشت گیاهان دارویی باعث تولید مواد خام دارویی با کیفیت یکنواخت و خصوصیات شناخته شده میگردد. از سوی دیگر تامین مواد اولیه برای صنایع داروسازی نیاز به افزایش تولید محصول در واحد سطح دارد که علمیترین و اقتصادیترین روش دستیابی بهاین مهم افزایش کارایی نهادههای مورد استفاده در زراعت گیاهان دارویی میباشد (توماس، 2000).
کشت یک گیاه دارویی از نظر اقتصادی وقتی مقرون بهصرفه است که متابولیتهای ثانویه آن بهحد مطلوب رسیده باشد، با شناخت عوامل محیطی موثر در تولید و انتخاب ارقام گیاهی مناسب میتوان بهحد اکثر مقدار محصول دست یافت (امیدبیگی، 1386). در مناطقی مثل ایران وجود نور فراوان یکی از منابع مهم و بالقوه در تولید گیاهان دارویی است که باید یا مناسبترین روشها از آن استفاده کرد (امیدبیگی، 1386). در شرایطی که هیچگونه محدودیت عوامل محیطی وجود نداشته باشد، تولید ماده خشک گیاهی با مقدار نور جذب شده متناسب است (مونتیس، 1994).
1-1-2 تاریخچه گیاهان دارویی
با نظری اجمالی به فرهنگ مصرف داروهای گیاهی در ایران میتوان متوجه میراث با ارزش این گیاهان در طب غنی سنتی ایران شد. از طرفی فلات وسیع ایران از اقلیمها و محیطهای گوناگون برخوردار است، بههمین دلیل بیش از 7500 گونه گیاهی مختص به ایران است. از این رو بهحق، فلور ایران یکی از منابع داروخیز جهان محسوب میشود. از آنجایی که گیاهان وحشی در محدودههای جغرافیایی گستردهای یافت میشود، جمعآوری و دسترسی به آنها از نظر اقتصادی مقرون بهصرف نیست و استفاده از گیاهان وحشی جوابگوی صنایع داروسازی نخواهد بود و چنین استفادهی انبوه از گیاهان طبیعت مسلماً موجب نابودی آنها خواهد شد. از این رو نسبت به کشت این گیاهان در سطوح زراعی اقدامات مفیدی در سطح کشور انجام شده است. گزارش شده است که انسان دیر و یا زود چارهای بهجز بازگشت به طبیعت خود نخواهد داشت. از این رو، در کشورهای توسعه یافته اقدامات وسیعی را در توسعه و پیشرفت کشت و استفاده از گیاهان دارویی انجام شده است. امید است در کشور ما با تربیت نیروی متخصص و فرهنگسازی استفاده از گیاهان دارویی، از این نعمت الهی بینصیب نمانیم (ابراهیمپور و عیدیزاده، 1388).
ابنسینا، دانشمند و پزشک نامدار ایرانی در سالهای 428-370 هجری مطابق با 980-1037 میلادی که در غرب او را بهنام آویسینیا می‌شناسد و پس از انقراض تمدن یونان او را بزرگ‌ترین دانشمند جهان و به اشتباه، عرب دانستهاند (چون کتابهای او به عربی نوشته شده است). در جلد دوم کتاب قانون فیالطب بیش از 800 نمونه گیاه طبی و غذایی را نام میبرد که از آن میان 541 گیاه و مشتقات آنها دارای توصیف کاربردی و صفات ریختشناختی هستند. او اختلاف شکل و صفات گیاهان مشابه یا نزدیک به هم را (برای اجتناب اشتباه آنها از یکدیگر) با توجه خاصی در کتاب “قانون” توضیح میدهد و در مورد چگونگی استفاده از مشتقات گیاهان دارویی و کاربرد آنها، با ترتیبی خاص، معین و نظام یافته به شرح و تفصیل آنها میپردازد (زارعزاده، 1383).
آلبرت ماگنیوس این کشیش که در نوشته‌ها به آلبرت بوستادت بیشتر معروف است، در سال‌های 1193-1280، بعد از ابنسینا و بیرونی در ایام و بحران فکری قرون وسطی اروپا، درباره طب و تاریخ طبیعی و همچنین گیاهشناسی کتابی به نام رستنیها، دو وژتابلیس را نوشت. محتویات و نحوه نگارش این کتاب، به خوبی نشان میدهد که آلبرت کبیر نیز تحت تأثیر شدید تئوفراست و دیگر دانشمندان و قدمای رم و یونان مورد قبول کلیسا قرار داشت و در عین حال، برخی مشاهدات خود را نیز در این کتاب آورده است (زارعزاده، 1383).
ایرانیان از دیرباز و حتی پیش از دیگران در زمینه گیاهان دارویی و کاربرد درمانی آنها از دانش پیشرفته‌ای برخوردار بودهاند. نمونه بارز آن کتاب باستانی اوستاست .در«وندیداد» یکی از پنج کتاب تشکیلدهنده اوستا (که در مجموع دستکم 2500 سال پیشینه دارد)، بخشهای پرشماری به گیاه درمانی، معرفی گیاهان دارویی و کاربرد آنها اختصاص یافته است. اما متأسفانه در لشکرکشی اسکندر مقدونی، کتابخانه مشهور اسکندریه در آتشسوزی عمدتاً نابود شد و بیشتر منابع و آثار و کتابهای جمعآوری شده در آن سوخت و خاکستر شد. بدین ترتیب، سوابق گیاهشناسی شرق کهن در دو تمدن ایران و مصر بر اثر این آتشسوزیها، فاقد هر گونه مدرک دیرینه شناخت گیاهان دارویی و خواص آنها گردید. متأسفانه بعدها نیز بر اثر تخریب قلاع فرقه اسماعیلیه و آتش زدن کتابخانههای آن بوسیله هلاکوخان مغول، بقیه آثار مکتوب گیاهان دارویی، که توسط این فرقه جمعآوری شده بود، از میان رفت، تا اینکه در قرن هشتم و نهم میلادی، اطباء ایرانی رونق خاصی به طبابت ایران و جهان بخشیدند. بطوریکه با پیدا شدن دانشمندان و نوابغی نظیر ابوعلیسینا و محمد زکریای رازی با انشار کتابهای معروف خود (قانون و الحاوی) پیشرفتهای زیادی نصیب ملت ایران و جهانیان گردید. این پیشرفتها همچنین در قرون بعد نیز ادامه یافت. در قرن 13 میلادی، ابنبیطار، اختصاصات متجاوز از 1400 گیاه را که خود شخصاً میشناخت را در کتابش شرح داد (دوازده امامی، 1386؛ زارعزاده، 1383).
1-2 به لیمو
1-2-1 تاریخچه و معرفی بهلیمو
گیاه بهلیمو (شکل 1-1) با نام علمی Lippia citriodoraاز خانواده شاهپسند (Verbenaceae) (مظفریان، 1389؛ زرگری، 1375)، این گیاه بومی آمریکای جنوبی است (زرگری، 1375) و بهنام پزشک گیاهشناسی موسوم به Lippi که در سالهای 1678 تا 1704 میلادی میزیسته و در حبشه بهقتل رسید، نامگذاری شده است (زرگری، 1375). در فرهنگ گیاهدرمانی ایران، برگهای این گیاه بهصورت دمکردنی بهمنظور آرامبخش، ضدتشنج و برطرفکننده تپش قلب و سرگیجه مصرف دارد (امین، 1388). تا 100 سال پیش فقط بهعنوان یک گونه زینتی شناخته میشد، ولی امروزه بهدلیل اهمیت فراوان اقتصادی آن در صنایع غذایی و عطرسازی در اکثر کشورها از جمله در ایران و به ویژه در استان گلستان کشت شده و به خوبی پرورش مییابد. امروزه این گیاه در شمال کشورمان کشت و کار میشود و گونههای بومی آن از جنس Lippia در مناطق گرمسیری و نیمه‌گرمسیری کشورمان وجود دارد (امین، 1370).

شکل 1-1: نمایی از گیاه به‎لیمو به همراه گل‌های سفید
1-2-2 بهلیمو (Lemon verbena) از نظر ردهبندی گیاهی
به‌لیمو از سلسلهی Planta، شاخهی Magnoliophyta، ردهی Magnoliopsida، راستهی Lamiales، خانواده Verbenaceae، جنس Aloysia، و گونهی A. triphylla، است(آنونیموس، 2007).
1-2-3 گیاهشناسی بهلیمو
بهلیمو درختچهای کوچک به ارتفاع تا 90-100 سانتیمتر، با شاخههای شیاردار و کم و بیش زبر برگها در چرخههای 3 یا 4 تایی، سرنیزهای، بهطول 5- 5/7 سانتیمتر، با دمبرگ کوتاه، کامل یا در میانه دندانهدار، بدون کرک، در سطح تحتانی بهانبوهی پوشیده از کرکهای غدهدار (منقوط)، با بوی لیمو سنبلهها چرخهای و محوری یا مجتمع شده در پانیکولهای انتهایی اغلب 3 تایی. گلها سفید، به طول 5/4- 5 میلیمتر، شکوفا و گلدهنده در تابستان و پاییز. کاسه گل به انبوهی کرکدار. لوله جام گل بلندتر از کاسه (زرگری، 1375).
1-2-4 نامهای دیگر بهلیمو
برای به‌لیمو نام‌های دیگری نیز در منابع ذکر شده است که به تعدادی از آن‌ها اشاره می‌شود.
Lippia citriodora Kunth (آزادبخت، 1378؛ زرگری، 1371؛ کریمی، 1381؛ یزدانی و همکاران، 1383) Lippia citriodora H.B.U.K (راشدی، 1380؛ کریمی، 1381)
Lippia triphylla (راشدی، 1380؛ صمصام شریعت، 1374)
Verbena triphylla L Herit (رضایی و همکاران، 1380؛ یزدانی و همکاران، 1383)
Aloysia citriodora orteg (رضایی و همکاران، 1380؛ یزدانی و همکاران، 1383)
Aloysia triphylla (L “Herit) Britton (راشدی، 1380)
1-2-5 گونه‌های دیگر به‌لیمو
گونههای مفید دیگری از این گیاه وجود دارد و در محلهای رویش، کاربرد درمانی دارند که در زیر به طور گذرا به آنها پرداخته شده است:
1-Lippia graveolens H.B.& K : در برزیل و مکزیک میروید .تیزان حاصل از آن برای درمان روماتیسم بهکار میرود.
2-:scaberrima L. Sond در آفریقای جنوبی میروید و بهعنوان بندآورنده و منعقدکننده خون، مصرف می‌گردد.
3- Cham microcephala L.: درختچهای است بومی برزیل که برگهایی پوشیده از تارهای غدهای مملو از اسانس مطبوع و گلهایی سفیدرنگ دارد .بوی آن شبیه بوی آویشن و رومارن است .از آن بهمنظور رفع تشنج و درمان ناراحتیهای ناشی از گزش مار استفاده میشود.
4- : geminata L. (Willd citrata L.) درختچهای است بومی جزایر آنتیل و نواحی مختلف آمریکای جنوبی که معادل 123/0 درصد اسانس پک اولت (peck olt) از آن بهدست میآید .برگ این گیاه بهصورت دمکرده و در رفع نزله بهکار میرود.
5- Hochst adoensis L.: در آمریکا می‌روید و از برگ آن برای رفع تب و سرفه استفاده می‌شود. دارای اندامهای معطر و اسانسی با ترکیب شیمیایی متفاوت برحسب منشأ جغرافیایی است (در محل اصلی رویش، برای آن 4 گونه قائلاند). سرشاخهی گلدار این گیاه بیشتر از سرشاخههای برگدار آن، اسانس دارد. گلهای آن معادل 14 تا 15 در هزار اسانس خام با بوی معطر تولید میکند که معادل 37 درصد کامفر چپ از آن استخراج میشود.
6- :Lantana pseudo- theaSt. Hill L.pseudo- Thea درختچهای است بومی نواحی گرم آمریکا که بیشتر در مناطق مرتفع برزیل میروید. دارای برگهای متقابل با بوی مطبوع بسیار قوی است. بومیان محل از آن دمکردهای تهیه میکنند که براى رفع تشنج کاربرد دارد (رضایی و همکاران، 1380).
1-2-6 منشأ و پراکنش بهلیمو در ایران
بهلیمو بیشتر در زمینهای آفتابگیر، با خاک دارای نفوذپذیری (خاک لومی سبک) و رطوبت و آب کافی، رشد مینماید (زرگری، 1371). این گیاه در برابر سرما و وزش باد شدید حساس است (راشدی، 1380). این گیاه را میتوان در نواحی مدیترانهای کاشت مانند بخش اعظم کرمانشاه بهجز ناحیهای محدود در جنوب غربی مانند پاوه، مریوان، اسلام آباد غرب، جوانرود، سرپل ذهاب، قصرشیرین، استان ایلام: گیلان غرب استان لرستان: خرم آباد و جنوب غربی آن، کوهدشت، شمال شرقی خوزستان: ایذه، شمال شرقی، کهکیلویه و بویراحمد: یاسوج، سی سخت، شمال غربی استان فارس: نورآباد ممسنی، آباده، بخش اعظم چهارمحال و بختیاری: شهرکرد، لردگان، فارسان و جنوب غربی چهارمحال و بختیاری، استان اصفهان: سمیرم، شهرضا و فریدون شهر، ناحیه معتدل بخش اعظم استان مازندران، رامسر، نوشهر، ساری، نور، بهشهر، ناحیهای محدود در شرق استان گیلان (چابکسر) (مظفریان، 1383).
1-2-7 اهمیت اقتصادی بهلیمو
گیاهان دارویی یکی از منابع غنی کشور بوده که امکان صادرات آن نیز وجود دارد، زیرا وقتی به ارقام واردات کشورهای اروپایی مثل آلمان و فرانسه توجه نمود، معلوم میگردد که گیاهان دارویی بازار بزرگی در جهان داشته و کشور ما میتواند به یکی از مهمترین صادرکنندگان این گیاهان تبدیل شود. بهلیمو برگهای سبز و روشن با بوی مشابه لیمو دارد (کارنات، 1999). اسانس آن بوی بسیار مطبوع دارد و در تهیه اودوکلن مورد استفاده قرار میگیرد (زرگری، 1375). ضماد له کردهی تازهی آن برای التیام زخم مفید است (حاجیشرفی، 1388). در تجارت گیاه برای تولید اسانس تولید میشود (مظفریان، 1391). باتوجه به بازدهی بالای بهلیمو در سطح و قیمت بالای برگ خشک این گیاه و اینکه تقاضای بهلیمو در کارخانجات و مصارف عطاری‌های در سالهای اخیر بیشتر شده از اینرو تولید و بهرهبرداری از آن در مزارع کشور توجیه اقتصادی دارد.
1-2-8 روش پرورش گیاه بهلیمو
تکثیر بهلیمو، به شیوهی قلمهزدن شاخهها، خوابانیدن آنها (راشدی، 1380؛ رضایی و همکاران، 1380؛ زرگری، 1371) یا به وسیلهی پاجوش (راشدی، 1380؛ رضایی و همکاران، 1380) در زمینهای زراعی نفوذپذیر و مرطوب صورت میگیرد. بهدلیل حساس بودن این گیاه در برابر افزایش دما، آبیاری زمین زراعی در فصلهای گرم سال، امری الزامی است (زرگری، 1371؛ گرونوالد، 2004). البته با استفاده از این روش، تعداد محدودی گیاه با توجه به حجم خزانه در دسترس و همچنین تعداد پایههای مادری اولیه تولید میشود (امیدبیگی، 1376).
تکثیر به وسیلهی قلمه زدن بدین صورت انجام میگیرد که شاخههای جوان گیاه را که در آغاز، رویش طولی دارند از ساقه قطع میکنند و پس از جدا نمودن برگها، این قلمههای خشبی را در بستر یا نهالستان‌هایی که زمین آن، از قبل آماده گردیده است، کاشته میشوند. با آبیاری مرتب قطعه زمین نهالستان آماده می‌گردد، قلمهها به تدریج در پاییز ریشهدار میشوند و بر اثر رشد و نمو، آمادگی انتقال به زمین زراعی را پیدا میکنند. دور آبیاری هر 5-10 روز یک بار بسته به بافت خاک و اقلیم منطقه متفاوت است. زمین زراعی را باید از قبل به عمق 40 تا 50 سانتیمتر بهخوبی شخم زده و تهیه کرده باشند، در غیر این صورت ریشههای گیاه، نمی‌توانند بهآسانی در داخل خاک نفوذ نمایند و رطوبت لازم را بهدست آورند و در خاک استقرار یابند. بر پایه برخی توصیههای کارشناسی دیگر باید زمین محل کشت، را در دو نوبت دیگر شخم زد (آخرین نوبت بهمنظور اضافه و مخلوط کردن انواع کودها، بهدرون خاک). پس از انجام این کارها در سطح زمین زراعی، خطوطی بهفاصلهی یک متر ایجاد و سپس فواصلی بهطول 60 سانتیمتر در آن مشخص مینمایند که هر یک از نقاط یاد شده محل انتقال یکی از قلمههای ریشهدار گیاه است. پیش از انتقال قلمههای ریشهدار بهزمین زراعی، آنها را از ناحیهی یک سانتیمتری یقه، قطع میکنند و ریشههای دراز شده گیاه را نیز کوتاه مینمایند (هرس ریشه یا هابیاژ) تا با این عمل ریشههای جانبی، سریعتر آمادگی رویش پیدا نمایند. عمل انتقال قلمهها باید بهخوبی همراه با ضدعفونی قلمهها با یکی از قارچکشهای مناسب و زیر نظر کارشناسان گیاهپزشکی یا حفظ نباتات بهوسیله دست صورت گیرد. پس از انجام ضدعفونی و انتقال قلمهها بهداخل خاک، باید قسمتی از خاک اطراف آنها بر اثر فشار انگشتان بر روی گیاه ریشهدار و عاری از ساقه، بهحالت فشرده درآید تا علاوه بر خروج هوای اضافی (هواگیری) قلمهها بتوانند بهخوبی استقرار یابند. در پاییز پس از انجام مراقبت‌های لازم برای نگهداری گیاه از عوامل نامساعد محیط خارج، سطح زمین را با قشری از برگهای خشک می‌پوشانند و سپس در بهار آنها را از روی قلمهها خارج میسازند. تمام عملیات مناسب باغبانی مانند کوددهی بهموقع باید پس از آزمون خاک و زیر نظر کارشناسان تغذیه و باغبانی برای هر هکتار زمین زراعی، حدود 200 کیلوگرم کود ازته نیترات سدیم، مقدار 300 کیلوگرم سوپر فسفات و میزان 100 کیلوگرم کود سولفات پتاسیم بهدقت اعمال گردد. پس از جمعآوری محصول، شاخههای برگدار گیاه را قطع و سپس آنها را بهطور طبیعی بهصورت دستهای و بهوضع آویزان در انبارهای ویژهای نگهداری میکنند، بهنحوی که جریان هوا در آن محل بهخوبی برقرار باشد. پس از خشک شدن، برگها را از شاخهها جدا و در گونیهای کنفی یا پارچهای 50 تا 70 کیلوگرمی بستهبندی و روانه بازار تجارت مینمایند (زرگری، 1371). حدود 1700 قلمه با فواصل 12-80 × 50-40 سانتیمتر در هکتار میتوان کاشت. pH بهینه مورد نیاز محدوده 7 (یعنی تقریباً خاک قلیایی یا خنثی) است (مظفریان، 1383).
1-2-9 زمان جمعآوری بهلیمو
زمان جمعآوری و چیدن برگها اواخر تابستان است (کریمی، 1381) و 2 تا 3 نوبت در سال و کار چیدن برگها بسته به شرایط اقلیمی و وضعیت رشدی گیاه بهطور معمول همزمان با ماههای خرداد، مرداد و مهر است (راشدی، 1380؛ زرگری، 1371؛ یزدانی و همکاران، 1383). برداشت بهصورت هرس شاخههای گیاه صورت میپذیرد. باید تا حد امکان از شکسته شدن برگها طی عملیات برداشت و خشک کردن جلوگیری شود. میانگین عملکرد آن 1200 کیلوگرم در هکتار برگ خشک (میزان اسانس در برگ خشک 2/1 تا 81/0 درصد) است (مظفریان، 1383).
1-2-10 خواص دارویی و کاربردهای بهلیمو
تببر، ضداسپاسم، ضدخستگی بدن، آرامبخش و آرامکنندهی اعصاب است، برای تقویت معده، رفع درد شکم، دلپیچه و کاهش نفخ موثر است، برا رفع تپش قلب، تسکین میگرن، رفع سرگیجه و صداهای داخل گوش مفید میباشد (حاجیشرفی، 1388). بهلیمو خاصیت مسکن ملایم و شهرتی برای آرام کردن ناراحتی‌های شکمی دارد. اثر مقوی آن روی سیستم عصبی با قطعیتی کمتر از فرنجمشک است، با وجود این به شادابی کمک میکند و برعلیه افسردگی موثر است (مظفریان، 1391). از نظر تقویت معده، باید آنرا در ردیف بهترین داروها قرار داد و برای اینمنظور نیز بهتر است همیشه بهصورت دم کرده مانند چای مصرف شود (زرگری، 1375).
ترکیب لیمونن مادهی تلخ مرکبات و لیمو و دارای اثر سمی و تحریککننده پوست است. لیمونن در فرمول فرآوردههای دارویی مانند قرص بیکربنات سدیم و پمادهای ضدعفونیکننده وارد، همچنین در ساخت ویتامین A از آن استفاده میشود. ترکیب لیمونن در صنایع عطرسازی، بهمنظور معطر نمودن مواد آرایشی، ساخت صابونهای رنگی، خوشبوکنندهها، طعمدهندهها، بهعنوان حلال در ساخت رزینها و مرطوب کننده بهکار میرود (راشدی، 1380).
ترکیب 1و 8- سینوئل دارای اثرات کرمکشی، ضدآلرژی، گندزدایی، قارچکشی، باکتریکشی، تسکین‌دهنده، خلطآور، پایینآورندهی فشار خون، جلوگیری از التهاب گلو، التهاب حنجره، تحریک سیستم مرکزی اعصاب و تولید صفرا بهوسیلهی کبد و در مواردی سبب قرمز شدن پوست و آلرژیزا است. ترکیب لیمونن نیز یک مونوترپن تک حلقهای با جرم ملکولی 136 بهشکلهای راست گرد، چپگرد و شکل راسمیک و مایعی بیرنگ با بویی شبیه لیمو و در آب غیرقابل حل، ولی در الکل قابل حل است. در مجاورت هوا، یک لایهی اکسید تشکیل میدهد و این لایه رفتاری همانند لاستیک یا روغنهای خشکشونده دارد (راشدی، 1380). همچنین بهعنوان ادویه در مصارف خانگی برای خوشبو و معطر ساختن گوشت، ماهی، انواع مربا، پوره و غیره بهکار میرود. اسانس بهلیمو، دارای خواص باکتریکشی و حشرهکشی است (کریمی، 1381).
1-2-11 مواد تشکیلدهنده اسانس بهلیمو
متابولیتهای ثانویه، مواد آلی شیمیایی پیچیدهای هستند که گیاهان در طول حیات خود تولید مینمایند، ولی در رشد و نمو و فعالیتهای حیاتی آنها نقشی ندارند و عمدتا بهمنظور دفع آفات، جذب حشرات گردهافشان و مبارزه با بیماریهای میکروبی در گیاه تولید میشوند (کومار و گوپتا، 2008). در ایران میزان اسانس برگ گیاه بهلیمو 6/0 درصد است. و بهنحو عمده شامل 24 ماده مختلف میباشد، لیمونن (29.4%) و 1 و 8- سینئول ترکیبهای اصلی میباشند. ژرانیول، مگاژرانیول و کارمنفنیلاکسید از سایر ترکیبهای اصلی اسانس میباشند (مجاب، 1381؛ سارتوراتو، 2004).
مجاب و همکاران (2003)، ترکیبات اسانس برگهای بهلیموی تهیه شده از عطاری تهران را ژرانیول، نرول، نرال، ژرانیال، لیمونن و 1 و 8- سینئول، اسپاتولنول و آلفاکورکومن گزارش کردند. طی پژوهشی عمده‌ترین ترکیبات اسانس در برگ بهلیمو لیمونن، 1 و 8- سینئول، ژرانیال، نرال، بتا-گوانین، اسپاتولنول و سایوفیلناکسید گزارش شده است (رضایی و جایمند، 2002).
با توجه بهاینکه مهمترین ترکیبات مورد استفاده از اسانس گیاه بهلیمو در صنایع مختلف خصوصاً صنایع دارویی، ژرانیال و نرال میباشد و میزان این ترکیبات بهطور مشخص و فرایندهای در اسانس استحصالی از بذر این گیاه در مقایسه با سایر اندامها در گزارشهای یادشده بیشتر است، بنابراین توصیه می‌شود که با اعمال روشهای اصلاحی و بهزراعی متعدد که منجر به افزایش تولید بذر و افزایش کمی و کیفی اسانس آن میگردد، منابع گیاهی ترکیبات مذکور را افزایش داد (شاهحسینی و همکاران، 1390).
1-2-12 فرمولهای شیمیایی و شکل نمایی از برخی مواد تشکیل دهندهی اسانس بهلیمو
در اسانس حاصل از گیاه به‌لیمو مواد مؤثره فراوانی وجود دارد (شکل 1-2) از قبیل ژرانیول با فرمول شیمیایی C10H18O، لیمونن که یکی از اصلی‌ترین مواد می‌باشد با فرمول شیمیایی C10H16 که یک مایع بی‌رنگ هیدروکربنی از کلاس سیکلوترپن است و معمولاً ایزومر D آن بوی قوی‌ای مانند پرتقال دارد. در سنتزهای شیمیایی به‌عنوان پیش ماده‌ای برای Carvone و نیز به‌عنوان یک حلال تجدیدپذیر در شوینده‌ها بکار می‌روند. همچنین لینالول و نرول نیز با فرمول شیمیایی C10H18O به‌همراه بسیاری ترکیبات دیگر وجود.

ژرانیول لیمونن

نرول لینالول
شکل 1-2 فرمول شیمیایی برخی از مواد تشکیل دهنده‌ی اسانس بهلیمو
1-3 کشت بافت
روش‌های کشت بافت گیاهی و بخصوص زمینه تجاری آن که ریزازدیادی نامیده می‌شود، از فناوری‌های کاربردی با دورنمایی جدید جهت تکثیر رویشی گیاهان می‌باشند که امکان تولید گیاهانی سالم با ژنوتبپ یکسان را فراهم می‌نمایند. روش ریزازدیادی ضریب تکثیر بالایی دارد، روند سلکسیون را کوتاه میکند و عملیات آن با اقتصادی نمودن مکان‌های مورد نیاز جهت کشت گیاهان در تمام طول سال قابل انجام است. در بسیاری از کشورهای دنیا، ریزازدیادی گیاهان که از آن تحت عنوان یک صنعت زیستی نام برده می‌شود، در مسیر صنعتی شدن قرار گرفته است و تاکنون صدها شرکت کاری فعال در این زمینه معرفی گردیده‌اند (قاسمی بزدی و رمضانی مقدم، 1391).
یکی از مزایای روش‌های ریزازدیادی، سرعت تکثیر بسیار بالای گیاهان براساس انتقال ماهیانه ریزنمونه‌ها به محیط کشت‌های جدید می‌باشد و تعداد گیاهان تولید شده از هر ریزنمونه را می‌توان در هر سال براساس سرعت‌های تکثیری مختلف و واکشت‌های ماهیانه در شرایط در شرایط متفاوت کشت و برای گونه‌های مختلف، پیش‌بینی نمود. به‌طور مثال با ضریب تکثیر دو گیاه در ماه، طی یک سال می‌توان حدود 4 هزار گیاه از هر ریزنمونه به‌دست آورد. با افزایش ضریب تکثیر به 3 و 4 گیاه در ماه، طی یک سال می‌توان به‌ترتیب به بیش از 500 هزار و 16 میلیون گیاه از هر ریزنمونه رسید (قاسمی بزدی و رمضانی مقدم، 1391).
این فن‌آوری در آغاز قرن بیستم از تفکر دانشمند آلمانی بهنام هابرلند با توجه به خاصیت توتی‌پتنسی سلول منشا گرفت. هابرلند پیشنهاد کرد که بایستی تکنیک‌ها و روش‌هایی برای جداسازی و کشت‌بافت‌های گیاهی با این فرض شکل گیرد که اگر محیط و مواد غذایی سلول‌های کشت شده بهدرستی کنترل شوند آن سلول‎‌ها به گیاهی طبیعی تبدیل خواهند شد (باقری و صفاری 1386؛ قاسمیبزدی و رمضانیمقدم، 1391). در سال 1934 اولین کشت بافت موفق توسط وایت انجام شد و اولین کشت کالوس موفق هویج و توتون تا سال 1939 توسط وایت گزارش شد (قاسمی بزدی و رمضانی مقدم، 1391).
مفهوم اصلی کشت بافت آن است که کلیه عوامل ضروری لازم برای یک بافت (آنهایی که توسط خود بافت کشت شده تامین نمی‌شود) در یک محیط کشت مصنوعی فراهم آید. از نخستین مواد مهم 16 عنصر ضروری را می‌توان نام برد. کربن، هیدروژن و اکسیژن با یک قند و معمولاً با گلوکز یا ساکارز تامین می‌شوند، در حالی که موادغذایی عمده یا پرمصرف (Ca,K,Mg,N,P,S) و مواد‌غذایی کم‌مصرف (Mn,Mo,Zn,B,Cu,Fe) به‌صورت نمک‌های معدنی تامین می‌گردند. همغلظت و همتوازن عناصر غذایی برای رشد مناسب بافت در محیط کشت اهمیت دارند. دستورالعمل متعلق به محیط موراشیگ و اسکوگ (MS) است. بیشتر بافت‌های کشت شده نیازمند یک یا چند ویتامین مثل تیامین، پیریدوکسین و نیکوتینیک‌اسید هستند. مواد گوناگون دیگری نیز برای پاسخ‌گویی به نیازهای بافت کشت شده و یا اهداف خاص محقق به محیط‌کشت افزوده می‌گردد. هورمون‌های گیاهی (اکسین‌ها، سیتوکینین‌ها، جیبرلین‌ها) اغلب مورد استفاده قرار می‌گیرند. معمولاً آگار- آگار یا یک ماده جامد‌کننده مفید دیگر جهت جامدسازی محیط برای حفاظت از گیاه استفاده می‌شود اگرچه در سال‌های اخیر کشت بافت در محیط کشت مایع نیز شایع شده است (توحید‌فر و کاویانی، 1389).
کشت درون شیشه‌ای میتواند بافت یا اندام‌های کامل را در برگیرد و از این رو نیازمند آن است که ساختار بافت واردشونده به محیط حفظ شود و یا می‌تواند کشت سلول‌ها با تکثیر سازمان نیافته را شامل شود. هدف گزینه‌ی اول معمولاً القاء ساختار تا رسیدن به گیاه کامل است. مثال‌های برجسته‌ی اندام‌های گیاهی معمولاً با دو هدف عمده انجام می‌شود. هدف اول تحقیق پایه‌ای در جهت درک مکانیسم نمو (مثل جنین‌زایی یا نمو رشته‌های آوندی) از طریق کنترل محیط می‌باشد. هدف دوم، بدست آوردن گیاهان به گونه‌ای است که با روش‌های معمول امکان‌پذیر نیست (مثل تلاقی‌های دور یا تکثیر کلونی مریستم‌ها). سایر اهداف از طریق کشت تک‌سلول‌ها یا مجموع سلول‌ها برآورده می‌شود. یک مجموع سلولی تمایزنیافته روی یک محیط‌کشت (نه غوطهور شده) کالوس نامیده می‌شود (توحید‌فر و کاویانی، 1389).
1-3-1 کشت کالوس
در کشت ‌بافت‌های گیاهی، در اکثر موارد بافت کالوس تولید می‌شود و ‌بافت‌های غده‌ای بندرت دیده می‌شوند. کالوس یک بافت سازمان ‌نیافته و در حال تقسیم می‌باشد که از سلول‌های تمایز ‌نیافته‌ای تشکیل شده است. در مراحل بعدی، این سلول‌ها اختصاصی گردیده به‌طوری که به کالوس‌هایی تبدیل می‌شوند که از آنها تیپ‌های خاصی متمایز می‌شوند. کالوس می‌تواند هم بر روی قطعات بافت‌های مجزا (ریزنمونه‌ها) در شرایط درون ‌شیشه‌ای و هم بر روی گیاهان در محل زخم‌های حاصل از برش تولید شود. تشکیل و تکثیر درون شیشه‌ای کالوس با حضور هورمون‌های اکسین و سیتوکینین که تقسیم و طویل شدن سلول را تقویت می‌کنند، افزایش می‌یابد (رنجبر، 1384؛ فروتن و وادیدار، 1385).
بافت کالوس در شرایط درون ‌شیشه‌ای معمولا سفید یا زرد و گاهی‌ اوقات به رنگ سبز روشن می‌باشد. رنگدانه قهوه‌ای تیره اغلب به خاطر پیری سلول‌های کالوس بروز می‌کند و مربوط به تجمع فنل در آنها است. معمولا بافت کالوس حالت بی‌شکل دارد و نمی‌تواند ساختار آناتومیکی مشخصی داشته باشد، ولی بسته به منشا پیدایش و شرایط کشت ممکن است از نظر استحکام، ساختارهای متفاوتی بهخود بگیرد (سلمر و همکاران، 1996).
شرط ضروری تمایززدایی سلول‌های گیاهی و تبدیل آنها به بافت کالوس، وجود دو گروه از هورمون‌های گیاهی در محیط‌کشت‌ها شامل اکسین‌ها و سیتوکینین‌ها می‌باشد. اکسین‌ها موجب تمایززدایی سلول‌ها می‌گردند و آنها را برای تقسیم آماده می‌کنند، در حالی که سیتوکنین‌ها باعث تکثیر سلول‌های تمایززدایی شده می‌گردند (قاسمی بزدی و احمدی، 1388).
1-3-2 تولید متابولیتهای ثانویه
متابولیتهای ثانویه، مواد آلی شیمیایی پیچیدهای هستند که گیاهان در طول حیات خود تولید مینمایند، ولی در رشد و نمو و فعالیتهای حیاتی آنها نقشی ندارند و عمدتأ بهمنظور دفع آفات، جذب حشرات گردهافشان و مبارزه با بیماریهای میکروبی در گیاه تولید میشوند. مواد معطر، مواد مؤثره دارویی، چاشنیها، شیرین کنندههای طبیعی، مواد ضد میکروبی، فرمونها، حشره‌کشها، علفکشها، قارچکشها، هورمونهای گیاهی و مواد آللوپاتیک از این جمله میباشند .براساس برخی از تخمینها حداقل صد هزار متابولیت ثانویه از 50000 گونه گیاهی شناسایی شده است و هر سال 4000 متابولیت جدید از واریتههای مختلف گیاهی کشف میشود (کومار و گوپتا، 2008).
اگرچه تقاضا برای این ترکیبات افزایش یافته است، اما برخی از این گیاهان، زیستگاههای طبیعی محدود دارند و بسته به شرایط محیطی و جغرافیایی محل رویش گیاه، جمعآوری آنها با مشکلاتی مواجه است. غلظت پایین این ترکیبات در گیاه، محدودیت منابع طبیعی، تخریب روزافزون جنگلها، مراتع و فضای سبز، نابودی گونههای متنوع گیاهی و جانوری، مشکلات مرتبط با اهلی نمودن و کشت زراعی این گیاهان، توجه محققین را به استفاده از راهکارهای فناوری زیستی جهت افزایش تولید و بهرهوری گیاهان دارویی معطوف نموده است. فناوری زیستی با بهرهگیری از علوم مختلف مانند بیولوژی، بیوشیمی، ژنتیک، غیره و با استفاده از راهکارهای کشت سلولها، اندامها و بافتها، مهندسی ژنتیک و نشانگرهای مولکولی قادر است کارآیی گیاهان را بهعنوان منابع تجدیدپذیر جهت تولید دارو افزایش دهد (کومار و گوپتا، 2008؛ مولوباژال و تسای، 2004).
1-3-3 باززایی گیاه
باززایی گیاه از طریق پروتوپلاست، سلول‌های منفرد و ریزنمونه‌های گیاهی، بهدلیل وجود خاصیت توتی‌پوتنسی است. امروزه باززایی گیاه از طریق روش‌های کشت‌بافت، اساس روش‌های فناوری زیستی و اصلاح گیاهی قرار گرفته است بهطوری که از آن برای تکثیر غیرجنسی بسیاری از گیاهان زراعی و باغی در مقیاس تجاری استفاده می‌شود. یکی از مصادیق بارز خاصیت توتیپوتنسی، توانایی منحصر بهفرد گیاهان برای تولید جنین‌های سالم از سلول‌های منفرد بافت‌های سوماتیکی یا کالوس است. بهاین فرآیند جنین‌زایی سوماتیکی گفته می‌شود بهطوری که جنین‌های حاصل از آن می‌توانند در شرایط درون‌شیشه‌ای باززا شده و گیاه کامل جدیدی را ایجاد نمایند (رنجبر، 1384؛ فروتن و وادیدار، 1385).
1-4 کشت بافت گیاهان دارویی
روشهای سنتی تکثیر گیاهان دارویی همانند سایر گیاهان شامل روشهای جنسی (تکثیر با بذر) و غیرجنسی نظیر: قلمه، خوابانیدن، پاجوش و غیره میباشد. گیاهان تکثیر شده با بذر عمدتا از لحاظ ژنتیکی یکنواخت نیستند و گیاه حاصله دارای تمام خواص گیاه مادری نیست .بههمین جهت تکثیر غیرجنسی به جنسی ترجیح داده میشود .روشهای سنتی تکثیر غیرجنسی عمدتا با مشکلات متعددی از جمله محدودیت گیاه مادری و بازدهی پایین مواجه است. کشت بافت، نوعی تکثیر غیرجنسی در محیط درون شیشه‎ای است. مزیت تکثیر از طریق کشت بافت نسبت به سایر روشهای مرسوم، تولید تعداد زیادی گیاه با محتوای ژنتیکی یکسان و کیفیت یکنواخت، در زمان کوتاهتر و فضای نسبتا محدود میباشد (تریپاتی و تریپاتی، 2003).
فناوری زیستی با استفاده از راهکارهایی نظیر کشت سلول ها، اندام ها و بافت ها، مهندسی ژنتیک و کاربرد نشانگرهای مولکولی قادر است کارآیی و بهره‌وری گیاهان دارویی را به‌عنوان منابع تجدیدپذیر جهت تولید دارو افزایش دهد. کشت سلول، بافت‌ها و اندام‌های گیاهی امکان تکثیر درون شیشه‎ای سریع و انبوه بسیاری از گیاهان دارویی مهم را فراهم نموده است. گیاهان تکثیر شده از طریق کشت‌های عاری از بیماری و از لحاظ ژنتیکی و کیفی یکنواخت می‌باشند. نگهداری کشت سلول یا بافت گیاهی به روش انجماد در نیتروژن مایع، یک روش مناسب جهت حفظ گیاهان دارویی در معرض انقراض می‌باشد. طی سال‌های اخیر کشت سوسپانسیون سلولی و اندام (ساقه و ریشه مویین) جهت تولید متابولیت‌های ثانویه و مطالعه مسیر بیوسنتز متابولیت‌ها مورد توجه قرار گرفته است. تاکنون کشت سلولی طیف وسیعی از گیاهان دارویی بررسی شده است و ترکیبات مهمی نظیر: فلاونوئیدها، تانن‌ها، آلکالوئیدها و ترپنوئیدها از این طریق تولید شده‌اند. ترکیبات محیط کشت، ریزنمونه، شرایط فیزیکی، افزودن پیش سازها، استفاده از القاگرهای زنده و غیرزنده، افزایش نفوذ پذیری سلول، دور کردن محصول از محل تولید، بی‌تحرک نمودن سلول‌های گیاهی و انتخاب سلول‌های با کارآیی بالا، از مهمترین فاکتورهای موثر در افزایش تولید متابولیت ثانویه در کشت سلولی می‌باشند(امیدی و فرزین، 1388).
کشت سلول، بافتها و اندامهای گیاهی امکان تکثیر انبوه و سریع گیاهان و تولید متابولیتهای ثانویه را در شرایط درون شیشه‎ای فراهم میسازد .با استفاده از کشت درون شیشه‎ای گیاه، علاوه بر دسترسی به منبع اولیه دارو در شرایط کنترل شده و مستقل از محیط، افزایش تولید ترکیبات نسبت به گیاه و تولید ترکیبات جدید نیز امکانپذیر می‌گردد (بروگاود و همکاران، 2002).
علیرغم هزینه لازم جهت پیشبرد روشهای بیوتکنولوژی تولید ترکیبهای معطر چندین عامل وجود دارد که مشوق این ایده است. مصرفکنندههای طبیعتگرا از از عوارض جانبی احتمالی افزودنیهای مصنوعی غذا، نگران میباشند. بنابراین فرآوردههای طبیعی بهطور روزافزونی ترجیح داده میشود. بهعلاوه ترکیبهای معطر حاوی از سیستمهای کشت بافت گیاهی، تخمیر میکروبی و یا تبدیلات زیستی باید نسبت بهنوع سنتزی آنها طبیعیتر باشند. همچنین مصرفکنندهها در رابطه با باقیماندههای حشرهکشها و علف‌کشها که معمولا در محصولات غذایی کشاورزی وجود دارد، نگران میباشند. این در حالی است که تولید این ترکیبات بهروش کشت بافت گیاهی نیازی به این مواد ندارند. البته تنها پذیرش مصرفکننده در سوق دادن صنایع در جهت یافتن روشهای بیوتکنولوژی بهمنظور تولید ترکیبات معطر تعیینکننده نیست. محرکهای دیگری مانند فراهم شدن نامنظم مواد خام به واسطه شرایط نامناسب آب و هوایی، تغییرات فصلی یا محصولی، بلایای طبیعی یا بیثباتی سیاسی در مناطق رویش گیاه نیز در این کار دخیل می‌باشند (هارلندر، 1994).
1-5 اهمیت تکثیر بهلیمو از طریق کشتبافت
تکثیر گیاه بهلیمو با استفاده از کشت بافت راهحل کارآمد و مفید برای غلبه بر مشکلات تکثیر آن میباشد. با استفاده از کشت درون شیشهای میتوان نسبت به تولید انبوه و عاری از آلودگی گیاه بهلیمو اقدام نمود. همچنین اولین گام در اصلاح ژنتیکی با استفاده از روشهای ملکولی، تولید متابولیتهای ثانویه در بیوراکتورها و افزایش میزان ماده مؤثره به وسیله تکنیکهای بیوتکنولوژیکی بهینهسازی کشتبافت این گیاه میباشد. باتوجه به اهمیت گیاه بهلیمو در صنایع مختلف بهینهسازی کشتبافت آن بهعنوان گام نخست در بهبود و افزایش تولید متابولیت ثانویه این گیاه حائز اهمیت میباشد (اولادزاد، 1391).
با توجه به اهمیت این گیاه در صنایع داروسازی، پزشکی، آرایشی و بهداشتی و از آنجا که نوع تکثیر به‌لیمو اهمیت بالایی در این گیاه دارد، پژوهش حاضر در قالب آزمایش‌های جداگانه مزرعه‌ای و کشت‌ درون شیشه‌ای با توجه به اهداف زیر اجرا گردید.
1-6 اهداف تحقیق
1- بررسی اثر ترکیبات هورمونی محیط کشت در باززایی ریزنمونه‌های به‌لیمو و تعیین بهترین ترکیب محیط کشت.
2- بررسی اثر مواد مختلف موجود در محیط کشت بر میزان اسانس به‌لیمو در شرایط درون شیشه‌ای
3- بررسی اثر تیمارهای مختلف کودی بر روی عملکرد و خصوصیات مورفولوژیکی به‌لیمو در شرایط مزرعه.
4- بررسی اثر تیمارهای مختلف کودی بر میزان اسانس گیاه بهلیمو.
5- بررسی و مقایسه مقدار اسانس به‌لیمو در شرایط مزرعه و کشت بافت.
فصل دوم
مروری بر تحقیقات انجام شده
2-1 گیاهان دارویی
وجود 11 اقلیم از 13 اقلیم شناخته شده جهان، برخورداری از 300 روز آفتابی در سال و اختلاف دمای 40 تا 50 درجه سانتیگرادی میان سردترین و گرمترین نقطه در کشور، شرایط مساعدی برای کشور پهناور ایران به‌لحاظ بهره‌مندی از یک شرایط اکولوژی منحصربه‌فرد فراهم کرده است؛ این شرایط زمینه رشد و نمو گیاهان وحشی و دارویی را در کشور مساعد کرده است. استفاده از گیاهان دارویی در قالب طب سنتی برای درمان بیماری‌ها و مصارف دیگر در صنایع غذایی و بهداشتی از دیرباز مورد توجه بوده است، ولی در چند ساله اخیر با گرایش مردم به استفاده از داروهایی با منشأ گیاهی به‌دلیل عوارض جانبی و سوء داروهای شیمیایی، توجه جهانیان به این بحث بیشتر شده است. از سوی دیگر، تأکید سازمان بهداشت جهانی در جایگزینی تدریجی مواد طبیعی به‌جای مواد شیمیایی موجب شده تا کشورهای مختلف جهان نسبت به سرمایه گذاری، برنامه‌ریزی کشت و تولید انبوه گیاهان دارویی در سطوح صنعتی و استفاده از آن در صنایع دارویی، بهداشتی و غذایی اقدام کنند. چنین توجه و اقبالی به سوی گیاهان دارویی، کشت و تجارت آن را در جایگاه اقتصادی مناسبی قرار داده است. به‌طوری که برآوردها حاکی از ده‌ها میلیارد دلار گردش مالی حاصل از پرداختن به این تجارت است. اما با توجه به قابلیت‌های کشورمان که ذکر آن به میان رفت و نظر به پیشینه کهن استفاده از گیاهان دارویی در ایران، چنین به‌نظر می‌رسد که هنوز از ظرفیت‌های موجود در کشور به خوبی بهره‌برداری نشده است و جایگاه مناسبی در عرصه تجارت جهانی گیاهان دارویی وجود ندارد. سرمایه در گردش بازار جهانی گیاهان دارویی حدود 123 میلیارد دلار اعلام شده است. توجه به این رقم و مقایسه آن با رقم کل تبادلات جهانی فرش که سالانه حدود 5 میلیارد دلار است، می‌تواند ما را به اهمیت سرمایه‌گذاری در توسعه کشت گیاهان دارویی رهنمون کند (افشار، 1385).
فناوری زیستی قادر است کارآیی گیاهان دارویی را جهت تولید دارو افزایش دهد. کشت سلول، بافت‌ها و اندامهای گیاهی امکان تولید سریع و انبوه ژنوتیپ‌های مطلوب با محتوای ژنتیکی یکسان و کیفیت یکنواخت، در زمان کوتاهتر و فضای محدود فراهم می‌سازد. امروزه تعداد زیادی از گیاهان دارویی از طریق ریزازدیادی قابل تکثیر می‌باشند. اگرچه تولید متابولیت‌های ثانویه از طریق کشت سوسپانسیون سلولی و اندام در طیف وسیعی از گیاهان دارویی بررسی شده است، ولی در حال حاضر این روش فقط برای ترکیبات باارزش افزوده بالا نظیر داروهای ضدسرطان (تاکسول، وین کریستین و وی نبلاستین) به‌صورت صنعتی کاربرد دارد. شناسایی و دستکاری ژنتیکی آنزیم‌های دخیل در مسیر متابولیکی بیوسنتز متابولیت‌‎های ثانویه و تراریزش ژنتیکی جهت افزایش مقدار متابولیت‌های ثانویه و تولید متابولیت‌های جدید می‌تواند زمینه را برای کاربرد کشت سلولی در سایر گیاهان نیز فراهم نماید (امیدی و فرزین، 1388)
فاکتورهای متعددی نظیر شرایط اقلیمی و ژنتیکی بر محتوای ترکیبات دارویی گیاه و کیفیت نهایی دارو موثرند. در سال‌های اخیر مطالعات زیادی به‌منظور تعیین رابطه بین نشانگرهای مولکولی و تنوعات کمی و کیفی ترکیبات فعال دارویی در بین گونه‌ها و خویشاوندان نزدیک گیاهان دارویی صورت گرفته است. نشانگرهای مولکولی به‌دلیل عدم وابستگی به سن، شرایط فیزیولوژیکی و محیطی گیاه دارویی ابزاری قدرتمند در استفاده کارا از گونه‌های مؤثر دارویی محسوب می‌شوند. به کارگیری توأم روشهای مولکولی و آنالیز شیمیایی HPLC و TLCمی‌تواند اطلاعات مربوط به یک گونه دارویی خاص و همچنین کنترل کیفی و کمی ترکیب دارویی مورد نظر را در سطح صنعتی افزایش دهد (امیدی و فرزین، 1388)
اسانس استحصالی از بذرهای بهلیمو دارای بوی بسیار تند و رنگ نارنجی پررنگ و تیره (متمایل قرمز) است. میزان اسانس حاصل از بذور 31/0 درصد (وزنی/ وزنی) بود. نتایج تجزیه دستگاهی اسانس نشان داد که در بین ترکیبات شناسایی شده در اسانس، 12 ماده 12/80 درصد کل ترکیبات را شامل شدند. همچنین بیشترین مقدار اجزای این اسانس را ترکیبات ترپنوئیدی (شامل مونو و سزکویی ترپنوئیدها) تشکیل دادند (شاهحسینی و همکاران، 1390).
تولید متابولیتهای ثانویه با استفاده از روشهای مبتنی بر کشتبافت دارای مزایای متعددی است. در شرایطin vitro تولید متابولیت ثانویه تحت تأثیر عوامل محیطی مختلف نظیر اقلیم، آفات، بیماریهای میکروبی، تنشهای فصلی و جغرافیایی قرار نمیگیرد؛ رشد سلو‌ل‌ها را می‌توان به‌صورت خودکار کنترل کرد و فرآیندهای متابولیکی را تنظیم نمود؛ فرآوردههای مفید را میتوان تحت شرایط کنترل شده تولید کرد و محصولات خالصتر و مطمئنتر به بازار عرضه نمود؛ کشت سلولی می‌تواند راهکار مناسبی برای گیاهانی باشد که طول دوره رشدی طولانی و غیر اقتصادی دارند. به عنوان مثال شقایق کبیر (Papaver bracteatum) که منبع تبائین است دو تا سه فصل وقت لازم دارد، تا به مرحله رسیدگی کامل برسد، اما تولید آن از طریق کشت سلول در محیط شیمیایی کنترل شده سریع میگردد. بعلاوه از کشت سلولی می‌توان برای مطالعه بیوسنتز متابولیتهای ثانویه استفاده کرد (بورگاود و همکاران، 2002؛ راوو و راویشانکار، 2002).
عوامل متعددی نظیر ترکیبات محیط کشت، ریزنمونه، شرایط فیزیکی، القاء، نفوذپذیری و غیره در کشت سوسپانسیون سلولی و تولید متابولیت ثانویه موثرند. عمده اجزای محیط کشت سلولهای گیاهی از قبیل قندها، فسفات، نیترات و تنظیمکنندههای رشد، شاخصهای مهمی در رشد و تجمع متابولیتهای ثانویه میباشند (مولاباگال و تسای، 2004؛ راوو و راویشانکار، 2002).
سایر اقداماتی که می‌توانند در افزایش تولید متابولیت‌های ثانویه موثر باشند عبارتند از: افزودن پیش‌سازها، القاگرهای زنده (با منشاء قارچی، باکتریایی و مخمر) و غیرزنده (پلیساکاریدها، گلیکوپروتئین‌ها، آنزیمهای غیرفعال شده، نمک‌های فلزات سنگین و زانتان) به‌عنوان آغازگر در تشکیل متابولیت‌های ثانویه، افزایش نفوذپذیری سلول با استفاده از حلال‌های آلی، دیوپلیساکاریدهایی مانند کیتوزان و یا اولتراسونیکاسیون، دور کردن محصول از محل تولید، دی متیل سولفوکسید (DMSO) تحرک نمودن سلول‌های گیاهی، انتخاب سلول‌هایی با تولید و کارآیی بالا. تولید تجاری کاپسایسین (عامل عمده‌تندی فلفل) در برگیرنده مراحل متعددی است که امروزه تولید آن از طریق کشت‌های سلولی بی‌تحرک شده امکانپذیر شده است (ژوهانسون و همکاران، 1990).
2-2 کشت بافت بهلیمو
روشی برای ریزازدیادیLippie junelliana (mold) tronc از انتهای ساقه یا بخشهای گره توسط هکتور و همکاران (2000) توسعه یافت. تکثیر کشتهای ریزساقه بوسیله قرار دادن نوکهای ساقه یا بخشهای گره بر روی محیط کشت موراشیگ و اسکوگ مکمل شده با 4/4 میلیگرم بر لیتر بنزلدینآدنین یا 04/0 میلیگرم بر لیتر ایندولبوتیریکاسید بدست آمدند. ریشهزایی این ساقهها بر روی محیط کشت MS بدون تنظیمکننده رشد بهتر بودند. گیاهچهای ریشهدار بهطور موفقیتآمیزی در خاک سازگار شدند. کشتهای ساقه تجمع اسانس کمتری در مقایسه با گیاهان بالا نشان دادند. تجمع اسانس در ارتباط نزدیک با رشد بودند و همبستگی منفی با تکثیر ساقه نشان دادند.
مطالعهی گوپتا و همکاران (2001) روشی برای تکثیر سریع Lippie alba cv. Kvach درختچهای چندساله که از فرسایش خاک زمانی که در دامنهها رشد کرده محافظت میکند و برگهای آن غنی از اسانس لینالول میباشد، بدست آوردند. شاخههای متعدد در شرایط درون شیشهای از انتهای ساقهی L. alba بر روی محیط کشت MS همراه با 2 میلیگرم بر لیتر بنزیل آدنین القا شدند. بخشهای گرهی ساقه از شاخههای رشدیافتهی درون شیشهای بدست آمدند، همچنین شاخههای متعددی بر روی محیط کشت با همان ترکیبات یکسان ایجاد گردیدند. شاخهها به آسانی با انتقال به محیط کشت پایهیMS ریشه دادند. از ریشه‌دارهای درون شیشهای گیاهان رشد یافتند و به خوبی در خاک سازگار شدند. اسانس و مورفولوژی گیاهان تکثیر نشده با گیاهان تکثیر شده به طور طبیعی یکسان بودند.
همچنین در تحقیقی بر روی گونهlippia junelliana نشان داد که بیشترین تعداد نوساقه‌ها در تیمارهای هورمونی BAP، در غلظت 4/4 میکرومولار به‌تنهایی و یا در ترکیب با 04/0 میکرومولار IBA بود.(جولیانی، 1999).
در مطالعهای دیگر اثر هورمونهای BAPوNAA بر تکثیر و ریشهزایی گیاه دارویی و در حال انقراض lippia filifolia بررسی شد. نتایج نشان داد که محیطکشت حاوی 5/4 میکرومولار BAP بههمراه 54 نانومولار NAA بیشترین درصد نوشاخهها را القاء نموده است (پیکسوتو، 2006). در پژوهش دیگری تکثیر سریع بهلیمو از طریق کشت درون شیشهای آزمایش گردید و نتایج حاصله نشان داد بیشترین تعداد شاخهها در تیمار هورمونی حاوی 3 میلیگرم در لیتر BAPدر ترکیب با 1/0 میلیگرم در لیتر هورمون IBA بیشترین فراوانی ریشه در تیمار هورمونی حاوی IBA در غلظت 5/0 میلیگرم در لیتر در ترکیب با 2 گرم در لیتر زغالفعال بهدست آمد (اولادزاد، 1391).
2-3 کشت بافت در سایر گیاهان
تحقیقات نشان داده است که بهترین غلظت ساکارز برای تجمع ایندولآلکالوئید در کشتسلولی پروانش (Catharanthus roseus) غلظتهای 4 تا 12 درصد وزنحجمی است. کاهش آمونیوم و افزایش نیترات باعث افزایش تولید شیکونین و بتاسیانین میشود، در حالی که نسبتهای بالاتر آمونیوم به نیترات تولید بربرین و یوبیکینون را افزایش میدهد. مقادیر زیادی فسفات باعث افزایش رشد سلول میشود و عمدتا اثری منفی بر تجمع متابولیتهای ثانویه دارد. کاهش فسفات تجمع آجمالسین را در کشت سلولی پروانش و آلکالوئیدها را در اسفند (Peganumharmala) و افزایش آن سنتز دیگوکسین را در گلانگشتانه (Purpurea digitalis) و بتاسیانین را در سلمهتره (Chenopodium rubrum) و سرخاب (Phytolacca americana) تحریک میکند. علاوه بر مواد غذایی، شرایط محیطکشت مانند: نور، دما، pHو اکسیژن نیز بر تجمع متابولیتهای ثانویه در محیطکشت موثر میباشد. نوردهی بر تجمع ترکیب سزکوئیترینها در کشتهای کالوس گیاه بابونه و محرومیت از نور بر افزایش تجمع مونوترپنها در کشتهای کالوس لیموترش (Citrus limon) تاثیر دارد. افزودن دیاکسیدکربن به سوسپانسیونهای سلولی انگور موسکات سنتز مونوترپنها و تشکیل، سینالول را القا نموده است (مولاباگا و تسای، 2004؛ راوو و راویشانکار، 2002).
برای این منظور تأثیر چهار نوع هورمون شامل، نفتالین استیک اسید (NAA)، کلروفنوکسی استیک اسید (2,4-D)، N6 (2-ایزوپنتیل) آدنین (2IP) و 6 بنزیل آمینوپورین (BAP)، در محیط کشت MSبر روی کشت قسمت‌های مختلفی از گیاه گون گچی مورد مطالعه قرار گرفت. جداکشت‌ها از قسمت‌های مریستم رأسی، ساقه، برگ و ریشه از دانه‌رست‌های سترون تهیه شدند. هورمون‌های مورد استفاده BAP/2,4-D و 2IP/NAA بود که برای هر ترکیب 16 نوع تیمار با نسبت‌های مختلف بکار گرفته شد. در محیط کشت با غلظت‌های متفاوت از هورمون BAP/2,4-Dجداکشت‌های ریشه تولید کالوس‌هایی در تعداد و حجم کمتر و بدون اندامزایی و تمایز را داشتند و سایر جداکشت‌ها به ترتیب با ترکیبات و غلظت‌های مختلف هورمونی منجر به تولید MS مریستم رأسی، ساقه و برگ در هر دو محیط کشت اندام‌های هوایی و ریشه با درصدهای متفاوت گردیدند و با توجه به آزمایش‌ها و تجزیه داده‌های حاصل مشخص شد که جداکشت‌های مریستمی بهترین جداکشت در باززایی به گیاه کامل در شرایط in vitro ترکیب هورمونی2IP/NAA با غلظت‌های مختلف درصد کال‌زایی و اندام‌زایی بهتری را نشان داده است. در مرحله نهایی گیاهان حاصل از کشت به گلدان‌های حاوی خاک مساوی پیت و پرلیت استریل شده منتقل و با محلول هوگلند تغذیه شدند. و پس از یک هفته



قیمت: 12000 تومان

این نوشته در پایان نامه ها ارسال شده است. افزودن پیوند یکتا به علاقه‌مندی‌ها.

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *