پایان نامهi– (168)

معاونت پژوهش و فناوری
به نام خدا
منشور اخلاق پژوهش
باياری‌از خداوند سبحان ‌و‌اعتقاد به‌اين‌که ‌عالم محضرخداست ‌و همواره ‌ناظر بر اعمال ‌انسان و به‌منظور پاس داشت مقام بلنددانش ‌و‌پژوهش ‌و نظر به اهميت جايگاه دانشگاه در اعتلای فرهنگ و تمدن بشری، ما دانشجويان و اعضاءهيات‌علمی واحدهای‌دانشگاه‌آزاداسلامی متعهد می‌گرديم اصول زيررا درانجام فعاليت‌های پژوهشی مدنظر قرار داده و از آن تخطی نکنيم:
1- اصل برائت: الترام به برائت‌جویی از هرگونه رفتار غیرحرفه‌ای و اعلام موضع نسبت به کسانی که حوزه علم و پژوهش را به شائبه‌های غیرعلمی می‌آلایند.
2- اصل رعایت انصاف و امانت: تعهد به اجتناب از هرگونه جانب‌داری غیر علمی و حفاظت از اموال، تجهیزات و منابع در اختیار.
3- اصل ترویج: تعهد به رواج دانش و اشاعه نتایج تحقیقات و انتقال آن به همکاران علمی و دانشجویان به غیر از مواردی که منع قانونی دارد.
4- اصل احترام: تعهد به رعایت حریم و حرمت‌ها در انجام تحقیقات و رعایت جانب نقد و خودداری ازهرگونه حرمت شکنی.
5- اصل رعایت حقوق: التزام به رعایت کامل حقوق پژوهشگران و پژوهیدگان (انسان، حیوان، نبات) و سایر صاحبان حق.
6- اصل رازداری: تعهد به صیانت از اسرار و اطلاعات محرمانه افراد، سازمان‌ها و کشور و کلیه افراد و نهادهای مرتبط با تحقیق.
7- اصل حقیقت جویی: تلاش در راستای پی‌جویی حقیقت و وفاداری به آن و دوری از هرگونه پنهان سازی حقیقت.
8- اصل مالکیت مادی و معنوی: تعهد به رعایت کامل حقوق مادی و منعوی دانشگاه و کلیه همکاران پژوهش.
9- اصل منافع ملی: تعهد به رعایت مصالح ملی و در نظر داشتن پیشبرد و توسعه کشور در مراحل پژوهش.

دانشگاه آزاد اسلامی
واحد دامغان
دانشکده‌کشاورزی
پايان نامه برای دريافت درجه کارشناسی ارشد
رشته مهندسی کشاورزی (بيوتکنولوژی کشاورزی)
گرايش کشاورزی
عنوان
توليد موتاسيون در گياه نعناع فلفلی با استفاده از موتاژن EMS
استاد راهنما
دکترسيدکمال کاظمی‌تبار
استاد مشاور
دکترجعفرمسعودسينکی
نگارنده
سعيدقريب بلوک
شهريور 1392

یرفع الله الذی آمنوا منکم والذین اوتوالعلم درجات
قرآن کریم
کارشناسی ارشد آقای سعید قریب بلوک با عنوان تولید موتاسیون در گیاه نعناع فلفلی با استفاده از موتاژن EMS در جلسه مورخه13/6/92 تحت نظارت شورای پایان نامه متشکل از استادان زیر با درجه و نمره مورد تایید قرار گرفت.
1- استاد راهنما: دکترسیدکمال کاظمی تبار امضاء
2- استاد مشاور: دکترجعفر مسعودسینکی امضاء
3- داور خارج از گروه: دکترمجید معصومیان امضاء
دکتر شهرام رضوان بیدختی
معاون پژوهشی دانشگاه آزاد اسلامی
واحد دامغان
سپاسگزاری
می‌دانم که تشبیه تو به هر چیز دنیوی اشتباه است اما در باور من تو یک کوه استواری و قدرتی که از تو می‌گیرم قلبم را زنده می‌کند. قلبی که ترنمی سبز از ابدیت حضور تو جاری است و من نبض بودنت را با تمام وجودم حس می‌کنم. من به خاطر هرآنچه هستم از تو ممنونم.
از اساتید گرانقدر جناب آقای دکترسید‌کمال‌ کاظمی‌تبار و جناب آقای دکترجعفر مسعودسینکی به خاطر راهنمائی‌های و کمک‌های بی‌دریغشان سپاس گزارم. از استاد بزرگوار جناب آقای دکترمجید معصومیان که داوری این پایان نامه را پذیرفته‌اند تشکر می‌کنم. از نماینده تحصیلات تکمیلی سرکار خانم آبیار که زحمت اداره جلسه دفاع را متقبل شدند قدردانی می‌نمایم.
در اینجا از کسانی تشکر می‌کنم که آنچه در حقم کرده‌اند در وصف نمی‌گنجد. از برادر عزیزم جناب آقای مهندس امین صادقی و سرکار خانم مهندس قلی‌نژاد به خاطر لطف‌هایی که در حق من کرده‌اند بی‌نهایت سپاسگزارم. از سرکار خانم مهندس شاکری نهایت تشکر و سپاس را برای کمک‌ها و همراهی‌هایشان دارم.
فهرست مطالب
صفحه عنوان
1 چکیده……………………………………………………………………………………………………………………………
فصل اول: مقدمه و کلیات
2 1-1 مقدمه……………………………………………………………………………………………………………………..
3 1-1-1 اهمیت موضوع…………………………………………………………………………………………………….
4 1-1-2 فرضیات………………………………………………………………………………………………………………
4 1-1-3 اهداف پژوهش…………………………………………………………………………………………………….
5 1-2 کلیات……………………………………………………………………………………………………………………..
5 1-2-1 گیاه شناسی………………………………………………………………………………………………………….
6 1-2-2 نیازهای اکولوژی………………………………………………………………………………………………….
6 1-2-3 خواستگاه و دامنه انتشار………………………………………………………………………………………..
7 1-2-4 خواص دارویی…………………………………………………………………………………………………….
7 1-2-5 موارد استفاده……………………………………………………………………………………………………….
8 1-2-6 مواد موثره و اجزاء اسانس……………………………………………………………………………………..
8 1-2-7 کشت بافت………………………………………………………………………………………………………….
9 1-2-7-1 انواع کشت بافت گیاهی……………………………………………………………………………………
10 1-2-7-2 بررسی اثرات فاکتورهای مختلف در محیط کشت…………………………………………………
10 1-2-7-3 نمک‌های غیرآلی………………………………………………………………………………………………
11 1-2-7-4 ویتامین‌ها………………………………………………………………………………………………………..
11 1-2-7-5 منبع انرژی………………………………………………………………………………………………………
11 1-2-7-6 میواینوسیتول……………………………………………………………………………………………………
12 1-2-7-7 عوامل فیزیکی………………………………………………………………………………………………….
12 1-2-7-8 ریزنمونه………………………………………………………………………………………………………….
12 1-2-7-9 چگونگی انتخاب محیط کشت…………………………………………………………………………..
13 1-2-7-10 ریزازدیادی گیاهان از طریق کشت بافت……………………………………………………………
13 1-2-7-11ریشه‌زائی……………………………………………………………………………………………………….
14 1-2-8 تعریف موتاسیون (جهش) ……………………………………………………………………………………
صفحه عنوان
14 1-2-8-1 تاریخچه استفاده از موتاسیون…………………………………………………………………………….
15 1-2-8-2 سطوح ایجاد موتاسیون……………………………………………………………………………………..
15 1-2-8-3 انواع موتاسیون…………………………………………………………………………………………………
16 1-2-8-4 موتاژن (عامل جهش‌زا) ……………………………………………………………………………………
16 1-2-8-4-1 انواع موتاژن………………………………………………………………………………………………..
16 1-2-8-4-2 عوامل شیمیایی جهش‌زا………………………………………………………………………………..
18 1-2-8-4-3 مواد گیاهی مورد تیمار………………………………………………………………………………….
18 1-2-8-4-4 اصلاح به روش موتاسیون……………………………………………………………………………..
19 1-2-8-4-5 اهمیت موتاسیون در اصلاح نباتات. ……………………………………………………………….
19 1-2-8-4-6 موفقیت موتاسیون………………………………………………………………………………………..
19 1-2-8-4-7 روش‌های جدید استفاده از موتاسیون……………………………………………………………..
20 1-2-8-4-8 هدف موتاسیون مصنوعی………………………………………………………………………………
21 1-2-9 روغن‌های اسانس…………………………………………………………………………………………………
22 1-2-9-1 جداسازی و شناسایی مواد تشکیل دهنده روغن اسانسی گیاه…………………………………
فصل دوم: مروری بر تحقیقات انجام شده
23 2-1 کشت بافت……………………………………………………………………………………………………………..
24 2-2 اثر موتاژن‌ها در ایجاد تنوع در صفات مختلف………………………………………………………………
26 2-3 اثر موتاسیون اتیل متیل سولفانات در ایجاد تنوع در سطوح مختلف…………………………………
فصل سوم: مواد و روش‌ها
32 3-1 مواد گیاهی………………………………………………………………………………………………………………
32 3-2 کشت بافت……………………………………………………………………………………………………………..
32 3-2-1 تهیه محلول ذخیره محیط‌های کشت……………………………………………………………………….
33 3-2-1-1 تهیه محلول ذخیره ماکرو…………………………………………………………………………………..
34 3-2-1-2 تهیه محلول ذخیره عناصر میکرو………………………………………………………………………..
34 3-2-1-3 تهیه محلول ذخیره آهن-سدیم…………………………………………………………………………..
35 3-2-1-4 تهیه محلول ذخیره ویتامین………………………………………………………………………………..
35 3-2-2 تهیه محیط کشت………………………………………………………………………………………………….
صفحه عنوان
36 3-2-3 ضدعفونی نمونه‌های گیاهی…………………………………………………………………………………..
36 3-2-3-1 ضدعفونی اندام گیاه………………………………………………………………………………………….
37 3-2-4 تهیه ریزنمونه……………………………………………………………………………………………………….
37 3-2-5 بهینه سازی محیط کشت……………………………………………………………………………………….
37 3-2-6 بررسی نمونه‌های کشت شده…………………………………………………………………………………
38 3-2-7 تیمارهای مورد استفاده………………………………………………………………………………………….
38 3-2-7-1 روش تهیه استوک EMS …………………………………………………………………………………
39 3-2-7-2 روش اعمال تیمارهای EMS در گیاه کشت بافتی……………………………………………….
39 3-2-7-3 روش اعمال تیمارهای EMS در مزرعه……………………………………………………………..
39 3-2-7-4 روش شستشوی تیمارها……………………………………………………………………………………
40 3-3 استخراج مواد موثره گیاهی………………………………………………………………………………………..
40 3-3-1 روش‌های استخراج اسانس…………………………………………………………………………………….
40 3-4 آنالیز اجزاء اسانس……………………………………………………………………………………………………
41 3-5 آنالیزهای آماری……………………………………………………………………………………………………….
فصل چهارم: نتایج و بحث
42 4-1 بررسی نمونه‌های کشت بافتی…………………………………………………………………………………….
45 4-2 تاثیر EMS برروی خصوصیات مرفولوژیکی گیاه………………………………………………………..
46 4-2-1 اثر دوز EMS و زمان برروی طول ساقه…………………………………………………………………
47 4-2-2 اثر دوز EMS و زمان برروی طول ریشه………………………………………………………………..
47 4-2-3 اثر دوز EMS و زمان برروی تعداد برگ………………………………………………………………..
48 4-2-4 اثر دوز EMS و زمان برروی تعداد ریشه جانبی……………………………………………………..
49 4-2-5 اثر دوز EMS و زمان برروی تعداد جوانه………………………………………………………………
50 4-2-6 اثر دوز EMS و زمان برروی متوسط طول برگ………………………………………………………
51 4-2-7 اثر دوز EMS و زمان برروی تعداد ریشه……………………………………………………………….
51 4-3 ضریب همبستگی بین صفات و خصوصیات مورد بررسی……………………………………………..
52 4-4 استخراج اسانس……………………………………………………………………………………………………….
52 4-4-1 آنالیز و شناسایی کمی و کیفی اجزای موجود در اسانس…………………………………………….
صفحه عنوان
53 4-4-2 نتایج آزمایشگاهی…………………………………………………………………………………………………
53 4-4-3 نتایج مربوط به طیف کروماتوگرام گازی گیاه…………………………………………………………..
54 4-4-4 ترکیبات تشکیل دهنده اسانس………………………………………………………………………………..
فصل پنجم: نتیجه‌گیری
55 5-1 بحث………………………………………………………………………………………………………………………
55 5-1-1 کشت بافت گیاهی………………………………………………………………………………………………..
56 5-1-2 اثرات موتاژن EMS ……………………………………………………………………………………………
60 5-2 نتیجه‌گیری………………………………………………………………………………………………………………
61 5-3 پیشنهادات……………………………………………………………………………………………………………….
62 فهرست منابع فارسی………………………………………………………………………………………………………..
64 فهرست منابع انگلیسی……………………………………………………………………………………………………..
71 پیوست‌ها………………………………………………………………………………………………………………………..
75 چکیده انگلیسی……………………………………………………………………………………………………………….
فهرست جداول
صفحه عنوان جدول
33 جدول 3-1 ترکیبات محیط کشت پایه MS…………………………………………………………………….
34 جدول 3-2 جدول عناصر پرمصرف MS با غلظت X10…………………………………………………
34 جدول 3-3 جدول عناصر کم مصرف MS با غلظت X100…………………………………………….
35 جدول 3-4 محلول ذخیره آهن، ویتامین و اسیدهای آمینه با غلظت X100………………………….
41 جدول 3-5 شرایط دستگاه GC-MS……………………………………………………………………………
46 جدول 4-1 تجزیه واریانس اثر متقابل دوزEMS و زمان برروی طول ساقه گیاه نعناع فلفلی…
47 جدول 4-2 تجزیه واریانس اثر متقابل دوزEMS و زمان برروی طول ریشه گیاه نعناع فلفلی..
47 جدول 4-3 تجزیه واریانس اثر متقابل دوزEMS و زمان برروی تعداد برگ در ساقه گیاه…….
48 جدول 4-4 تجزیه واریانس اثر متقابل دوزEMS و زمان برروی تعداد ریشه جانبی گیاه………
49 جدول 4-5 تجزیه واریانس اثر متقابل دوزEMS و زمان برروی تعداد جوانه گیاه……………….
50 جدول 4-6 تجزیه واریانس اثر متقابل دوزEMS و زمان برروی متوسط طول برگ……………..
51 جدول 4-7 تجزیه واریانس اثر متقابل دوزEMS و زمان برروی تعداد ریشه گیاه………………..
52 جدول 4-8 ضریب همبستگی بین صفات و خصوصیات مورد بررسی در گیاه نعناع فلفلی……
53 جدول 4-9 درصد اسانس و روش استخراج……………………………………………………………………
54 جدول 4-10 میزان مواد موثره موجود در اسانس نعناع فلفلی…………………………………………….
فهرست شکل‌ها و پیوست‌ها
صفحه عنوان شکل
5 شکل 1-1 شمائی از گیاه کامل نعناع فلفلی……………………………………………………………………..
17 شکل 1-2 ساختار شیمیایی مواد جهش‌زا………………………………………………………………………..
53 شکل 4-1 کروماتوگرام گازی اسانس نعناع فلفلی…………………………………………………………….
58 شکل 5-1 نمای از مراحل تاثیر EMS برروی گیاه کشت بافتی…………………………………………
59 شکل 5-2 مراحل رشد گیاهان مورد تیمار موتاژن در محیط کشت…………………………………….
59 شکل 5-3 تیمار اعمال شده در مزرعه…………………………………………………………………………….
71 شکل الف-1 مراحل ضدعفونی گیاه……………………………………………………………………………….
71 شکل الف-2 تهیه ریزنمونه……………………………………………………………………………………………
72 شکل الف-3 مراحل انجام کار در اتاقک کشت………………………………………………………………..
72 شکل الف-4 نمای از دستگاه انکوباتور…………………………………………………………………………..
72 شکل الف-5 اعمال EMS در محیط کشت…………………………………………………………………….
75 شکل الف-6 اعمال EMS در مزرعه……………………………………………………………………………..
73 شکل الف-7 شستشوی تیمارهای کشت بافتی از EMS…………………………………………………..
73 شکل الف-8 شستشوی بوته‌های تیمار شده در مزرعه………………………………………………………
74 شکل الف-9 نمای از بوته‌های تیمار شده در مزرعه…………………………………………………………
74 شکل الف-10 مراحل اسانس‌گیری………………………………………………………………………………..
74 شکل الف-11 نمای از دستگاه روتاری…………………………………………………………………………..
فهرست نمودارها
صفحه عنوان نمودار
42 نمودار4-1 طول ساقه…………………………………………………………………………………………………..
43 نمودار4-2 طول ریشه…………………………………………………………………………………………………..
43 نمودار4-3 تعداد برگ در ساقه………………………………………………………………………………………
44 نمودار4-4 تعداد ریشه جانبی………………………………………………………………………………………..
44 نمودار4-5 تعداد جوانه در ساقه…………………………………………………………………………………….
45 نمودار4-6 متوسط طول………………………………………………………………………………………………..
46 نمودار4-7 اثر غلظت EMS برروی طول برگ در گیاه نعناع فلفلی……………………………………
48 نمودار4-8 اثر غلظت EMS برروی تعداد برگ در ساقه گیاه نعناع فلفلی…………………………..
49 نمودار4-9 اثر غلظت EMS برروی تعداد ریشه جانبی گیاه نعناع فلفلی…………………………….
50 نمودار4-10 اثر غلظت EMS برروی تعداد جوانه گیاه نعناع فلفلی…………………………………..
فهرست علامت‌ها و اختصارها
معادل فارسی معادل انگلیسی علامت
اتیل متیل سولفانات Ethyl Methane Sulfonate EMSکروماتوگرافی گازی توام با طیف سنجی جرمی Gas Chromatography Mass Spectroscopy GC-MS
اتیل اتان سولفانات Ethyl Ethane Sulfonate EES
بنزیل آدنین Benzyladenine BA
بنزیل آمینوپورین Benzylaminopurine BAP
ایندول-3- استیک اسید Indole3-acetic acid IAA
ایندول-3- بوتیریک اسید Indole3-butric acid IBA
نفتالین استیک اسید 1-Naphthaleneacetic acid NAA
چکیده
نعناع فلفلی با نام علمی Mentha piperitaیکی از انواع گیاهان دارویی می‌باشد که به دلیل تولید اسانس‌های با ارزش در صنایع داروسازی و بهداشتی استفاده‌های فراوانی دارد. استفاده از مواد موتاسیون‌زا از قبیل EMS می‌تواند تغییرات جهش‌زای نقطه‌ای در گیاه ایجاد کند که در نهایت منجر به ظهور فنوتیپ جدید در این گیاه با ارزش شوید. لذا این پژوهش با انجام تیمارهای متعدد از غلظت‌های مختلف EMS روی سرشاخه‌های رشد یافته در محیط کشت MS بدون هورمون و با غلظت‌های 0/0% (به عنوان شاهد)، 05/0% و 01/0% و 005/0% از EMS و مدت زمان‌های مختلف (24 و48 ساعت) و همچنین در قسمت مزرعه‌ای نیز از همین غلظت‌ها و زمان‌ها استفاده شد. ارزیابی‌ در داخل لوله آزمایش و مزرعه بطور همزمان انجام گرفت. پس از انتفال و رشد و نمو نمونه‌ها در شرایط in vitro، تیمارها با ماده جهش‌زا اتیل متان سولفانات مورد بررسی قرار گرفتند. فاکتورهای مختلف مورفولوژیکی از قبیل طول ساقه و تعداد ریشه رونده جانبی در سطح 1% و تعداد برگ و تعداد جوانه در ساقه در سطح 5% پاسخ معنی‌داری را نشان دادند. نتایج اين پژوهش نشان داد كه استفاده از مواد جهش‌زا در محیط کشت MS نقش بسزایی در تغییر فنوتیپی این گیاه دارویی دارد. غلظت 01/0% EMS بهترین نتیجه معنی‌دار را در سطح 1% و از کشت ریزنمونه‌های که شامل جوانه‌های جانبی و انتهایی بوده‌اند به‌دست آورده که برروی خصوصیاتی همچون طول ساقه، تعداد برگ و تعداد جوانه جانبی اثر داشت. آنالیز اسانس تیمارها نیز انجام شد که نتیجه آن بی‌اثر بودن این ماده اتیل متان سولفانات روی مواد اجراء اسانس این گیاه بوده است.
کلمات کلیدی: اتیل متیل سولفانات (EMS)، اجزاء اسانس، کشت درون شیشه‌ای، محیط کشت MS، نعناع فلفلی (Mentha piperita).
فصل اول
مقدمه و کلیات
1-1 مقدمه:
گیاهان به عنوان یکی از اجزاء طبیعت، از دیرگاه پشتوانه غنی نیازهای بشری بوده‌اند و می‌توان با اطمینان گفت تا زمانی که انسان در این کره خاکی به سر می‌برد، به گیاهان نیاز دارد (سلیمان زاده، 1377).
در بحث گیاهان دارویی، محدودیت‌های کاشت و نگهداری آن‌ها متعدد می‌باشد که از آن جمله می‌توان به کوتاه بودن فصل کاشت و یا برداشت بعضی از گونه‌های گیاهی، کمبود زمین‌های مناسب جهت داشت، ناچیز بودن مواد موثره حاصل از گیاه و غیره اشاره کرد (ثقه الاسلام و موسوی، 1385).
یکی از راه‌های رفع این محدودیت‌ها کشت بافت گیاهی است. تکنیک‌های کشت بافت گیاهی درحال حاضر به عنوان یک ابزار قوی جهت رفع مشکلات اساسی و کاربردی بیولوژی گیاهی درآمده است.
استفاده از گیاهان به عنوان دارو از زمان‌های خیلی دور در معالجه انسان و دام مرسوم بوده است. در حال حاضر حدود یک سوم داروهای مورد استفاده دارای منشاء گیاهی می‌باشند. کشورهای آسیایی بخصوص هند، چین و ایران سابقه بسیار طولانی در این زمینه دارند. این گیاهان مواد زیستی بخصوص و فعال با مقادیر بسیار کم تولید می‌کنند که تحت عنوان متابولیت‌های ثانویه نام‌گذاری می‌شوند. در عصر جدید، دانشمندان علوم گیاهی با استفاده از آخرین تکنیک‌های عملی کشت بافت گیاهی، توانسته‌اند از انواع گیاهان ترکیب‌های بسیار مفیدی را جهت مداوای بیماری‌های سخت و غیر قابل مداوا و موارد استفاده دیگر، بدست آورند. در طی چند دهه اخیر روش‎های متفاوتی با استفاده از بیوتکنولوژی درزمینه پرورش محصولات گیاهی برتر ابداع شده است که از جمله آن‌ها می‌توان روش‌های ایجاد گونه‌های جهش یافته و پلی پلوئید را نام برد.
گیاهان دارویی فراوانی در کشور ما می‌رویند که بسیاری از آن‌ها از جمله نعناع فلفلی دارای طیف وسیعی از خواص دارویی می‌باشند. برهمین اساس بررسی و مطالعه گیاهان دارویی ایران با استفاده از ابزارهای امروزی ضروری به نظر می‌رسد. کشت سلول و بافت که به عنوان کشت درون شیشه‌ای و یا کشت استریل نیز مطرح می‌شود، ابزاری مهم در مطالعات پایه و کاربردی بوده و دارای کاربردهای تجاری است (رجب‌بیگی و همکاران، 1385؛ سونانداکوماری و همکاران، 2003). یکی از این کاربردها امکان ایجاد گیاهان ترانسژنیک با وارد کردن DNA تقریبا از هر منبع دیگری می‌باشد. شاید اولین قدم در زمینه کشت بافت گیاهی در سال 1756 توسط هنری لوئیس داهامل برداشته شد، زمانی که وی شاهد تشکیل کالوس در حین مطالعه مواد التیام دهنده زخم‌های گیاهی بود (غضنفری، 1994).
اساس تئوری کشت بافت گیاهی توسط گتلیت هابرلنت از آکادمی علوم آلمان در سال 1902، بعد از آزمایش‌های وی روی کشت تک سلول‌ها پیشنهاد گردید (هابرلنت، 1902). توسعه روش‌های کشت بافت و زیست‌شناسی مولکولی برای تبادل DNA بین موجودات زنده غیر خویشاوند این امکان را می‌دهد که ژن‌های جدیدی از موجودات زنده خارج از سلسله گیاهی به درون گیاهان گیرنده وارد شوند. لذا مطالعه حاضر می‌تواند کمکی جهت بررسی و واکنش‌های گیاه نعناع فلفلی نسبت به تکنیک‌های مختلف کشت بافت و باززائی این گیاه از طریق کشت بافت و اثر مواد جهش‌زائی همچون اتیل متان سولفانات (EMS) باشد، تا محققین دیگر بتوانند به مطالعه خواص دارویی یا تغییرات لازم در مواد موثره یا فعال (متابولیت‌های ثانویه) و یا مطالعات انتقال ژن در این گیاه بپردازند.
1-1-1 اهمیت موضوع
برای انجام کشت بافت نعناع فلفلی (Mentha piperita) از بخش‌های مختلف گیاه مانند ریشه، برگ، ساقه و گره استفاده شد (سونانداکوماری و همکاران، 2003؛ ساجانا و همکاران، 2011). با توجه به اینکه روش معمول اصلاح و بهبود تولید متابولیت‌های ثانویه در گیاهان دارویی شامل کاشت آن‌ها در مزرعه و سپس برداشت و استخراج این مواد به روش‌های شیمیایی و غیره با مشکلات متعددی نظیر شرایط محیطی و زراعی، صرف زمان، هزینه و استفاده نیروی کار زیاد و همچنین خطرنابودی برخی از گیاهان دارویی کمیاب روبرو است، استفاده از روش‌های نوین از جمله کشت درون شیشه‌ای (in vitro) ضرورت می‌یابد به همین منظور اولین بار در سال 1976 توسط زنیک تکنیک کشت سوسپانسیون سلول‌های گیاهی حاوی متابولیت‌های ثانویه انجام گرفت. البته در ارتقاء بیوسنتز متابولیت‌های دارویی در شرایط درون شیشه‌ای اغلب، گیاهانی انتخاب می‌شوند که بازده تولید متابولیت‌های با ارزش در آن‌ها بالا باشد (باقری و صفاری، 1387).
نعناع فلفلی به عنوان یک گیاه دارویی شناخته می‌شود (امیدبیگی، 1384،1389). تاکنون مطالعات زیادی در مورد تعیین مواد موثره نعناع فلفلی صورت گرفته است (کاظم الوندی و شریفان، 1388). موارد مصرف و خواص دارویی آن نیز به خوبی مطالعه شده است اما مطالعات کشت بافت و ایجاد جهش زیاد نبوده است. با توجه به اینکه تکثیر این گیاه از طریق بذر مشکل است (بدلیل بذور کم و نابارور)، بهترین و سریع‌ترین راه برای داشتن گیاه جهت مصارف صنعتی، کشت بافت است. همچنین با در نظر گرفتن اهمیت و خواص دارویی این گیاه، مطالعات کشت بافت و بهینه‌سازی محیط کشت جهت اهداف مختلف برای این گیاه ضرورت دارد.
1-1-2 فرضیات
1- کشت بافت یکی از راه‌های سریع در ازدیاد انبوه نعناع فلفلی می‌باشد.
2- نعناع فلفلی در محیط کشت همواره در دسترس برای اعمال هر گونه اعمال تیمار از قبیل جهش می‌باشد.
3- ایجاد جهش نقطهای تا چه میزانی می‌تواند بر روی مواد موثره و میزان اسانس تغییر ایجاد نماید.
1-1-3 اهداف پژوهش
1- آشنایی با تکنیک کشت بافت گیاه دارویی نعناع فلفلی و تکثیر آن در داخل شیشه.
2- بدست آوردن مقدار قابل توجه گیاه در حال رشد برای اعمال جهش نقطه‌ای در نعناع فلفلی.
3- بررسی تغییر در میزان مواد موثره گیاه در غلظت‌های مختلف ماده جهش‌زای EMS
1-2 کلیات
1-2-1 گیاه شناسی
نعناع فلفلی با نام علمی Mentha piperita L. و بـا نـام عمومی Peppermint ازخانواده نعناعيان یک گیاه علفی چند ساله است که در رده‌بندی گیاهی از تیرهLamiaceae راسته Lamialse و رده Rosidae می‌باشد (فوستر، 1996؛ پیرس، 1999). برگ‌های آن بیضوی ، متقابل ، نوک تیز ، دندانه‌دار کمی پوشیده از کرک به درازای ۷-۴ سانتی‌متر و به عرض ۳-۲ سانتی‌متر است (فلمینگ، 1998). گل‌ها کامل نامنظم، اکثراً دوجنس یا هرمافرودیت و مجتمع به صورت گروهی در روی ساقه و در انتهای ساقه ظاهر می‌شوند گل‌ها در ماه‌های مرداد و شهریور ظاهر می‌شوند (امیدبیگی، 1384،1389). رنگ آنها گلی روشن یا کم و بیش ارغوانی مایل به بنفش می‌باشد و به تعداد زیاد نیز در مجاورت یکدیگر به نحوی مجتمع می‌شوند که مجموعاً در قسمت انتهای ساقه‌ها ، به صورت سنبله‌هایی با شکل ظاهری، بیضوی و نوک تیز جلوه می‌کند (شکل1-1). برخی از شاخه‌های این گیاه عقیم و عاری از گل باقی می‌ماند. عمر گل‌ها بسیار کوتاه و مدت کمی پس از تشکیل از گیاه جدا می‌شود، میوه کپسول ، کوچک و به رنگ قرمز تیره است (امیدبیگی، 1384،1389).
INCLUDEPICTURE “http://medicinalplants.persiangig.com/Mentha%20piperita/%DA%AF%DB%8C%D8%A7%D9%87%20%D8%AF%D8%A7%D8%B1%D9%88%DB%8C%DB%8C%20%D9%86%D8%B9%D9%86%D8%A7%D8%B9%20%D9%81%D9%84%D9%81%D9%84%DB%8C%20Mentha%20piperita%202.jpg” \* MERGEFORMATINET
شکل1-1شمائی از گیاه کامل نعناع فلفلی
از جمله ویژگی‌های تشریحی نعناع فلفلی، کرک‌های ترشحی اسانس در آن‌ است که دارای پایه یک یا چند سلولی منتهی به یک برجستگی ۴ تا ۸ سلولی و حتی بیشتر می‌باشد . اسانس ترشح شده نیز معمولاً خارج از جدار سلولزی ، در زیر کوتیکول جمع می‌گردد و این خود باعث می‌شود که بشره در همان ناحیه کمی متورم جلوه نماید (امیدبیگی، 1384،1389).
اسانس گیاه نعناع فلفلی در ابتدای رویش گیاه در غده‌های پیکررویشی گیاه ساخته و ذخیره می‌شود . تعداد کل غده از حدود ۱۰۰ غده برای برگ‌های به طول ۲ میلی‌متر تا حدود ۷۵۰۰ غده برای برگ‌های ۲۵ میلی‌متری نعناع فلفلی متغیر است. برگ‌ها ۲ تا ۷/۲ درصد و گل‌ها ۴ تا 6درصد اسانس دارند. ساقه‌ها معمولاً فاقد اسانس می‌باشند. به‌طور متوسط مقداراسانس در اندام‌های هوایی گیاه ۱ تا 5/1 درصد گزارش شده است (امیدبیگی، 1384،1389).
1-2-2 نیازهای اکولوژیکی
نعناع فلفلی در طول دوره رویش به هوای نسبتا گرم و تابش نور کافی نیاز دارد. در طول دوره رویش نیاز به آب کافی دارد. اين گياه در مناطقي كه داراي زمستان‌هاي ملايم (حداقل دما 8 – درجه سانتي‌گراد) و خاك با PH بين 5-8 باشد قابل كشت است . به طور كلي خاك‌هاي اسيدي و زهكشي شده براي كشت نعناع فلفلي مناسب هستند، اين گياه زمستان را بصورت ركود به سرمي‌برد و در فصل بهـــار مجدداً رشد كرده و سرشاخه مي‌دهد (فصلنامه پژوهشی،1383).
1-2-3 خاستگاه و دامنه انتشار
گیاهان تیره نعناع طوری در کره زمین پراکنده شده‌اند که در اغلب نواحی یافت می‌شوند ، ولی بیشینه انتشار آنها در منطقه مدیترانه است . امروزه در کشورهای مختلف جهان ، متجاوز از چند هزار تن اسانس در سال ، از این گیاهان تهیه می‌شود و این خود درجه اهمیت و توسعه کشت آن‌ها را در نقاط مختلف کره زمین نشان می‌دهد. اسانس مانت کشور انگلستان که به اسانس میچام موسوم است ، بهترین نوع آن به حساب می‌آید (زرگری، 1368-1380). در مورد منشاء این گیاه اختلاف نظرهایی وجود دارد. عده‌ای از گیاه شناسان آسیا را منشاء نعناع می‌دانند، در حالی‌که عده‌ای دیگر از محققان منشاء آن را انگلیس دانسته و معتقدند که این گیاه در قرن هفدهم، در انگلیس به وجود آمده است (امیدبیگی 1389).
1-2-4 خواص دارویی
در حال حاضر از اسانس نعناع گونه piperita همراه دیگر گونه‌های گیاهی در ساخت داروهای گیاهی زیر که در کشور ایران به ثبت رسیده است، استفاده می‌شود. برای مثال قرص مکیدنی آلتادین (موارد مصرف: التهاب‌های مخاط گلو و دهان)، قرص‌های روکش‌دار آلیکوم (موارد مصرف: پایین آورنده فشار و چربی خون، ضد تصلب شرایین، ضد نفخ، اشتها آور)، گرانول پلانتاژل (موارد مصرف: اسهال‌های ساده)، قرص درگلیس (موارد مصرف: درمان زخم معده و زخم اثنی عشر، گاستریت و نفخ معده)، پودر کارامین (موارد مصرف: اختلال‌های هضم همراه نفخ)، شربت کاراوی میکسچر (موارد مصرف: دل درد نوزادان و اختلالات گوارشی در کودکان) ، قرص مکیدنی ماسومنت (موارد مصرف: التهاب گلو در سرماخوردگی‌ها و سرفه)، قرص جویدنی مانت (موارد مصرف: اسپاسم‌های دستگاه گوارش، نفخ معده و به عنوان خوشبو کننده دهان)، ژل منتاژل (موارد مصرف: قارچ کچلی لای انگشتان پا و کشاله ران، ضد خارش و سوزش، گزیدگی‌ها و سوختگی‌های سطحی) (میرحیدر، 1377؛ فون ویک و وینک، 2008).
1-2-5 موارد استفاده
بيشترين مصرف نعناع فلفلي به منظور تهيه اسانس است (امیدبیگی، 1384). اسانس این گیاه در طب سنتی مورد استفاده قرار می‌گيرد (ویکرانت و همکاران، 2006). اين اسانس خاصیت ضد قارچی (بشهوس و ترونتون،1997؛ پاندی و همکاران، 1996) و ضد میکروبی دارد (امیدبیگی، 1389؛ زمانی‌زاده و همکاران، 1379؛ خان و همکاران، 2003؛ موررای، 1995؛ موریرا و همکاران، 2005). اسانس نعناع فلفلی در صنایع غذايي، بهداشتي، آرايشي، شیرینی پزی، تولید ادویه و نوشابه سازي مصرف شده و از طعم آن در بهبود مزه داروهای بدمزه استفاده مي‌گردد (میرحیدر، 1377).
در محلول‌های شستشوی دهان و گلو و خمیر دندان به خاطر خاصیت ضد باکتریایی منتول موجود در اسانس نعناع فلفلی، از آن استفاده می‌شود (زمانی‌زاده و همکاران، 1379). از اين گياه در تركيب داروهاي گياهي توليد شده در كشور از جمله آلتادين، ماسومنت، قطره نعناع، منتاوآليكوم استفاده شده است.
1-2-6 مواد موثره و اجزاء اسانس
ترکیبات اصلی اسانس شامل منتول ، منتون و منتیل استات تشکیل می‌دهد. اسانس گیاه جهت مصارف دارویی از قسمت‌های هوایی گیاه در آغاز مرحله گل‌دهی و با تقطیر با بخارآب به دست می‌آید و به گونه‌ای استاندارد می‌شود که حاوی حداقل 44درصد منتول، 15تا 30 درصد منتون و 5 درصد استر به علاوه انواع ترپنوییدها باشد. سایر ترکیباتی که در اسانس یافت می‌شود شامل فلاونوئید، پلی‌فنل‌های پلیمریزه شده، کاروتن، توکوفرول بی‌تین و چولاین می‌باشد (مورای، 1995).
1-2-7 کشت بافت گیاهی
کشت بافت گیاهی عبارت است از کشت درون شیشه‌ای گیاهان یا بذور و اجزای گیاهی (بافت، اندام، جنین، تک‌ سلول، پروتوپلاست) در محیط‌های غذائی و تحت شرایط استریل. برخلاف سلول‌های جانوری، سلول گیاهی حتی در مراحل پیشرفته بلوغ و تمایز، در صورتی‌که سیستم غشائی و هسته آن سالم و فعال باشد، توانائی تغییر به حالت مریستمی و نمو به گیاه کامل را دارد. بنابراین هر قسمت از یک گیاه ممکن است در شرایط مناسب و ویژه بتواند یک جنین کامل ایجاد نماید. ایده انجام آزمایشات با استفاده از بافت‌ها و اندام‌های مجزا شده گیاهان تحت شرایط آزمایشگاهی کنترل شده، در اواخر قرن نوزدهم مطرح شده و در تحقیقات هابرلند بیان گردیده است (ملایری، 1375). در سال 1961 روش استفاده از آگار در پتری دیش معرفی شد. در این روش سلول‌های تکی را با آگار گرم شده مخلوط و حاصل را در پتری دیش به صورت یک لایه نازک پهن می‌کردند. این موضوع که یک سلول منفرد توانائی تقسیم و تکثیر داشته و نهایتا می‌تواند به یک گیاه کامل تبدیل شود در سال 1965 اعلام شد (افشاری‌پور، 1372).
مزيت تكثير از طريق كشت بافت نسبت به ساير روش‌هاي مرسوم، توليد تعداد زيادي گياه با محتواي ژنتيكي يكسان و كيفيت يكنواخت، در زمان كوتاه‌تر و فضاي نسبتاً محدود مي‌باشد (ساتیش و باوان اندان، 1988 مانتل و هوگو، 1989؛ باسو و چاند، 996 ؛ شاسانی و همکاران، 1998).
در کشت بافت گیاهی بیشتر اوقات یک ریزنمونه را برای شروع رشد در محیط کشت مصنوعی قرار می‌دهیم سلول‌های غیرفعال ، تمایزیافته و تقسیم نشده و ریزنمونه در حین رشد در محیط غذایی ابتدا متحمل تغییراتی برای وارد شدن به حالت مریستمی می‌شوند (آدام و ویندل، 2005). پدیده بازگشت سلول‌های بالغ به مرحله مریستمی و شکل‌گیری بافت کالوس را تمایززدایی می‌نامند. از آنجا که ریزنمونه چند سلولی، متشکل از انواع مختلفی از سلول‌ها می‌باشد بنابراین سلول‌های بافت کالوس نیز هتروژن خواهند بود. توانایی سلول‌های بافت کالوس برای تمایز یافتن به یک گیاه کامل و یا یک اندام گیاهی را تمایز مجدد می‌نامند. این دو پدیده یعنی خارج شدن از حالت تمایز با تمایززدایی و تمایز مجدد از ظرفیت‌های ذاتی سلول‌های گیاهی هستند و تکامل آنها به گیاه کامل به عنوان توتی‌پتانسی توصیف می‌گردد. عموما قبل از اینکه سلول‌ها بتوانند وارد تمایز مجدد شده و گیاه کامل تولید نمایند مرحله کالوس را بایستی بگذرانند (فارسی و ذوالعلی،1382).
همچنین استفاده از راهكارهاي فناوري زيستي از جمله كشت سوسپانسيون سلولي، كشت اندام (كشت ريشه‌هاي موئين و ساقه) راه حلي مناسب براي توليد سريع و انبوه متابوليت‌هاي ثانويه مي‌باشد (پیزوتو، 1996؛ راو و راویش انکار، 2002؛ بورگاد و همکاران، 2002 ؛ مالاباگال و تسای، 2004).
1-2-7-1 انواع کشت بافت گیاهی
انواع مختلفی از کشت بافت گیاهی وجود دارد (رجب‌بیگی و همکاران، 1385)
کشت بذر: یک بذر ممکن است در محیط مصنوعی (in vitro) کشت شود، و یک گیاهچه و نهایتا یک گیاه کامل تولید کند.
کشت جنین: در این نوع کشت، جنین جدا شده، پس از حذف پوسته بذر، کشت می‌شود.
کشت اندام گیاهی: یک اندام جدا شده، در محیط مصنوعی (in vitro)رشد می‌کند. در کشت اندام، انواع مختلفی مثل جنین‌ها، بساک‌ها و تخمدان‌ها وجود دارد.
کشت کالوس: اگر یک بافت تمایز یافته جدا شود و در محیط مصنوعی ، تولید یک توده سلولی تمایز نیافته به نام کالوس نماید، این پدیده را کشت کالوس می‌نامند.
کشت سلول: کشت سلول‌های منفرد که به کمک آنزیم‌ها یا به روش‌های مکانیکی از یک بافت گیاهی، کالوس یا سوسپانسیون سلولی بدست می‌آیند، کشت سلول نامیده می‌شود.
کشت پروتوپلاست: کشت پروتوپلاست‌هائی که در اثر هضم آنزیمی دیواره سلول به وجود آمده‌اند، کشت پروتوپلاست نام دارد.
1-2-7-2 بررسی اثرات فاکتورهای مختلف در محیط کشت
انتخاب محیط کشت یا تهیه ترکیب آن برای موفقیت در کشت بافت ضروری است. هیچ محیط کشت مشخصی را نمی‌توان برای رشد انواع سلول‌ها توصیه کرد و اغلب لازم است تغییراتی در محیط کشت برای پاسخگوئی انواع مختلف ریزنمونه صورت گیرد. بطور کلی محیط کشت حاوی نمک‌های غیرآلی و ترکیبات معدنی مثل تنظیم کننده‌های رشد ، ویتامین‌ها، کربوهیدرات‌ها و یک عامل ژلی برای انجماد محیط کشت می‌باشد (افشاری‌پور، 1372؛ باقری و آزادی، 1381).
بافت‌های گیاهی کشت شده نیاز به ترکیبات شیمیایی غیرآلی ویژه‌ای دارند. به غیر از کربن، هیدروژن و اکسیژن، عناصر اساسی دیگر که به مقادیر نسبتا زیادی مورد نیاز گیاه می‌باشد عبارتند از : ازت، فسفر، پتاسیم، کلسیم، منیزیم و گوگرد. به این عناصر، پر مصرف می‌گویند (افشاری‌پور، 1372).
آهن، منگنز، مس، برم، روی و مولیبدن نیز برای رشد گیاهان لازم است اما به مقادیر خیلی کمتر. به این عناصر کم مصرف می‌گویند (افشاری‌پور، 1372). براساس توصیه‌های انجمن بین‌المللی فیزیولوژی گیاهی، عناصری که در غلظت‌های کمتر از 5/0 میلی‌مول برلیتر هستند عناصر کم مصرف نامیده می‌شوند. این 15 عنصر که برای رشد گیاهان در طبیعت مهم هستند برای کشت‌های بافت نیز ضروری می‌باشند. در ترکیب نمک‌ها و یون‌های محیط‌های کشت مختلف بافت‌های گیاهی، از نظر کمی و کیفی اختلاف اندکی وجود دارد (بوجانیس، 1989).
1-2-7-3 نمک‌های غیرآلی
ترکیب نمک‌های غیرآلی می‌تواند متفاوت باشد. اون و میلر (1992) ترکیب محیط‌های کشتی را که بطور گسترده‌ای استفاده می‌شوند، بدقت مورد بررسی قرار دادند و خطای اندکی را در این ترکیب‌ها گزارش کردند. ترکیب موراشیگ و اسکوک(1962)یا MS ترکیبی است که بطور گسترده از آن استفاده می‌شود (اسمیت و گولد، 1989). به مقدار نمک آن بطور خاص توجه شده است. ترکیب MS به این منظور تهیه شد تا نشان داده شود که اضافه نمودن عصاره بافت‌های گیاهی که در آن زمان به محیط کشت اضافه می‌شد، رشد سلولی در کشت in vitro را افزایش نمی‌دهد. ترکیب MS ثابت کرد که مواد غذائی غیرآلی، عامل محدود کننده رشد سلولی توتون نبوده و مکمل‌های آلی نظیر عصاره مخمر، شیر نارگیل، هیدرولیزات کازئین و عصاره گیاهی به اندازه نمک‌های غیرآلی ضروری نیستند (باقری و آزادی، 1381).
1-2-7-4 ویتامین‌ها
ویتامین‌های افزودنی برای کشت سلول و بافت گیاهی ضروری نیستند، هرچند که ویتامین B1 (تیامین) در کشت بافت برخی گونه‌ها سودمند به نظر می‌رسد، با این وجود بیوتین، پانتوتنیک اسید، نیکوتینیک اسید (نیاسین)، پیریدوکسین(پیریدوکسال- ویتامین B6)، اسید فولیک، اسید اسکوروبیک (ویتامین C) و توکوفرول به برخی محیط‌های کشت اضافه می‌گردند (چان و همکاران، 2000).
1-2-7-5 منبع انرژی
سلول‌های سبز کشت شده، معمولا از نظر فتوسنتزی فعال نبوده و به یک منبع کربن نیاز دارند. متداول‌ترین منبع انرژی کربن مورد استفاده در محیط‌های کشت سلول گیاهی، ساکاروز است اما گلوکز و فروکتوز هم مورد استفاده قرار می‌گیرند (فارامی و همکاران، 2000).
1-2-7-6 میواینوسیتول
میواینوسیتول یک الکل-قند است که به وفور در محیط‌های کشتی که برای تک لپه‌ای‌ها، بازدانگان و برخی دولپه‌ای ها تهیه می‌شود، مورد استفاده قرار می‌گیرد. این ماده در تشکیل غشاء و دیواره سلولی نقش دارد. میواینوسیتول را می‌توان مستقیما به محیط کشت اضافه کرد و نیازی به تهیه محلول ذخیره نیست (بروسا و زییلجازکوو، 2008).
1-2-7-7 عوامل فیزیکی
نور و دما از مهمترین عوامل فیزیکی موثر بر رشد می‌باشد. نور باعث تحریک اندام‌زائی می‌شود، اما از رشد ریشه جلوگیری می‌کند. اثر نور بر اندام‌زائی ممکن است به طور مستقیم یا غیر مستقیم مربوط به تجمع نشاسته در سلول‌های خاصی باشد و نشاسته باعث افزایش حضور سیتوکنین‌ها از جمله کینتین می‌شود (رجب‌بیگی و همکاران، 1385). دما نیز از جمله عوامل موثر بر رشد سلول بافت گیاهی است. برای اغلب کشت‌ها، دمای بین 20 تا 25 درجه سانتی‌گراد جهت رشد مناسب است. دمای بالاتر از 28 درجه سانتی‌گراد باعث تبخیر آب موجود در محیط کشت شده و سبب محدودیت رشد بافت می‌شود (اوانس و همکاران، 1984).
1-2-7-8 ریزنمونه
عوامل مختلفی بر چگونگی پاسخ‌دهی ریزنمونه‌ها کشت شده تاثیر گذارند که از آن جمله می‌توان به ژنوتیپ گیاه مادری، شرایط رشد، سن زیرنمونه، زمان انتخاب ریزنمونه و… اشاره کرد. به طور کلی بهتر است بافت‌های دارای سلول‌های زنده جوان به عنوان ریزنمونه مورد استفاده قرار گیرند، زیرا سلول‌های تشکیل دهنده بافت‌های جوان دارای واکوئل کوچکی هستند و بنابراین فعالیت و توانایی زیادی در ایجاد گیاه باززائی شده دارند (طباطبایی و امیدی، 1390).
1-2-7-9 چگونگی انتخاب محیط کشت
انتخاب یک محیط کشت بیشتر بستگی به گونه‌های گیاهی، بافت یا اندام مورد کشت و هدف از انجام آزمایش دارد (دیویس، 1994). به منظور انتخاب یک محیط کشت مناسب برای کشت مورد نیاز بهتر است که ابتدا با یک محیط کشت پایه مثل MS شروع نمود سپس به وسیله یک سری تغییرات کیفی و کمی در محیط کشت از طریق یک سری آزمایشات، یک محیط کشت مناسب را بدست آورد (بوجوانیس، 1989).
1-2-7-10 ریزازدیادی گیاهان از طریق کشت بافت
ریزازدیادی عبارت است از تکثیر درون شیشه‌ای گیاه از اندام‌ها، بافت‌ها، سلول‌ها و پروتوپلاست و غیره. در برخی منابع نیز عنوان ریزازدیادی طیف وسیعی از روش‌ها و تکنیک‌های کشت بافت را شامل می‌شود که از جوانه، نوک ریشه، بافت، برگ‌ها، رویان‌ها، پرچم‌ها و حتی سلول‌های منفرد به‌عنوان ریزنمونه در آن‌ها استفاده می‌شود ولی شناخته شده‌ترین معنی ریزازدیادی، تکنیک مبتنی بر کشت جوانه‌های منفرد و یا مجتمع و یا شاخساره‌های حامل 2 تا3 جوانه باشد (باقری، 1386). اکثر گیاهان عالی دارای مریستم‌هائی در محور برگ هستند که هر کدام قادر به ایجاد گیاه کامل می‌باشند. مریستم‌ها محل‌هائی در گیاه هستند که در آنجا تقسیم سلولی میتوز فعال می‌باشد و از آن محل‌ها بافت‌های دائمی منشاء می‌گیرند. گروهی از سلول‌های تمایز نیافته در نوک ساقه و شاخساره وجود دارند که تشکیل مریستم انتهائی را می‌دهند (باقری و آزادی، 1381). همچنین این سلول‌ها ممکن است بین آوندهای چوبی و آبکش قرار گیرند که موسوم به کامبیوم می‌باشند و یا در برگ‌های جوان و در قسمت پائین قطعات بین گره‌ای واقع شوند که مریستم‌های انترکالری نامیده می‌شوند. به طور کلی هدف از ریزازدیادی، حداکثر تولید از یک گیاه در زمان معین و در عین حال ایجاد مجموعه‌ای از گیاهان با خصوصیات ژنتیکی یکسان و با صفات کمی و کیفی مورد نظر می‌باشد (باقری و صفاری، 1387).
1-2-7-11 ریشه‌زائی
معمول‌ترین پاسخی که در کشت ریزنمونه‌های مختلف گیاهی در کشت بافت مشاهده می‌شود تشکیل ریشه می‌باشد. به طور کلی ریشه‌زائی در پاسخ به هورمون‌های اکسینی از قبیل IBA,NAA وIAA صورت می‌گیرد. از این میان NAA, IBA به فراوانی در مورد بسیاری از گیاهان استفاده شده است. برای گیاهانی که به سادگی ریشه می‌دهند این مرحله ضروری نیست و بسیاری از پروتکل‌های تجاری، این مرحله را حذف می‌کنند (ایوان و همکاران، 2003).
1-2-8 تعریف موتاسیون(جهش)
جهش یا موتاسیون به طور ساده عبارتست از یک تغییر در توالی نوکلئوتیدی یک مولکول DNA (بروان، 2009). واژه موتاسیون از کلمه لاتین (mutation) به معنای یک تغییر عمده و اساسی و ناگهانی مشتق شده است. اما تا قبل از آنکه شیوه‌های جدیدی برای استخراج و جداسازی ژن‌ها به عنوان قطعاتی از DNA به دست آید، تنها راه درک و فهم وجود ژن‌ها و بررسی و تعیین نقش آن‌ها، مطالعه تنوع ژنتیکی و وراثت بود. با بررسی یک تغییر و تفاوت موروثی کاملا مشخص در فنوتیپ یک موجود زنده منشاء آن را به یک ژن خاص نسبت می‌دادند و آن تغییر را موتاسیون می‌خواندند. گاهی نیز آسیب و تغییر در ماده ژنتیکی ممکن است در ژن‌هایی رخ بدهد که از حیث اطلاعات ژنتیکی غیرفعال باشند. نظیر قطعات صامت در زنجیره DNA که اساسا از آن‌ها رونویسی صورت نمی‌گیرد، یا در ژن‌هایی صورت بگیرد که آن نوع ژن به تعداد زیاد و مکرر در DNA وجود دارد. آسیب در این نوع ژن‌ها نیز اثر فنوتیپی ایجاد نمی‌نماید، اما به طور کلی آن تغییراتی در ماده ژنتیکی، موتاسیون محسوب می‌شوند که غیرعادی و دائمی باشند. بنابراین با توجه به موارد فوق الذکر و با مدنظر گرفتن حداقل شرایط و ویژگی‌های تغییرات موتاسیون می‌توان گفت که موتاسیون فرآیندی پویشی است که موجب تغییر مجموعه توارثی سلول و نهایتا ایجاد یک موجود زنده‌ای با ویژگی‌های جدید ژنتیکی می‌گردد یا به‌عبارت دیگر موتاسیون، یک تغییر قابل وراثت است که بر کروموزوم اثر دائم می‌گذارد و منجر به ایجاد یک موجود جهش یافته یا موتانت می‌شود (بروان، 2009).
1-2-8-1 تاریخچه استفاده از موتاسیون
قدمت موتاسیون را می‌توان معادل قدمت علم ژنتیک دانست زیرا نخستین بار Hugode Vries هلندی در سال 1901 انجمن مطالعات مورفولوژی برروی گیاه پامچال به این پدیده مهم پی‌برد و ظهور خصوصیات جدید ارثی در این گیاه را موتاسیون نامید. هرچند که پیش از نامبرده داروین در یافته بود که گونه‌ها قابلیت جهش یا دگرگون ناگهانی دارند و به همین نحو لینه نیز متوجه شده بود که تعدادی از موتاسیون‌ها سیستم طبقه‌بندی و نام‌گذاری را دچاره پیچیدگی می‌کنند اما در آن زمان ماهیت آن پدیده به درستی درک نشوده بود اما ژنوتیپ‌های تغییر یافته به طریق مصنوعی (موتانت‌های القائ) اولین بار در سال 1927 توسط مولر ( با اشعه X) روی مگس سرکه و بعد از آن در سال 29-1928 توسط استولر در گیاهان زراعی شناسایی شدند. اولین کار در رابطه با اشعه X در جهت مطالعات بیوفیزیکی اثرات پرتودهی روی سیستم‌های بیولوژیکی و ایجاد یک تغییر مفید بوده است (استوسکوف و همکاران، 1997).
بعد از آن به طور جدی روی جمعیت مصنوعی حاصل از موتاسیون در گیاهان زراعی مختلف با استفاده از عوامل متعدد موتاژنی کار شد که این عمل به از جنگ جهانی دوم بوده است.
یکی از روش‌های استخراج مواد موثره گیاهی با حلال است. حلال‌های شیمیایی گوناگونی مانند اتانول، متانول، استن، گلیسیرین و گلایتول‌ها می‌توانند مورد استفاده قرار گیرند (باتالی و همکاران، 1968).
1-2-8-2 سطوح ایجاد موتاسیون
از نظر متخصصان ژنتیک، جهش در دو سطح اتفاق می‌افتد (ارزانی و مرتضوی1380)
جهش ژنی: یک همردیف ژنی مربوط به یک ژن تغییر می‌کند و به همردیف ژنی دیگری تبدیل می‌گردد. از آنجایی که این تغییر در داخل یک ژن در یک مکان کروموزومی (نقطه‌ای) بوقوع می‌پیوندد، این جهش را گاهی جهش نقطه‌ای نیز می‌نامند.
جهش کروموزومی: شامل بخش‌هایی از کروموزوم، کل کروموزوم ویا حتی مجموعه‌ای از کروموزوم‌ها می‌باشد که بیشتر ترتیب کروموزم‌ها و ژن‌ها روی آن‌ها را تحت تاثیر قرار می‌دهد.
1-2-8-3 انواع موتاسیون:
موتاسیون به دو گروه عمده سماتیک (بدنی) و زایشی تقسیم شده و هر یک از این جهش‌ها ممکن است در یکی از زیر گروه‌های ذیل قرار گیرند (ارزانی و مرتضوی، 1380)
جهش ظاهری یا مرفولوژیکی: این نوع جهش برصفات ظاهری قابل مشاهده اثر می‌گذارد.
جهش کشنده: آلل جهش یافته با اثر کشندگی روی بقای موجود، شناسایی می‌گردد.
جهش شرطی: آلل جهش یافته فقط در شرایط محیطی معینی تحت عنوان شرایط محدود کننده جهش می‌یابد.
جهش بیوشیمیایی: این جهش از طریق توقف یا تغییر فعالیت بیوشیمیایی سلول‌ها شناسایی می‌گردد.
جهش از بین برنده وظیفه: جهشی که مخرب بوده و ناحیه فعال ژن را حذف نموده یا تغییر می‌دهد.
1-2-8-4 موتاژن(عامل جهش‌زا):
موتاژن نام عمومی موادی است که باعث القاء مصنوعی موتاسیون می‌گردند. به عبارت دیگر موادی که اثرات زیستی القاء جهش آن‌ها به مراتب بیش از میزانی است که به طور طبیعی یا اتفاقی رخ می‌دهد (فارسی و باقری، 1377؛ بروان، 2007).
1-2-8-4-1 انواع موتاژن:
موتاژن‌ها به دو گروه کلی تقسیم می‌شوند:
1- عوامل فيزيكي(انواع پرتوها، گرما)
2- عوامل شيميايي (انواع مواد شیمیایی)
موتاژن‌های فیزیکی: این موتاژن‌ها شامل انواع پرتوهای یونیزه کننده مانند اشعه X، نوترون‌ها، اشعه گاما، اشعه آلفا، اشعه بتا، نوترون‌های حرارتی و جدیدترین نوع آن‌ها لیزرها و پرتو غیریونیزه کننده اشعه ماوراء بنفش (UV) می‌باشند. اثر پرتوتابی جمع‌پذیر است، یعنی اگر مجموعه‌ای در معرض تابش قرار می‌گیرد، فراوانی جهش‌های القاء یا کل مقدار پرتوهای جذب شده در طی زمان نسبت مستقیم دارد (بروان، 2009).
2- موتاژن‌های شیمیایی: این موتاژن‌ها شامل اتیل متیل سولفانات(EMS)، آکریدینها،پروفلاوینها، آنالوگ‌های بازی، دی اتیل سولفور(DES)، اتیل آمین (EL)، نیتروز،N متیل اوراتان(NMUT) و… می‌باشد (اهدایی، 1372؛ فارسی و باقری، 1377).
جهش‌زائی مواد شیمیایی از نظر آزمایشی بسیار مهم است، زیرا در بسیاری از موارد واکنش‌های شیمیایی مسئول عمل جهش‌زائی شناسایی گردیده و این دانش می‌تواند برای تولید انواع بخصوصی از جهش‌ها مورد استفاده قرار گیرد. علاوه براین، بسیاری از مواد شیمیایی نسبت به پرتوتابی سمیت کمتری برای موجود داشته و فراوانی جهش‌زائی آن‌ها نیز بیشتر است. از این رو، مواد شیمیایی جهش‌زا به عنوان ابزار تحقیقاتی در تولید انواع گسترده‌ای از جهش‌ها مفیدند (امیدی و ایزدی‌دربندی، 1388).
1-2-8-4-2 عوامل شیمیایی جهش‌زا (بروان، 2009).
1- عوامل آلكيله کننده: سبب ایجاد جهش نقطه‌ای می‌گردند. مواد شیمیایی مانند EMS(اتيل متیل سولفانات) و EES (اتيل اتان سولفانات) و دی‌متیل نیتروزآمین از جمله عوامل آلكيله کننده هستند که سبب اضافه شدن گروه‌های آلکیل به نوکلئوتیدهای مولکول DNA می‌گردند (شکل1-2).
2- آنالوگ‌هاي بازي: 5- برومويوراسيل يك آنالوگ بازي است كه مشابه تيمين را در آورد اما به جاي اتصال به A به G وصل مي‌شود و جفت A-T را به G-C تبديل مي‌كند. معروف‌ترين آنالوگ‌ها، 5-برومو يوراسيل ، 2-آمينوپورين، 5-فلورويوراسيل و مركاپتوپورين‌ها هستند.

شکل1-2 ساختار شیمیایی مواد جهش‌زا
3- عوامل درج شونده:اين عوامل ، عواملي هستند كه خودشان را بين بازهاي DNA جا مي‌دهند . حداقل ويژگي آن‌ها اين است كه مسطح باشند چرا كه بازها بدليل آروماتيك بودن مسطح‌اند وگرنه سيستم‌هاي ترميم آنها را شناسايي كرده و از بين مي‌برد . يعني يك عامل سه بعدي را سيستم repair به راحتي از بازهاي DNA شناسايي كرده و از DNA بيرون مي‌اندازد . اما درج شونده‌ها آروماتيك‌اند و مسطح بوده و خود را به راحتي در DNA پنهان مي‌كنند . نمونه‌هاي درج شونده‌ها شامل اتيديوم برومايد و بعضي مشتقات فلاوين‌ها است كه سبب جهش Frame shift مي‌شوند. با وجود اينكه اتيديوم برومايد ( ETBr) يك عامل درج شونده و جهش‌زای خطرناک است در بيولوژي مولكولي بسيار كاربرد دارد و هنگام رنگ آميزي DNA از آن استفاده مي‌شود .
4- عوامل دآمینه کننده: سبب ایجاد جهش نقطه‌ای می‌شوند. در مولکول‌های DNAی ژنومی تا حدی دآمیناسیون بازی به طور خودبه‌خود به وقوع می‌پیوندد. این میزان به دلیل وجود مواد شیمیایی خاص مانند اسید نیترو افزایش می‌یابد. اسید نیترو، آدنین و سیتوزین و گوانین را دآمینه می‌کند.
5- هيدروكسيل آمين: باعث هیدروکسیله شدن گروه‌های آمین بازها می‌شود در نتیجه C با A جفت می شود (بروان، 2009).
1-2-8-4-3 مواد گیاهی مورد تیمار:
این مواد شامل بذر، دانه گرده، گیاهچه، جوانه، قلمه، بافت کالوس و یا گیاه کامل می‌باشند، بذور مسن نسبت به بذور جوان بهتر بوده و بیشتر تحت تاثیر موتاژن قرار می‌گیرند. بهتر است میزان رطوبت بذر درحد نرمال (14%-13%) باشد. بذور زیاد تازه یا کهنه مناسب نمی‌باشند. اگر می‌خواهیم درگامت‌ها (دانه‌گرده) موتاسیون ایجاد کنیم بهتر است که تقسیمات میوزی را تحت‌تاثیر قرار دهیم، زیرا سلول‌های میوزی نسبت به سلول‌های میتوزی به موتاژن‌ها حساس‌ترند. گیاه را در هر مرحله از رشد می‌توان تحت تاثیر موتاژن قرار داد. اما گیاهان بالغ حساسیت کمتری نسبت به این عوامل نشان می‌دهند. تیمار قلمه در گل‌ها و درختان میوه که دارای تکثیر غیرجنسی می‌باشند کاربری دارد (فارسی و باقری، 1377).
چگونگی استفاده از عوامل موتاژن با توجه به گونه گیاهی، هدف‌های آزمایش و اندام‌های مختلف مورد نظر متفاوت است.
1-2-8-4-4 اصلاح به روش موتاسیون:
اصلاح موتاسیونی که به صورت خلق و ایجاد جهش‌ها واستفاده از آن‌ها برای تولید واریته‌های جدید گیاهان زراعی تعریف می‌شود به عنوان یک روش مکمل در کنار سایر روش‌های اصلاحی مورد استفاده قرار می‌گیرد. این روش در گیاهان خودگشن و دگرگشن کاربرد دارد، اما از آن جایی که اکثر موتاسیون‌ها از نوع مغلوب می‌باشند و وجود هموزیگوتی برای بروز ژن به شکل مطلوب ضروری است، لذا نتایج مربوط به استفاده از این روش در گیاهان خودگشن مطلوب‌تر بوده است (ایرباچ، 1976).
1-2-8-4-5 اهمیت موتاسیون در اصلاح نباتات
القاء موتاسیون روشی برای افزایش تنوع ژنتیکی می‌باشد که همراه با انتخاب، نوترکیبی یا ترکیبی از این دو در اصلاح گیاهان مورد استفاده قرار می‌گیرد. موتاسیون‌ها به عنوان یک منبع تنوع، تنوع طبیعی موجود را تکمیل کرده و در بخشی از فرآیند دو قسمتی تکامل که شامل تنوع انتخاب می‌باشد، سهیم می گردند (بروک، 1976).
در حقیقت موتاسیون با ایجاد تنوع جدید، زمینه را برای ظهور قابلیت‌های بالقوه ژنتیکی که به طور طبیعی امکان بروز نمی‌یابند، فراهم می‌سازد. موتاسیون‌های القاء سهم عمده‌ای در شناخت مکانیسم ژنتیکی، بویژه درک ساختار و عملکرد مواد ژنتیکی دارند. تنوع حاصل از جهش اگر موجب سازگاری شود به حفظ بقای موجودات در محیط‌های متغیر کمک می‌کند. استفاده از موتاسیون برای افزایش تنوع ژتنیکی در برخی محصولات مهم زراعی مانند سویا، برنج که دارای خزانه ژنتیکی محدودی هستند (کایواس پریز و همکاران، 1992؛ هیروموتو و ویلو، 1986) دارای اهمیت زیادی می‌باشند.
1-2-8-4-6 موفقیت موتاسیون‌
موفقیت موتاسیون بستگی به محیط دارد. جهشی که به حفظ موفقیت یک ارگانیسم کمک می‌کند، ممکن است بسته به محیط، برای ارگانسیم دیگر مضر باشد. از طرف دیگر، موفقیت در اصلاح موتاسیونی، بیشتر بستگی به این دارد که فرآیند جهش، از زمان القاء تا انتخاب موفق باشد (موریس وهنری، 1974).
جهش‌های مفید عموما به سرعت از طریق جمعیت به نسل‌های بعدی انتقال می‌یابند.
1-2-8-4-7 روش‌های جدید استفاده از موتاسیون
امروزه موتاسیون به عنوان ابزاری در روش‌های مهندسی ژنتیک نیز بکار گرفته می‌شود. این پدیده کاربرد وسیعی در کشت بافت گیاهی و دیگر روش‌های مولکولی بیوتکنولوژی دارد، به گونه‌ای که هم اکنون با استفاده از تجزیه پلی‌مرفیسم تک نوکلئوتیدی (SNP) از ژنوم گیاهی، انتخاب موتانت‌های مربوط به هر صفت ژنتیکی امکان پذیر خواهد بود. توسعه این روش ساده موجب جایگزینی انتخاب آزمایشگاهی موتانت‌ها به جای گزینش مشاهده‌ای آن‌ها در مزرعه خواهد شد. از این طریق مقادیر موتاسیون حاصل از تیمارهای متفاوت موتاژنی به‌طور دقیق‌تری ارزیابی می‌گردد. همچنین با این روش، ژن‌های موتانت هتروزیگوت در گیاهان دگرگشن نیز شناسایی خواهند شد. موتاسیون القاء کروموزمی و تکنیک‌های پیشرفته باندینگ توانستند ارزیابی‌های دقیقی از انتقال ژن از یک موجود به موجود دیگر انجام دهند (نیسو و همکاران، 2004).
امروزه از کشت‌های سلولی، پروتوپلاست‌ها و گرده برای ایجاد موتاسیون استفاده می‌شود. سوسپانسیون‌های تک‌سلولی و پروتوپلاست‌های حاصل از آن‌ها بهترین روش برای غربالگری فنوتیپی متفاوت در کشت می‌باشند (استوسکوف و همکاران، 1997).
1-2-8-4-8 هدف موتاسیون مصنوعی
هدف موتاسیون مصنوعی تغییر یک یا چند ژن نزدیک به هم و شکستن همبستگی (افزایش کراسینگ اور) بین ژن‌های مطلوب و نامطلوب می‌باشد. ژن‌های مطلوب را می‌توان به واریته‌های مورد نظر انتقال داده و بدین ترتیب ارزش واریته را افزایش داد (اهدایی، 1384). از آن جایی که جهش خودبه‌خودی با فراوانی کم، حدودا یک در میلیون در طبیعت اتفاق می‌افتد و از این تعداد فقط درصد بسیار کمی از تغییرات حاصله مورد استفاده اصلاح کنندگان نبات واقع می‌شود، لذا اصلاحگران نمی‌توانند فقط متکی به تغییرات حاصله بر اثر عوامل طبیعی باشند و از این طریق با گزینش ژنوتیپ‌های برتر نیاز غذایی جوامع بشری درحال رشد را برآورده سازند، بنابراین منطقی است به فکر استفاده از عواملی جهت ایجاد جهش باشند. مطالعات عملی و اساس در ایجاد موتاسیون در گیاهان عالی نشان می‌دهد که هیچ کدام از جنبه‌های مورفولوژیکی یا فیزیکی گیاه از عوامل موتاژن ایمن نیستند، زیرا از نظر اصولی امکان القاء موتاسیون در هر ژنی وجود دارد و می‌توان موتاسیون‌هایی که اکنون در طبیعت اتفاق نیفتاده و یا این که رخ داده ولی در جمعیت کنونی از بین رفته است را ایجاد کرد (فارسی و باقری، 1377).
بایستی توجه داشت که اصلاح جهشی به هیچ وجه یک روش مستقل اصلاح نیست زیرا در این روش تمرکز روی استفاده از ژن منفرد است که بایستی مجددا با ژن‌های دیگر ترکیب شوند و واریته‌های تجاری قابل قبولی را به وجود آورد. روش اصلاحی جهشی باید یکی از روش‌های اصلاح نوترکیب درنظر گرفته شود که خود یک روش عمده برای ایجاد واریته‌های جدید است (فرشادفر، 1376).
1-2-9 روغن‌های اسانس
روغن‌های اسانسی ترکیبات معطری هستند که در اندام‌های مختلف گیاهان یافت می‌گردند. به علت قابلیت تبخیر این مواد در مجاور هوا در حرارت عادی، این ترکیبات را روغن‌های اتری یا اسانس نیز می‌نامند. این روغن‌ها از قرن شانزدهم میلادی شناخته شده بودند و به علت این که اغلب آن‌ها دارای عطر وطعم خوبی می‌باشند، به طور گسترده‌ای در صنایع غذایی، عطرسازی و دارویی مورد استفاده قرار گرفته‌اند. وجود روغن‌های اسانسی تنها در 2000 گونه از 250000 گیاه گل‌دار که تاکنون شناخته شده است گزارش گردیده است. مهمترین گیاهان حاوی روغن‌های اسانسی متعلق به خانواده نعناع، کاسنی، کاج، چتریان یا جعفری و مرکبات می‌باشند. روغن‌های اسانسی بسته به نوع تیرهای گیاهی ممکن است در اندام‌های ترشحی مانند کرک‌های غده‌ای سلول‌های پارانشیم تغییر شکل یافته، لوله‌های اسانسی به نام ویتا و یا در کانال‌های لیزوژن وجود داشته باشند. روغن‌های اسانسی ممکن است مستقیما توسط پروتوپلاسم به وسیله تجزیه مواد رزینی غشاء سلول‌ها یا از هیدرولیز بعضی از کلوگزیدها حاصل گردند. سلول‌ها و بافت‌های ترشح کننده روغن‌های اسانسی مذکور ممکن است تنها در یک اندام گیاه مثلا تنها در گل یا میوه و یا اندام‌های مختلف گیاهان پراکنده شده باشد، که در این صورت روغن‌های اسانسی حاصله از نظر کمیت و کیفیت و همچنین اجزاء و مواد تشکیل دهنده، از اندامی به اندام دیگر تفاوت دارند. دلیل اساسی تشکیل و نقش روغن‌های اسانسی در گیاهان هنوز به خوبی مشخص نگردیده است، ولی عقیده براین است که روغن‌های اسانسی به طور کلی بازمانده‌ی فرایندهای اصلی متابولیسم می‌باشد. عوامل مختلفی نظیر زمان برداشت محصول، نحوه جمع‌آوری، طریقه خشک‌کردن، بسته‌بندی و نگهداری در انبار در کیفیت و کمیت روغن‌های اسانسی گیاهان موثرترند (امید بیگی 1390؛ نجفی و همکاران1390؛ صمصام شریعت1371).
برای استخراج اسانس از دو روش استفاده می‌شود:
1- تقطیر با آب: در این روش در واقع آب و اسانس با هم تقطیر می‌شوند و به دنبال آن اسانس به سهولت استخراج می‌گردد. از آنجایی که درصد اسانس بر اساس وزن خشک برگ و بوته‌ها محاسبه می‌شود، بنابراین قبل از انجام اسانس‌گیری وزن خشک نمونه‌های اندازه‌گیری شد.
2- استخراج به کمک حلال‌ها: نمونه‌ها پس از برداشت کاملا پاک و تمیز شده و با آب مورد شستشو قرار می‌گیرند. سپس نمونه‌ها را بر روی کاغذ پهن نموده تا آب خود را از دست داده و با دستگاه گرم‌کن نمونه‌ها را کاملا خشک می‌نمائیم. 5 گرم از نمونه خشک شده را برداشته داخل میکسر ریخته کاملا آن‌را پودر نموده و آن‌را داخل بالن مخصوص



قیمت: 11200 تومان

Author:

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *