شناسایی چند شکلی‌های‌آللی جایگاه‌های ژنی HSP70.1 و HSP90AB1 و ارتباط آن‌ها با صفات تولید شیر در گاو هلشتاین

بسم الله الرحمن الرحیم

دانشکده علوم دامی و شیلات
پایا‌ن‌نامه کارشناسی ارشد رشته‌ی علوم دامی گرایش اصلاح نژاد دام
شناسایی چند شکلی‌های‌آللی جایگاه‌های ژنی HSP70.1 و HSP90AB1 و ارتباط آن‌ها با صفات تولید شیر در گاو هلشتاین
استاد راهنما:
پروفسور قدرت الله رحیمی میانجی
استاد مشاور:
دکتر ایوب فرهادی
دانشجو:
عاطفه یعقوبی کیاسری
اسفند 1393

کلیه حقوق مادی مترتب بر نتایج مطالعات، ابتکارات
و نوآوری‌های ناشی از تحقیق موضوع این پایان‌نامه
متعلق به دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری است.
تقدیر و تشکر:
سپاس از خدای مهربانم
قدر استاد نکو دانستن/ حیف که استاد به من یاد نداد…
سپاس از استاد بزرگوارم جناب پرفسور رحیمی برای تمام لحظات بودنش جهت پیشبرد بهتر مشق ارشدم، خدایا تو خود دانی خود نیز نگهدارشان باش. سپاس از استاد همیشه همراهم جناب دکتر فرهادی که همیشه پاسخگوی سوالات و مشکلات گاه و بی گاهم بود، خدایا همیشه همراهشان باش و هیچگاه بی جوابشان مگذار. سپاس از استادان گرانقدرم جناب دکتر حافظیان، دکتر قلی زاده و دکتر فیروزبخش برای قبول زحمت داوری و مدیریت، خدایا در داوری زندگیشان خوبی ها را برایشان تدبیر کن.
سپاس از آقای مهندس روحی، مهندس گودرزی و دکتر صفدریان جهت همکاری و راهنمایهایشان در آزمایشگاه، خدایا در آزمایش الاهیت سربلندشان دار. سپاس از عوامل محترم گاوداری مهدشت (آقایان رضایی، مولایی و دکتر دیرنده)، هم کلاسی ها و دوستان خوبم )خانم کرمی نژاد، خانم قاضی، خانم محمدی کشکا، آقای پسندیده و بخصوص خانم بابامحمدی و همسرشان جناب نجفی( که همیشه کنارم بودند، بودنتان زیبا در پناه خدا.
سپاس از خانواده خوبم، بخصوص پدر مهربانم و برادران همیشه همراهم که بودنشان مایه دلگرمی و سربلندی من است، خدایا سلامتشان دار.
و و در آخر ممنونم از مادر عزیزم که در نبودش، دعای خیرش همیشه همراهم بود، روحت شاد بهترینم.
تقدیم اثر:
تقدیم به پدر مهربان و بی‌نظیرم که همیشه چون کوه محکم کنارم هست
و
روان پاک مادرم که سال‌ها دعای خیرش همیشه همراهم بود.
چکیده
پروتئین‌های شوک حرارتی (HSP) گروهی از پروتئین‌ها هستند که به علت ارتباط مستقیم با صفات مهم اقتصادی از قبیل مقاومت به تنش گرمایی و ورم پستان در پرورش گاو شیری دارای نقش قابل توجهی هستند. در این پژوهش نمونههای خون پس از تصحیح رکوردها در مدل آماری مربوطه و با توجه به توزیع عوامل باقی مانده از 200 راس گاو هلشتاین جمع‌آوری و استخراج DNA به روش نمکی بهینه یافته انجام شد. قطعاتی با طول 539، 275، 421 و 351 جفت باز به ترتیب از نواحی 5`UTR و 3`UTR ژن‌ Hsp70.1، اگزون 3 تا 4 و اگزون 9 تا 10 ژن Hsp90AB1 با استفاده از PCR تکثیر شدند. تعیین ژنوتیپ نمونه‌ها با روش PCR-SSCP انجام شد. در منطقه 5`UTR سه ژنوتیپ AA، BB و AB مشخص شد که فراوانی ژنوتیپی آن‌ها به ترتیب در گروه 1 (با عوامل باقی‌مانده کمتر از میانه) 42، 28 و 30 درصد و در گروه 2 (با عوامل باقی‌مانده بیشتر از میانه) 46، 29 و 25 درصد همچنین در منطقه اگزون 3 تا 4 دو ژنوتیپ CD و CC مشخص شد که فراوانی ژنوتیپی آن‌ها به ترتیب در گروه 1 برابر با 54 و 46 درصد و در گروه 2 برابر با 62 و 38 درصد محاسبه شد. همه نمونه ها در جایگاه 3`UTR ژن‌ Hsp70.1 و اگزون 9 تا 10 ژن Hsp90AB1 یک شکل بوده و هیچ فرم آللی نمونه‌های مورد بررسی مشاهده نشد. مطالعه ارتباطی نشانگر صفت در پژوهش حاضر ارتباط معنی‌دار آماری را بین ژنوتیپ ها و صفات تولید شیر، درصد چربی و درصد پروتئین شیر نشان نداد.
کلمات کلیدی: گاو هلشتاین، چندشکلی، PCR-SSCP، Hsp70.1، Hsp90AB1، صفات تولیدی.
فهرست مطالب
صفحه عنوان
فصل اول- مقدمه
1 1- مقدمه
فصل دوم- کلیات و بررسی منابع
3 2- کلیات
3 2-1- گاو هلشتاین
4 2-2- صفات تولیدی4 2-2-1- تولید شیر روزانه5 2-2-2- چربی و پروتئین شیر5 2-3- چاپرون6 2-4- کلیات پروتئین شوک حرارتی (HSP)
6 2-5- طبقه‌بندی HSP
7 2-5-1- خانواده پروتئین شوک حرارتی 70 کیلو دالتونی (Hsp70)
7 2-5-2- خانواده پروتئین شوک حرارتی 90 کیلو دالتونی (Hsp90)
9 2-6- فعال شدن Hsp ها در پاسخ به شوک حرارتی
10 2-7- Hsp70 و Hsp90 و سیستم ایمنی
11 2-8- نقش Hsp70 و Hsp90 در فیزیولوژی سلولی
11 2-8-1- نقش در تنظیم شکل فضایی پروتئین‌ها
11 2-8-2- هدف جدید داروی ضد تومور گلدانامایسین (Geldanamyscin)
12 2-8-3- جابجایی گیرنده در سیتوپلاسم
12 2-8-4- انتقال از منافذ هسته
12 2-9- نقش Hsp70 و Hsp90 در تاخوردگی (Folding) پروتئین‌ها
13 2-10- Hsp70 و Hsp90 و تنظیم آپوپتوزیس
15 2-11- Hsp70 و Hsp90 و بیماری‌ها
15 2-11-1- سرطان
15 2-11-2- دیابت
16 2-12- چند شکلی‌های Hsp70 و Hsp90
فصل سوم- مواد و روش‌ها
18 3-1- داده‌ها
19 3-2- نمونه برداری
20 3-3- استخراج DNA
20 3-3-1- بافرها و محلول‌های مورد استفاده در استخراج DNA
21 3-3-2- مراحل استخراج DNA از نمونه‌های خون
22 3-3-3- ذخیره DNA
22 3-3-4- تعیین ویژگی‌های کیفی DNA
22 3-3-4-1- تعیین کمیت وکیفیت DNA به وسیله الکتروفورز ژل آگارز
23 3-3-4-2- تعیین کمیت وکیفیت DNA با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتری
23 3-4- واکنش زنجیره‌ای پلی مراز (PCR)
23 3-4-1- پروتکل و مواد مورد استفاده در PCR
25 3-4-2- چرخه‌های حرارتی PCR
26 3-5- الکتروفورز محصولات PCR روی ژل آگارز
26 3-6- تعیین ژنوتیپ محصولات PCR ژن مورد نظرروی ژل پلی‌اکریل آمید
26 3-6-1- تهیه ژل پلی‌اکریل‌آمید
27 3-6-2- محلول‌های مورد نیاز برای رنگ آمیزی ژل پلی‌اکریل‌آمید
27 3-6-2-1- رنگ آمیزی با نیترات نقره
27 3-6-2-2- مراحل رنگ‌آمیزی نیترات نقره
27 3-6-2-2-1- محلول تثبیت کننده
27 3-6-2-2-2- محلول رنگ‌آمیزی
28 3-6-2-2-3- محلول ظاهر سازی
28 3-6-2-3- مراحل انجام کار
29 3-7- تجزیه و تحلیل داده‌ها
29 3-7-1- برآورد فراوانی‌های ژنوتیپی و آللی
29 3-7-2- تجزیه و تحلیل ارتباط ژنوتیپ با صفات
فصل چهارم- نتایج
30 4-1- کمیت و کیفیت DNA استخراج شده
30 4-2- شناسایی چند شکلی در جایگاه‌های ژنی مورد مطالعه با تکنیک SSCP
30 4-2-1- شناسایی چند شکلی در جایگاه‌های ژن HSP70.1
32 4-2-2- شناسایی چند شکلی در جایگاه‌های ژن HSP90AB1
34 4-3- بررسی آماری
34 4-3-1- فراوانی ژنوتیپی و آللی
35 4-3-2- مقایسه فراوانی‌های آللی
36 4-3-3- بررسی ارتباط بین ژنوتیپ و صفات تولیدی
فصل پنجم- بحث و پیشنهادات
37 5-1- ژن Hsp70.1
38 5-2- ژن Hsp90AB1
39 5-3- نتیجه گیری کلی
40 5-4- پیشنهادات
41 منابع
فهرست جداول
صفحه عنوان
4 جدول 2-1- برخی از خصوصیات تولیدی گاو هلشتاین
7 جدول 2-2- HSP‌های مهم در سلول پستانداران
18 جدول 3-1- اثر گذاری عوامل ثابت روی تولید روزانه
20 جدول 3-2- مواد تشکیل دهنده بافر جدا کننده
20 جدول 3-3- مواد تشکیل دهنده بافر لیز کننده
22 جدول 4-4- مواد محلول TBE(10X)
24 جدول 3-5- توالی آغازگرهای استفاده شده در این پژوهش
25 جدول 3-6- مواد لازم برای انجام واکنش زنجیره‌ای پلی مراز
25 جدول 3-7- درجه حرارت و زمان بهینه شده در مراحل مختلف واکنش PCR
26 جدول 3-8- مواد لازم برای تهیه ژل پلی‌اکریل‌آمید
27 جدول 3-9- مواد لازم برای تهیه محلول تثبیت کننده
27 جدول 3-10- مواد لازم برای تهیه محلول رنگ‌آمیزی
28 جدول 3-11- مواد لازم برای تهیه محلول ظاهرسازی
34 جدول 4-1- فراوانی آللی و ژنوتیپی در جایگاه 5`UTR ژن HSP70.1 در دو گروه
35 جدول 4-2- فراوانی آللی و ژنوتیپی جایگاه اگزون 3 و 4 در ژن HSP90AB1 در دو گروه
35 جدول 4-3- مقایسه فراوانی آللی و ژنوتیپی در دو گروه در جایگاه 5`UTR ژن Hsp70.1
35 جدول 4-4- مقایسه فراوانی های آللی و ژنوتیپی در دوگروه درجایگاه اگزون 3-4 ژن HSP90AB1
36 جدول 4-5- ارتباط بین جایگاه 5`UTR ژن HSP70.1 و صفات تولیدی
36 جدول 4-6- ارتباط بین جایگاه اگزون 3 و 4 ژن HSP90AB1 و صفات تولیدی
فهرست شکل‌ها
صفحه عنوان
1 شکل 1-1- گاوداری صنعتی کشور بر حسب نوع فعالیت
1 شکل 1-2- مقدار تولید شیر طی سال‌های 1368 الی 1391
9 شکل 2-1- ساختمان Hsp70 و Hsp90
13 شکل 2-2- آپپتوزیس
14 شکل 2-3- فرآیند آپپتوزیس با حضور Hsp70
19 شکل 3-1- توزیع عوامل باقی‌مانده صفت تولید روزانه در جمعیت پایه.
30 شکل 4-1- نمونه‌ای از DNA استخراج شده
30 شکل 4-2- محصولات PCR مربوط به جایگاه 5`UTR ژن HSP70.1
31 شکل 4-3- محصولات PCR مربوط به جایگاه 3`UTR ژن HSP70.1
31 شکل 4-4- نمونه‌ای از الکتروفورز محصولات PCR جایگاه 5`UTR ژن HSP70.1 توسط ژل پلی‌اکریل‌آمید 10%.
32 شکل 4-5- نمونه‌ای از الکتروفورز محصولات PCR جایگاه 3`UTR ژنHSP70.1 توسط ژل پلی‌اکریل‌آمید 10%
32 شکل 4-6- محصولات PCR مربوط به اگزون 3-4 ژن HSP90AB1
33 شکل 4-7- محصولاتPCR مربوط به اگزون 9-10 ژن HSP90AB1
33 شکل 4-8- نمونه‌ای از الکتروفورز محصولات PCR بین اگزون 3-4 از ژن HSP90AB1 توسط ژل پلی‌اکریل‌آمید 10%
34 شکل 4-9- نمونه‌ای از الکتروفورز محصولات PCR بین اگزون 9-10 از ژن HSP90AB1 توسط ژل پلی‌اکریل‌آمید 10%
فصل اول
مقدمه
1-1- مقدمه
جمعیت جهان در حال حاضر نزدیک به 5/6 میلیارد نفر و با رشد 3/1 درصدی در حال افزایش است و برآورد شده که تا 50 سال آینده به دو برابر می‌رسد. این روند منجر به گسترش شهرها، روستاها و کاهش زمین‌های کشاورزی و مراتع شده و نیاز به منابع غذایی افزایش می‌یابد. سهم عمده تولید شیر جهان متعلق به گاو می‌باشد ولی گوسفند، گاومیش و بز نیز مقادیری از کل تولید شیر را به خود اختصاص می‌دهند. حدود 17 درصد کل گاوهای موجود در جهان از نژادهای اصلاح شده می‌باشد. تعداد کل گاوهای موجود در کشور بالغ بر 7 میلیون رأس می‌باشدکه 7 درصد آن از گاوهای اصلاح شده نژاد هلشتاین تشکیل می‌دهد (مددخواه، 1389). درآمد صنعت پرورش گاو شیری به طور عمده از صفات تولیدی است. به همین دلیل این صفات در اهداف اصلاح نژاد مورد توجه قرار گرفته‌اند. در سال های گذشته مقدار تولید شیر در 305 روز معیار اصلی انتخاب در گاو شیری بوده است. با این وجود، از عوامل اصلی سودآوری گاو تولید شیر آن می‌باشد (نافذ و همکاران، 1391).
براساس نتایج حاصل از طرح آمارگیری گاوداری‌های صنعتی کشور در سال 1392، تعداد کل گاوداری‌های صنعتی کشور 25353 واحد با ظرفیت 3264593 رأس است. از این تعداد، 16295 گاوداری صنعتی با ظرفیت کل 2163750 رأس مربوط به فعالیت پرورش گاوشیری می‌باشد (شکل 1-1). همچنین طبق آمار 878690 رأس گاو هلشتاین اصیل و 263872 رأس آمیخته هلشتاین وجود دارد (شکل 1-1 و 2-1) (مرکز آمار ایران، 1392).

شکل 1-1- گاوداری صنعتی کشور بر حسب نوع فعالیت

شکل 1-2- مقدار تولید شیر طی سال‌های 1368 الی 1391
تنش حرارتی، از جمله تنش‌های محیطی تاثیر گذار بر عملکرد تولیدی دام و طیور می‌باشد. در این میان، گاوهای شیری از دام‌های حساس نسبت به این تنش بوده و در حال حاضر تنش حرارتی یکی از دغدغه‌های اصلی در امر پرورش گاو شیری در بسیاری از مناطق گرمسیری و نیمه‌گرمسیری می‌باشد (طاهری دزفولی، 1390).
به طور کلی، دمای محیط یکی از عوامل اصلی موثر بر عملکرد تولیدی در گاو شیری می‌باشد که منجر به انجام یکسری واکنش‌ها در سطح سلول و در کل بدن دام می‌شود. این واکنش‌ها به منظور جلوگیری از اختلالات فیزیولوژیک و سازش بیشتر دام با محیط اطرافش صورت می‌گیرد. دام از طریق تنظیم دما به منظور ثابت نگه‌داشتن دمای بدن خود در دامنه محدود، واکنش‌های بیوشیمیایی و فرآیندهای فیزیولوژیک مرتبط با متابولیسم طبیعی بدن را کنترل می‌نماید. دمای مناسب و قابل تحمل گاوهای شیری (دامنه حرارتی آسایش) بین 5 تا 25 درجه سانتی‌گراد گزارش شده است که در این شرایط، دمای بدن گاو بین 1/39-4/38 درجه سانتی‌گراد می‌باشد. در دمای بیش از 26 درجه سانتی‌گراد، گاو به مرحله‌ای می‌رسد که به میزان لازم نمی‌تواند گرما را از بدن دفع کند و در نتیجه در شرایط تنش حرارتی قرار می‌گیرد (کادزر و همکاران، 2002).
طبق تحقیقات انجام شده میزان تولید شیر گاو هلشتاین در شرایط گرمسیری و نیمه گرمسیر 40% تا 60% کمتر از شرایط معتدل می‌باشد که این امر نشان از تأثیر عمیق حرارت بر گاو هلشتاین می‌باشد(وست و همکاران، 2003). لذا امروزه پرورش‌دهندگان گاو شیری، سعی می‌کنند با تغییرات لازم در شرایط محیط پرورش و استفاده از انواع خنک کننده‌ها و یا تغییر در جیره غذایی، با اثر منفی تنش حرارتی مقابله نمایند. برای مثال شواهدی وجود دارد که نشان می‌دهد تغذیه با عصاره قارچ آسپرژیلوس اوریزا (Aspergillusoryzae) می‌تواند دمای بدن را در گاوهای تحت تنش حرارتی کاهش دهد. این مکانیسم تاکنون شناخته نشده است اما ممکن است این کاهش حرارت، ناشی از اثرات کنترلی این قارچ بر مراکز تنظیم دمای هیپوتالاموس باشد (هوبر و همکاران 1994؛ یو و همکاران، 1997).
روش‌های مدیریتی، علی رغم این‌که در بیشتر موارد نتیجه مثبت دارند، ولی اغلب منجر به افزایش هزینه پرورش می‌شوند که در بسیاری از موارد توجیه اقتصادی ندارند. بنابراین اگر گاوهای مقاوم به گرما و یا ژن‌های مقاومت به گرما شناخته شوند، می‌توان مقاومت به گرما را در گاوهای شیری از نظر ژنتیکی بهبود بخشید (کالیر و همکاران، 2003؛ فینج و همکاران، 1886).
به همین منظور، بهبود سیستم تولید باید به دنبال راهکارهایی از قبیل اصلاح نژاد، تغذیه و یا مدیریت صحیح پرورش باشیم. در این بین اصلاح نژاد که از تغییر ظرفیت ژنتیکی برای صفات اقتصادی مورد نظر انجام می‌گیرد، از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است. هدف ازپژوهش حاضر شناسایی چند شکلی‌های موجود در ژن‌های HSP70.1 و HSP90AB1 و بررسی ارتباط آن‌ها با صفات تولیدی در گاو هلشتاین بوده است.
فصل دوم
کلیات و بررسی منابع
2- کلیات
در زمینه اصلاح نژاد دام آن مطلبی که همیشه اهمیت داشته و مورد بررسی قرار گرفته است، مسأله انتخاب حیوانات بوده است. صفات مختلف یک حیوان را می‌توان از نظر تعداد ژن‌های کنترل کننده و میزان تأثیر عوامل محیطی به دو دسته صفات کیفی و صفات کمی تقسیم کرد. صفات کیفی توسط یک یا تعداد کمی ژن کنترل و بیان می‌شود و عوامل محیطی در بروز این صفات تأثیر چندانی ندارد. ولی صفات کمی اغلب توسط تعداد زیادی ژن کنترل می‌شوند و در بروز آن‌ها عوامل محیطی مؤثر هستند. اغلب صفات کیفی وراثت پذیری بالایی دارند، در نتیجه انتخاب و اصلاح این صفات نسبتاٌ آسان است و غالباٌ نیازی به انتخاب غیر مستقیم وجود ندارند. ولی صفات کمی که عوامل محیطی بر آن‌ها مؤثر است، فنوتیپ موجود ممکن است گویای ژنوتیپ صفات نباشند، برای رفع این مشکل تکنیک‌های پیشرفته اصلاح نژاد با استفاده از علم آمار تدوین شده است. این روش‌ها در چندین سال اخیر بسیار مفید بوده و پیشرفت‌های قابل توجهی را موجب شده‌اند. امروزه تکنولوژی ژنتیک مولکولی انقلابی در تجزیه ژنتیکی گونه‌های اهلی ایجاد کرده است. به طوری که بر اساس آن می‌توان چند شکلی را در سطح DNA شناسایی و از آن به عنوان نشانگرهای مولکولی استفاده کرد و به مطالعه افراد در موجودات مختلف پرداخت (فصیحی هرندی و همکاران، 1377؛ نجاتی جوارمی، 1378).
اخیرأ مطالعات در زمینه مکانیسم ژنتیکی و مولکولی مقاومت تنش حرارتی، با استفاده از روش‌های نوین ژنتیکی مورد توجه قرار گرفته است. روش‌های جدید به پژوهشگران این امکان را می‌دهد که شرایط ویژه تولیدی، فیزیولوژیک و سلامتی دام را در سطح ژن بررسی و مشخص نمایند (اسپور و همکاران 2007).
2-1- گاو هلشتاینطبق نظریه کان فان یک نژاد از یک حیوان به گروه بزرگی از حیوانات داخل یک گونه اطلاق می‌شود که دارای منشأ مشترکی هستند و می‌توان صفات خاص نژادی را در آن‌ها با یک دامنه تغییرات محدود مشاهده نمود و قادرند این ویژگی‌ها را با تغییرات محدودی به فرزندانشان انتقال دهند. معمولاٌ این ویژگی‌های نژادی مربوط به صفات تولیدی و مورفولوژیکی آن‌ها می‌باشد. البته این کار بسیار مشکلی است که تعاریف کاملا مشخص و دقیقی از صفات کمی برای معرفی یک نژاد داشته باشیم، چون این ویژگی‌ها به صورت ثابت نیستند. بنابراین می‌توان صفات کمی یک نژاد را با میانگین مشخص نمود، اگر چه دامنه تغییرات افراد از میانگین زیاد است.در گاوداری‌های صنعتی کشور اغلب اقدام به پرورش و نگه‌داری گاوهای شیری نژاد هلشتاین می‌نمایند. عملکرد صفات تولید شیر در این نژاد در جدول 1-2 ارائه شده است (دادار، 1375؛ قربانی و خسروری،1390).
جدول 2-1- برخی از خصوصیات تولیدی گاو هلشتاین
مشخصات مقادیر
تولید شیر روزانه (کیلوگرم) 25-30
تولید شیر در یک دوره شیردهی (کیلوگرم) 5700-4800
درصد چربی 5/3-65/3
درصد پروتئین 17/3-22/3
2-2- صفات تولیدی
پرورش گاو شیری یکی از بخش‌های مهم صنعت دامپروری است و برای پرورش‌دهندگان گاو شیری، تولید شیر منابع اصلی درآمد بوده و از مهم‌ترین صفات در شاخص انتخاب محسوب می‌شوند. از آن‌جا که هدف اصلی از برنامه‌های اصلاح نژاد در گاوهای شیری، افزایش تولید، بهره‌وری سیستم‌های تولیدی، انتخاب و دست‌یابی به پیشرفت ژنتیکی است، محققین اصلاح نژاد دام اطلاعاتی را مورد توجه قرار می‌دهند که بتوانند ارزش ژنتیکی دام را به خوبی نشان دهند. در طی دهه‌های اخیر با پیشرفت علم ژنتیک موفقیت‌های زیادی در زمینه اصلاح نژاد دام‌ها و در نتیجه افزایش تولیدات دامی به دست آمده است. صفات تولیدی در گاوهای شیری (مقدار شیر، درصد چربی و پروتئین) جزء صفات کمی بوده که تعداد زیادی ژن مسئول کنترل آن‌ها می‌باشند و با توجه به وراثت‌پذیری متوسط، امکان رکورد برداری دقیق وآسان و ارزش اقتصادی بالا، مورد توجه متخصصان اصلاح نژاد قرار گرفته است (قاضی خانی شاد و همکاران، 1390).
لازم است بدانیم تغییراتی که در طی سالیان متمادی در عملکرد تولیدی رخ داده است یا رخ نداده است می‌توان در صورت وجود واریانس این مسئله را علت‌یابی کرد. این تغییرات می‌تواند ناشی از عوامل ژنتیکی و محیطی اعم از تأثیر اقلیم، مدیریت، اندازه گله و سایر عوامل که برخی نامشخص و عده‌ای شناخته شده‌اند، باشد (آصفی، 1392).
2-2-1- تولید شیر روزانه
از میان صفات حائز اهمیت در عملکرد اقتصادی گاوهای شیری، صفات تولیدی (نظیر تولید شیر) در انتخاب گاوهای شیری جهت افزایش ارزش اصلاحی و سود اقتصادی دارای اهمیت ویژه‌ای می‌باشند که علاوه بر عوامل ژنتیکی، تحت تأثیر عوامل محیطی نیز می‌باشد. علی رغم وجود جمعیت قابل توجه گاو شیری در کشورهای در حال توسعه، میزان تولید شیر به ازای هر رأس گاو پایین بوده که می‌توان آن را با عواملی نظیر دوره‌های شیردهی، فصل زایش و سال زایش مرتبط دانست. تفاوت مقدار تولید در گله‌های مختلف و یا در بین گاوهای یک گله تحت تأثیر عواملی است که مانع از شناخت دقیق ارزش اصلاحی حیوانات می‌گردد. لذا باید این عوامل و میزان تأثیر آن‌ها را قبل از برآورد ارزش اصلاحی حیوانات تعیین و سپس رکوردها را برای آن‌ها تصحیح نمود (روشن و همکاران، 1391).
در مطالعات انجام شده در گاو هلشتاین ایران توارث‌پذیری صفت تولید شیر در محدوده‌ی 20/0-32/0 تخمین زده شده است. دامنه روند ژنتیکی و فنوتیپی تولید شیر 305 روز در مطالعات مختلف به ترتیب 99/10- تا 78/249 و 23/44 تا 85/271 کیلوگرم در سال می‌باشد (نافذ و همکاران، 1391).
توارث‌پذیری تولید شیر در یک دوره‌ی شیردهی بسیار متفاوت گزارش شده است و از حداقل 12/0 تا حداکثر 47/0 گزارش شده است. از طرفی همبستگی صفت تولید شیر روزانه با تولید در یک دوره‌ی شیردهی با توجه به گزارش کامرون (1997) بسیار بالا گزارش شده است که در این صورت به منظور انتخاب افراد برتر می‌توان از رکوردهای شیر روزانه استفاده کرد (استرادلئون و همکاران، 2008؛ حسین‌پور مشهدی و همکاران، 2008).
2-2-2- چربی و پروتئین شیر
در مطالعات انجام شده روی گاو هلشتاین ایران توارث‌پذیری صفت چربی شیر در محدوده 34/0-23/0 تخمین زده شده است و روند ژنتیکی چربی شیر در محدوده 46/3-06/0 کیلوگرم در سال گرازش شده است (نافذ وهمکاران، 1391).
رضوی و همکاران (1386) در مطالعات خود روی گاو هلشتاین استان مرکزی وراثت‌پذیری چربی و درصد چربی شیر را به ترتیب 03/0±23/0 و 02/0±32/0 برآورد کردند. همچنین تکرار پذیری چربی و درصد چربی شیر را به ترتیب 39/0 و 4/0 اعلام کردند. روند فنوتیپی مقدار و درصد چربی را به ترتیب 23/0 کیلوگرم و 5/0 درصد، و روند ژنتیکی آن را 06/0 کیلوگرم و 02/0- درصد و روند محیطی آن‌ها را به ترتیب 21/0 کیلوگرم و 07/0 تخمین زده‌اند.
در تحقیقات انجام شده در جمعیت گاوهای هلشتاین مناطق مختلف توسط محققین در داخل و خارج کشور وراثت‌پذیری مقدار چربی و درصد چربی به ترتیب در محدوده 23/0 تا 37/0 و 14/0 تا 32/0 گزارش شده است. همچنین مقادیر روند ژنتیکی برای مقدار چربی 46/3 کیلوگرم گزارش شده است (رضوی وهمکاران 1386).
2-3- چاپرون
پروتئین‌هایی که تا شدن پروتئین‌های دیگر را تسهیل می‌کنند چاپرون (Chaperone) نامیده می‌شوند. این واژه اولین بار توسط ران لاسکی و همکاران مطرح شد. آن‌ها این واژه را برای یک نوع پروتیئن (نوکلیوپلاسمین) که برای تجمع هیستون‌ها و DNA لازم بود به کار بردند. نوکلیوپلاسمین به هیستون‌ها متصل می‌شوند و به تجمع آن‌ها برای تشکیل نوکلئوزوم بدون این‌که خود وارد ساختار بشوند، کمک می‌کنند. بنابراین چاپرون‌ها کاتالیست‌هایی هستند که بدون این‌که خود وارد ساختار شوند باعث تسهیل در شکل گیری پروتئین‌ها می‌شوند. آن‌ها به قسمتی از پروتیئن تاخورده متصل شده و باعث ثبات آن ناحیه می‌شوند که این ثبات باعث هدایت پلی‌پپتید به تا خوردن صحیح سه بعدی می‌شود. فقدان چاپرون سبب تا نخوردن صحیح و یا عدم ثبات پلی‌پپتید خواهد بود که این عدم تاخوردگی و بی‌ثباتی سبب ایجاد کمپلکس‌های نامحلول می‌شود. همچنین ثبات پلی‌پپتیدهای تانخورده هنگام عملکرد اندامک‌های درون سلولی نقش مهمی دارند.، که نمونه‌ی بارز آن را در انتقال پروتئین‌ها از سیتوزول به داخل میتوکندری می‌توان دید. بسیاری از چاپرون‌ها به عنوان یک پروتئین شوک حرارتی (Heat shock protein) شناخته شده‌اند (پنرتو، 2002؛ ها و همکاران، 2009؛ گوپتا وهمکاران، 2010).
2-4- کلیات پروتئین شوک حرارتی (HSP)
برای نخستین بار در سال 1962 دانشمندی به نام ریتوسا واکنش سلول نسبت به شوک حرارتی در کرموزوم‌های بزاقی مگس سرکه (Drosophila melanogaster) گزارش شد. کرموزوم‌ها بعد از قرار گرفتن در معرض حرارت، حالت متورمی را نشان دادند (ررول و همکاران، 2011). 12 سال بعد محصولات ژنی مسئول این فرآیند شناسایی شده و پروتیئن شوک حرارتی (HSP: Heat Shock Protein) نام گرفت (تایسایر و همکاران، 1974).
پروتئین‌های شوک حرارتی به عنوان پروتئین‌های بسیار حفاظت شده هستند که تحت شرایط شوک گرمایی القا می‌گردند. بعداٌ مشخص شد که این پروتئین‌ها توسط استرس‌های دیگر مثل پرتو فرابنفش، استرس اکسیداتیو، مواد شیمیایی، ایکسمی، تغییرات میزان گلوکز، ایجاد آنالوگ گلوکز و اسیدهای آمینه، حضور یون‌های مختلف، اتانول، فلزات مختلف، داروها، هورمون‌ها، عفونت باکتریایی و ویروسی نیز فعال می‌گردند. این پروتئین‌ها از جد پروکاریوتی مشتق شده‌اند (مایر و بوکان، 2005: ویتلی و همکاران، 1999).
2-5- طبقه‌بندی HSP
پروتئین‌های شوک حرارتی یا Hsp های پستانداران بر مبنای اندازه و وزن مولکولی‌شان به دو گروه تقسیم شده‌اند: Hsp های با وزن مولکولی بالا و Hsp های کوچک یا sHsp. اولین گروه شامل سه خانواده مهم است Hsp90، Hsp70 و Hsp60. بعضی از آن‌ها به طور خودبه‌خودی بیان می‌شوند در حالی که القای بقیه تحت شرایط استرس ایجاد می‌گردد. Hsp های با وزن مولکولی بالا چاپرون‌های وابسته به ATP (آدنوزین تری فسفات) می‌باشند و به کوچاپرون‌ها برای تنظیم شکل فضایی و اتصال به ATP نیاز دارند.Hsp های کوچک شامل Hsp20، Hsp27 و α،β کریستالین است.sHspها چاپرون‌های مستقل از ATP هستند. عملکرد و جایگاه سلولی Hspها بر اساس وزن مولکولی در جدول 2-2 ذکر شده است. (کریستین و همکاران، 2004؛ ماسلی، 1997).
جدول 2-2- HSP‌های مهم در سلول پستانداران
وزن مولکولی (KD) عملکرد جایگیری سلولی
28-27 پایداری میکروفیلامنت‌ها و انتقال پیام سیتوکنین سیتوزول و هسته
60 اجتماع پروتئین میتوکندری
73-70 جابجایی و پیچش پروتئین سیتوزول، هسته و شبکه اندوپلاسمی، میتوکندری
90 جابجایی پروتئین، تنظیم گیرنده سیتوزول، هسته، شبکه اندوپلاسمی
104-100 پیچش پروتئین سیتوزول
2-5-1- خانواده پروتئین شوک حرارتی 70 کیلو دالتونی (Hsp70)
خانواده Hsp70 حاوی ایزوفرم‌های 66 تا 78 کیلو دالتونی است که به صورت Hsp70 نشان داده می‌شود و ژن کد کننده آن Hsp70 است (موریموتو، 1993) و غالباٌ کد کننده اسیدآمینه متیونین در آغاز زنجیره و اسیدآمینه آسپارتیک در انتهای زنجیره می‌باشد (مسعودی و همکاران، 1390). نیمه عمر Hsp70القا شده با افزایش دما در سلول‌ها یپستان‌داران تحت شرایط آزمایشگاهی حدود 48 ساعت است (مایزن و ولچ، 1988).
در زمان فقدان استرس پروتئین‌های Hsp70 حدود 1% کل پروتئین‌های سلولی و در زمان بروز استرس حدود 20% کل پروتئین‌ها را شامل می‌شود (ولش 1992). ژن‌های این خانواده در سراسر ژنوم پراکنده شده و روی کرموزوم‌های متعددی قرار گرفته‌اند و این خانواده‌های ژنی از توالی‌های تک اگزونی و یا به عبارتی فاقد اینترون تا توالی‌هایی دارای 18 اگزون تشکیل شده‌اند. توالی‌های تک اگزونی معمولا در بیشتر گونه‌های حیوانی دیده می‌شود (مسعودی و همکاران، 1390). Hsp70.1 در گاو روی کروموزوم شماره 23 قرار دارد و دارای 1 اگزون است (گالگر و همکاران، 1993).
2-5-2- خانواده پروتئین شوک حرارتی 90 کیلو دالتونی(Hsp90)
Hsp90 در سیتوزول، هسته و شبکه رتیکولوم آندوپلاسمی یافت می‌شود. در انسان و بسیاری از پستان‌داران این پروتئین در بسیاری از عضلات از جمله عضلات صاف نیز وجود دارد. این پروتئین بیش از 2% از کل پروتئین‌های سلول را شامل می‌شود. این پروتئین به صورت دایمر عمل می‌کند، یعنی قسمتی از هتروکمپلکس را فراهم یا گردآوری می‌کند. Hsp90 در انتها دارای مکان اتصال بوده و فعالیت Atpase پایینی دارد. این پروتئین می‌تواند به فیلامنت‌های فعال در شرایط مختلف متصل شود. فعالیت Hsp90 بسیار وابسته به غلظت کاتیون‌های دو ظرفیتی است. این خانواده شامل Hsp هایی با اوزان مختلف 82، 83 و 89 کیلو دالتون می‌باشد. این پروتئین در موجودات مختلف دارای همولوژی بالایی است. مثلاٌ در پستانداران حدود 60% با مخمرها و 78% با پروتئین Hsp90 درزوفیلا همولوژی دارد. هرچند مقدار Hsp90 در هنگام شوک حرارتی افزایش می‌یابد ولی Hsp90 یک چاپرون مهم در عملکرد پروتئین‌های سیگنالی می‌باشد و همچنین در کنفورماسیون صحیح گیرنده‌های هورمونی نظیر هورمون‌های استروئیدی نقش مهمی دارد. این پروتئین به گیرنده‌یهورمون استروئیدی متصل شده و از میان کنش آن با DNA هسته‌ای تا زمان اتصال هورمون جلوگیری می‌کند. پروتئین تنظیم کننده گلوکز (Grp94) همولوگ Hsp90 می‌باشد که در یوکاریوت‌ها وجود دارد. این پروتئین‌ها با سایر چاپرون‌ها در تاخوردگی و عملکرد صحیح پروتئین‌ها همکاری می‌کند. مثلا با چاپرون Hsp70، Hsp23 و Hsp50 ارتباط مستقیم دارد. این مجموعه چاپرون‌ها کمپلکس مولتی چاپرون (Multi-Chaperone complex) نام دارد. غیر فعال شدن Hsp90 در این کمپلکس منجر به تجزیه شدن سریع سایر چاپرون‌ها می‌شود. در ضمن غیر فعال شدن Hsp90 در عملکرد بسیاری از پروتئین کینازهای وابسته به آن نظیر Raf-1، ErbB-2 و Bcr-Ab1 وقفه و اختلال ایجاد می‌کند. داروهایی نظیر گلدانامایسین (Geldanamycin)، هربی مایسین (Herbimycin A) و بسیاری از آنتی بیوتیک‌های ضد قارچی با Hsp90 باند شده و عملکرد آن را مختل می‌کنند.
Hsp90 از نظر ساختمانی دارای سه پایانه است. 1- انتهای متصل شونده به نوکلئوتید که ناحیه N ترمینال را تشکیل می‌دهد. این ناحیه به بازدارنده‌های Hsp90 متصل می‌شود، همچنین ممکن است به پپتیدها نیز متصل گردد. 2- یک بخش میانی که با پروتئین Client واکنش می‌کنند. 3- ناحیه C ترمینال که در همودیمریزاسیون شرکت می‌کنند. بررسی توالی ژنوم Hsp90 نشان می‌دهد که دو ناحیه حفاظت شده در اعضای خانواده Hsp90 وجود دارد (شکل 2-1). ساختمان پایانه N ترمینال می‌تواند در حضور ATP یا ADP کریستالیزه شود. ولی همه نوکلئوتید دچار تغییرات ساختمانی مشخصی نمی‌گردند. نوکلئوتید در کمپلکس Hsp90/ADP دارای یک ساختمان بسیار فشرده است. انتهای N ترمینال Hsp90 دارای اسید آمینه حفاظت شده می‌باشد و عملکرد شبیه به فعالیت ATPase دارند. سوبسترایی که به ناحیه N ترمینال این چاپرون متصل می‌شوند از نظر شکل فضایی نباید تا خورده باشند و پروتئین‌ها یا پلی‌پپتیدهایی با 30-13 اسیدآمینه می‌باشند. مولکول‌هایی که قسمتی از آن تانخورده توسط این چاپرون حفاظت نمی‌گردد. مطالعات در مورد Hsp90 نشان می‌دهد که این چاپرون در تاخوردگی پروتئین تحت شرایط فیزیولوژیکی و در شرایط شوک گرمایی شرکت می‌کند. در این شرایط Hsp90 به ATP نیاز ندارد. این نتایج بیان می‌دارد که Hsp90 دارای 2 مکان چاپرونی مستقل است. مکان N ترمینال چاپرون به ATP متصل می‌شود در حالی که مکان C ترمینال چاپرون مستقل از ATP می‌باشد. برخلاف ناحیه N ترمینال این چاپرون، پروتئین‌هایی که کاملا تانخورده و یا قسمتی از آن تاخورده و پپتیدها با طول متغییر می‌توانند به ناحیه C ترمینال Hsp90 متصل گردند. تاخوردگی پروتئین بدون نیاز به ATP از ناحیه C ترمینال این پروتئین انجام می‌گیرد. در حد واسط دو ناحیه بسیار حفاظت شده ساختمان ابتدایی Hsp90 مکانی با شارژ بالا وجود دارد که بین اعضا خانواده‌یHsp90 همولوژی کمی دارد و طول آن متفاوت است. در ناحیه C ترمینال پنتاپپتید MEEVD وجود دارد که در بین اکثر خانواده Hsp90 حفاظت شده است (شکل 2-1) (ارلجمن و همکاران، 2014؛ طاهریان وهمکاران 2008).

شکل 2-1- ساختمان Hsp70 و Hsp90
2-6- فعال شدن Hspها در پاسخ به شوک حرارتی
سازش سلولی به شوک گرمایی مکانیسم بسیار پیچیده‌ای است. چگونگی پاسخ سلول به شوک حرارتی که سلول را وادار به تحریک بقا سلول می‌کند یا درگیر آپوپتوزیس می‌گردد به توالی ژن و مقاومت نسبت به گرما بستگی دارد. به طور کلی شوک حرارتی القا توسط سنتز رونویسی DNA، پردازش mRNA، فرآیند ترجمه و پیشرفت سیکل سلولی را متوقف می‌نماید. افزایش دناتوراسیون پروتئین و تجمع نادرست آن باعث افزایش تجزیه پروتئوزمی و لیزوزومی می‌شود. شوک حرارتی باعث تخریب ترکیبات سیتو اسکلتون و تغییرات در نفوذپذیری غشا می‌گردد. در سازش سلول به شوک گرمایی، سلول‌ها بیان ژن‌ها را تغییر داده که باعث تحمل سلول به گرما می‌گردد. ژن‌های بی‌شماری به وسیله شوک حرارتی افزایش بیان یا کاهش بیان می‌یابند. این تغییرات در بیان ژن در مدت کوتاهی پس از شوک حرارتی القا می‌گردد. گروه عمده پروتیئن‌هایی که با این مکانیسم بیان می‌شوند، پروتئین‌های شوک حرارتی (Hsp) هستند که به عنوان چاپرون عمل می‌کنند. القاء بیان Hsp توسط گرما به وسیله توالی پروموتر ویژه، عناصر شوک گرمایی (HSE) انجام می‌گیرد. چندین کپی سکانس پنتاپپتید 5`NGAAN-3` درون پروموتور ژن‌های Hsp وجود دارد. پاسخ گرمایی این پروموترها با فعالیت فاکتورهای شوک گرمایی (HSF) تنظیم می‌گردد. 3 نوع HSF در سلول‌های پستانداران وجود دارد شامل: HSF-1، HSF-2 و HSF-3. که در بین آن‌ها HSF-1 یک ترکیب کلیدی مهم است و در تنظیم بیان ژن توسط گرما نقش مهمی دارد در حالی که فعالیت HSF-2 و HSF-3 مستقیماٌ مربوط به تنظیم پاسخ گرمایی بیان ژن نمی‌باشد. در سلول‌هایی که تحت تأثیر درجه حرارت بالا نبوده‌اند، HSF-1 به صورت مونومر در سیتوپلاسم سلول مستقر می‌باشد و به Hsp ها (مثل Hsp70 و Hsp90) متصل می‌شوند. در حین فعال شدن توسط گرما HSF-1 از Hsp ها رها شده و وارد هسته می‌شود. در این حالت HSF-1 به صورت مونومر غیرفسفریله می‌باشد. پس از ورود به هسته مونومرهای HSF-1 تریمره شده و در اسیدآمینه سرین فسفریله می‌گردد. فسفریلاسیون HSF-1 یک مرحله مهم و ضروری است که در اتصال به DNA نقش دارد و برای القاء رونویسی از ژن‌ها لازم است. فسفریلاسیون HSF-1 توسط چندین پروتئین کیناز انجام می‌شود. این کینازها یا فعالیت رونویسی HSF-1 را فعال می‌کنند و یا می‌توانند این فاکتورها را متوقف کنند. پاسخ به شوک حرارتی مشابه سایر مسیرهای Signaling است. فسفریلاسیون اسیدآمینه سرین ser203، ser307، ser419 باعث تنظیم منفی HSF-1 است. HSF-1 به 5 مکان اتصال برای فعال شدن رونویسی نیاز دارد. به علاوه چندین HSE درون پروموتور قابلیت القا گرما برای رونویسی ژن را بالا می‌برد. HSF-1 باعث فعال شدن سریع رونویسی ژن می‌گردد. که چند ساعت پس از افزایش دما طول می‌کشد. افزایش بیان Hsp باعث ارتباط مجدد با HSF-1 شده و موجب پایان پاسخ شوک گرمایی در سلول‌ها در یک فیدبک منفی می‌شود. مکانیسم سلولی HSF-1 با واسطه پاسخ شوک حرارتی HSF-1 به صورت مونومر درون سیتوپلاسم سلواهایی که حرارت ندیده است وجود دارد. در سیتوپلاسم HSF-1 هیپوفسفریله هستند و به چاپرون‌هایی مثل Hsp90، Hsp70 متصل می‌باشند. این چاپرون‌ها از اتصال HSF-1 به DNA جلوگیری می‌کنند. مرحله مهم پاسخ حرارتی به صورت زیر است:
1- شوک گرمایی باعث جدایی Hsp از HSF-1 می‌شوند.
2- HSF-1 به هسته منتقل می‌شوند، در هسته HSF-1 تریمریزه شده و به صورت هموتریمر و در مکان سرین به وسیله HSF کینازهای ویژه فسفریله می‌گردند و به توالیHSE در پروموتر ژن‌های پاسخ گرمایی مثل Hsp70 متصل می‌گردند.
3- فعال شدن رونویسی به وسیله HSF-1 بیان Hsp را افزایش می‌دهد و باعث ورود مجدد Hsp70 به هسته می‌شود.
4- Hsp70 هسته‌ای دوباره در ارتباط با HSF-1 تریمر قرار می‌گیرد. HSF-1 تریمر به شکل مونومر غیر فعال جدا می‌شود. هموتریمر HSF-1 به توالی ویژه HSE متصل می‌شود. برای اتصال بهینهHSF-1، 5 مکان اتصال وجود دارد. مکان اتصال برای HSF-1 با واسطه پاسخ حرارتی ضروری است. برای فعال شدن پاسخ گرمایی، چندین سکانس HSE در پروموتر ژن‌های قابل القاء حرارتی وجود دارد. این شرایط می‌تواند در پروموتر Hsp70 مشاهده شود (پرس و لیندکایست، 1993؛ موریموت و همکاران، 1997؛ ویتلی و همکاران، 1999).
2-7- Hsp70 و Hsp90 و سیستم ایمنی
پروتئین‌های شوک حرارتی در سیستم ایمنی نقش مهمی دارند چرا که مولکول‌هایی که در تشخیص آنتی‌ژن دخالت می‌کنند مانند ایمینوگلوبین‌ها، گیرنده‌های سلول T همه به وسیله‌ی چاپرون‌ها پیش برده می‌شود. پاتوژن‌ها برای حفاظت خود در مقابل میزبان از مکانیسم‌های مختلف استفاده می‌کند، از جمله افزایش سنتز پروتئین‌های شوک حرارتی است که برای زنده ماندن پاتوژن‌ها در بدن میزبان به وسیله تجربیاتی از جمله، موتاسیون در پاتوژن روشن شده است. پروتئین‌های شوک حرارتی در پردازش و عرضه‌ی آنتی‌ژن نقش مهمی دارند. تشکیل کمپلکس پایداری که قادر به عرضه پپتیدهای آنتی‌ژن به سلول T هستند بستگی به تاخوردگی صحیح و تجمع آن‌ها در رتیکولوم آندوپلاسمیک دارد. پروتئین‌های شوک حرارتی ظاهراٌ به عنوان آنتی‌ژن‌هایی مهم در دفاع در مقابل عوامل عفونی به کار می‌روند و به دلیل حفظت بالایشان در میان پاتوژن‌های میکروبی، پروتئین‌های شوک حرارتی آنتی‌ژن‌های مهم هستند. آن‌ها به عنوان القا کننده‌های بسیار قوی پاسخ ایمنی هومورال و سلولی در عفونت‌های متعدد شناخته شده‌اند. Hsp70 جلوی مرگ و میر سلول‌هایی را که در معرض حمله TNF (فاکتورهای نکروز دهنده‌ی توموری) هستند را می‌گیرد و مانع تولید مقدار زیاد اینترکولین 6 می‌شود. همچنین Hsp70 از آپوپتوزیس ناشی از شوک حرارتی در سلول‌ها جلوگیری می‌کند و در کرم‌ها، پروتوزوئرها، قارچ‌ها و باکتری‌ها به عنوان هدف‌های آنتی‌بادی شناخته شده‌اند. قابل ذکر است که برخی از اعضای خانواده Hsp نظیر Hsp70 و Hsp90 می‌توانند سلول‌های مربوط به سیستم ذاتی را تحریک کنند. (مطیعی و همکاران، 1390).
2-8- نقش Hsp70 و Hsp90 در فیزیولوژی سلولی
2-8-1-نقش در تنظیم شکل فضایی پروتئین‌ها
اولین عملکرد سلولی Hsp90 در یوکاریوت‌های عالی به این گونه است که در فقدان هورمون، به گیرنده‌های هورمون‌های استروئیدی متصل می‌شوند. این کمپلکس‌ها پایدار هستند. هورمون‌های استروئیدی باعث جدایی کمپلکس و دیمریزاسیون گیرنده می‌شوند که برای اتصال DNA و فعال شدن رونویسی نیاز است. اتصال با Hsp90 به عنوان یک حد واسط در تاخوردگی محسوب می‌گردد. کمپلکس سوپر چاپرون Hsp90 شامل چندین ترکیب چاپرونی است که قادر است مستقیماٌ با پروتئین‌های غیر طبیعی واکنش کند. در نتیجه Hsp90 می‌تواند با مکانیسم ویژه همراه با فاکتورها تاخوردن پروتئین‌های هدف را حمایت نماید (صالح‌پور و همکاران، 1389).
2-8-2-هدف جدید داروی ضد تومور گلدانامایسین (Geldanamyscin)
اخیراٌ Hsp90 به عنوان هدف جدید داروهای ضد تومور در نظر گرفته می‌شود. ترکیبات طبیعی مواد بازدارنده تکثیر سلول‌های تومور، بنزوکینون آنسامایسین GA می‌باشد که از استرپتومایسین هیگروسکوپیک به دست آمده است. GA بازدارنده چرخه کینازهای سلولی است.GA موجب جدایی سریع Hsp90-raf-1 و در نهایت موجب از بین رفتن پروتئین raf-1 کیناز می‌شود. ولی سنتز raf-1 افزایش می‌یابد و از سیتوزول به غشاء پلاسمایی منتقل می‌شود برای این‌که raf-1 پایدار بماند باید به Hsp90 اتصال یابد تا در سلول به طور مناسب مستقر گردد. احتمالاٌGA بازدارنده عملکرد ویژه Hsp90 می‌باشد. این ایراد با تحقیقات دیگری تأیید و نشان داده شد که GA به طور کامل عملکرد Hsp90 را غیرفعال نمی‌کند بلکه در مرحله خاصی چرخه دینامیک پروتئین‌های سوبسترا را متوقف نماید. GA به مکان اتصال ATP در Hsp90 متصل می‌شود و ساختمان N ترمینال Hsp90 را برای اتصال به پروتئین‌ها را تغییر می‌دهد و ناحیه C ترمینال تحت تأثیر دارو قرار نمی‌گیرد. مقایسه ساختمان پایانه N ترمینال Hsp90 در حضور GA یا ATP نشان می‌دهد که GAمشابهADP/ATP است. تقریباٌ همه واکنش‌های هیدروفوبیک بین GA و Hsp90 به صورت واکنش‌های اکی‌والان می‌باشد. ویژگی اتصال GA به Hsp90 نشان می‌دهد که GA به Hsp70 متصل نمی‌شود (فروتن جهرمی، 2012).
2-8-3- جابجایی گیرنده در سیتوپلاسم
رسپتور گلوکوکوتیکوئید (GR) یک مدل مناسب برای حرکت فاکتور رونویسی از سیتوپلاسم به هسته می‌باشد. زیرا این فاکتورها به طور طبیعی در سیتوپلاسم سلول‌های فاقد هورمون وجود دارد و حرکت آن به هسته وابسته به هورمون است. به‌طور کلی گیرنده‌های استروئیدی بین سیتوپلاسم و هسته در حال حرکت می‌باشند. با تغییر شکل لیگاند کمپلکس Hsp90.GR تغییراتی برای تجمع در هسته ایجاد می‌شود. در ابتدا تصور می‌شد تغییر شکل وابسته به لیگاند GR باعث رهایی Hsp90 می‌شود که برای حرکت به هسته، گیرنده را ترک می‌کند ولی اخیراٌ مشخص شده است که GR به همراه Hsp90 منتقل می‌شود (شرملی و همکاران، 1998).
2-8-4- انتقال از منافذ هسته
وقتی کمپلکس به غشای هسته می‌رسد پروتئین‌های علامت دهنده (signaling) آن‌ها را از منافذ هسته عبور می‌دهد که عبور انتخابی گیرنده‌ها به داخل یا خارج Importin و Exportin نامیده می‌شود. برای برخی ترکیبات 2 پروتئین Importin وجود دارد که در ورود این ترکیبات به داخل هسته دخالت می‌کند. علاوه بر Importin ها و Exportin ها، چاپرون Hsp70 نقش مهمی در عبور ترکیبات از منافذ هسته دارند. Hsp70 در شناسایی NLS دخالت دارد ولی چگونگی آن مشخص نیست (ردی و تیوآری، 2011).
2-9- نقش Hsp70 و Hsp90 در تاخوردگی (Folding) پروتئین‌ها
اگر چه جزئیات سه بعدی چند صد پروتئین شناخته شده است، ولی مسیری که این پلی‌پپتیدها به شکل فضایی نهایی خود می‌رسند مشخص نشده است. مطالعات در مورد تاخوردگی مجدد (Refolding) ریبونوکلئاز در شرایط آزمایشگاهی اطلاعات لازم برای تعیین شکل فضایی نهایی پروتئین را فراهم نمود. پروتئین‌های دناتوره شده می‌توانند مجدداٌ تاخورده و به شکل فضایی طبیعی برسد. تاخوردگی مجدد در شرایط آزمایشگاهی ممکن است با واکنش زیر انجام گیرد.
1- تخریب نواحی هیدروفوبیک به مولکول داخلی.
2- تشکیل ساختمان ثانویه که شرایط را برای تاخوردگی بعدی فراهم می‌کند.
3- ایجاد واکنش‌های کووالانت، مثل اتصالات دی‌سولفید، که باعث پایداری پلی‌پپتیدها به شکل فضایی می‌گردد.
در تاخوردگی مجدد پروتئین در شرایط آزمایشگاهی عدم تاخوردگی پلی‌پپتیدها به ندرت رخ می‌دهد مگر این‌که در مدت سنتز در درجه حرارت‌های بالا باشد. در نهایت پلی‌پپتیدهایی که قسمتی از آن‌ها تانخورده به همراه پروتئین‌های ویژه‌ای، مخصوصاٌ پروتئین‌های شوک حرارتی تشکیل کمپلکس داده و موجب تاخوردگی نهایی پروتئین می‌شود. از مهم‌ترین خانوادهHSP ی که در این عمل نقش اساسی دارد می‌توان به Hsp70 اشاره نمود. Hsp70 و پروتئین‌های همراه آن می‌توانند پلی‌پپتیدهای تازه سنتز شده را پایدار کرده تا بخش‌های مختلف زنجیره برای تاخوردگی در دسترس قرار گیرد (بوکان و همکاران، 1998؛ مانده و همکاران 1989).
2-10- Hsp70 و Hsp90 و تنظیم آپوپتوزیس
آسیب‌های وارده به سلول می‌تواند دو نوع پاسخ متفاوت ایجاد کند.
1- آپوپتوز: که حالتی از مرگ سلولی است که سلول‌های آسیب دیده را حذف می‌کند تا از ایجاد التهاب جلوگیری نماید.
2- شوک گرمایی یا پاسخ به استرس: که از آسیب جلوگیری می‌کند و یا باعث بهبودی سلول آسیب دیده و در نتیجه باعث بقاء حیات سلول می‌گردد.
برهم کنش‌های بین این دو مسیر تعیین می‌کند که یک سلول در شرایط استرس‌های بیولوژیک چه پاسخی از خود نشان می‌دهد. آپوپتوزیس یک مسیر مرگ برنامه ریزی شده سلول است. آپوپتوزیس توسط خانواده‌ای از پروتئازها تحت عنوان کاسپازها (عامل فعال شدن) انجام می‌شود. مولکول محرک دیگر در آپوپتوزیس Apaf-1 (فاکتور فعال کننده آپوپتوزیس) است و از دیگر تنظیم کنندگان آپوپتوزیس خانواده BCL-2 می‌باشد که شامل مولکول‌های پیش آپوپتیک Bax، Bad، Bak، Bid می‌باشد (شکل 2-2).

شکل 2-2- آپپتوزیس
از مهم‌ترین Hspها در آپپتوزیس Hsp70 و Hsp90 می‌باشند. فعالیت‌های چاپرونی Hspها با چرخه واکنش‌های اتصال به ATP، هیدرولیز و تعویض نوکلئوتید تنظیم می‌شود. در اثر این واکنش‌ها مجموعه‌ای از چرخه‌های اتصال و جدا شدن بین Hspها و پلی‌پپتیدهای هدف ایجاد می‌شود. در حالتی که Hsp به ADP متصل است Hspها به کندی به پپتیدها متصل شده اما پایداری آن بیشتر است. این فعالیت توسط کوفاکتورهای کوچاپرون‌ها تنظیم می‌شود. این‌ها شامل پروتئین‌های واکنش دهنده با Hsp70 و پروتئین سازمان دهنده Hsp90 است.پروتئینHsp70 بر دو مسیر داخل سلولی و خارج سلولی آپوپتوزیس تأثیر دارد. Hsp70 سلول را از استرس اکسیداتیو، عوامل شیمی درمانی و تشعشعات محافظت می‌نماید.Hsp70 در استرس حرارتی ایجاد شده در سلول از جابجایی پروتئین Bax از سیتوپلاسم به میتوکندری جلوگیری می‌کند.Hsp90 توسط Apaf-1(فاکتور فعال کننده آپوپتوزیس) مداخله می‌کند به این صورت که از الیگومراسیون مولکول‌های ادپتور پروکاسپاز 9 برای تشکیل آپوپتوزوم جلوگیری می‌نماید (پرسل و لیندکایست، 1993؛ بیر 2004؛ فان و همکاران، 2014).

شکل 2-3- فرآیند آپپتوزیس با حضور Hsp70
2-11- Hsp70 و Hsp90 و بیماری‌ها
پلی‌پپتیدهایی که تازه سنتز شده‌اند در سلول تاخورده و شکل فضایی خود را به دست می‌آورند که تاخوردگی‌های این پلی‌پپتیدها توسط پروتئین شوک حرارتی انجام می‌شود.پلی‌پپتیدهایی که تاخوردگی مناسب را پیدا نکرده باعث ایجاد اجتماعاتی در سلول می‌شوند که تجزیه این تجمعات نیز توسط پروتئین شوک حرارتی انجام می‌گیرد. پروتئین‌های شوک حرارتی با سایر پروتئین‌های مسؤول تاخوردگی پروتئین و پروتئین‌های انتقالی واکنش هیدروفوبیک میدهند، زنجیره‌های پروتئینی که قسمتی از آن‌ها تانخورده (unfold) است دارای بخش‌های هیدروفوبیک می‌باشد که تمایل به ایجاد تجمعات دارد. پروتئین‌های شوک حرارتی بزرگ ساختمال لوله‌ای دارند که پروتئین‌های تانخورده (unfold) وارد آن می‌شوند و ساختمان نامناسب حذف می‌گردد (دلیژ و همکاران، 1391).
2-11-1- سرطان
پروتئین‌های شوک حرارتی در سرطان‌های انسان به طور وسیعی بیان می‌شوند و در تکثیر سلول‌هایی تومور، تمایز، تهاجم، مرگ و شناسایی توسط سیستم ایمنی دخالت دارند. بیان Hsp70 در سلول‌های سرطانی کبد و رحم افزایش می‌یابد. Hsp90 یکی از مهم‌ترین پروتئین‌های موجود در سلول‌های یوکاریوتی است که با انواعی از پروتئین‌های کلیدی مؤثر در پیشرفت سرطان پروستات و مری واکنش می‌دهد. در سرطان پروستات Hsp90 با گیرنده آندروژن واکنش داده و باعث پیشرفت سرطان پروستات می‌گردد. Hsp90 قبل از اتصال لیگاند به گیرنده آندروژن متصل می‌شود. هتروکمپلکس Hsp90، گیرنده آندروژن را پایدار نموده که قسمتی از آن تانخورده می‌ماند که برای تحلیل کافی آندروژن ضروری است. واکنش Hsp90 با گیرنده آندروژن یک هدف محرک در مردان مبتلا به سرطان پروستات مقاوم به هورمون است. یک مکانیسم توسعه مقاومت به هورمون، فعال شدن گیرنده آندروژن مستقل از لیگاند است (یعنی بدون اتصال لیگاند به رسپتور آندروژن، رسپتور فعال می‌شود). داروهایی که از فعال شدن گیرنده آندروژن جلوگیری می‌کنند به‌عنوان یک راه درمانی مناسب در پیشرفت بیماری پس از جراحی و برداشت پروستات است (لی و همکاران، 2009: سنتنرا و همکاران، 2013؛ قربانی و همکاران، 2014؛ اسلوتا هاسپنینا، 2014).
2-11-2- دیابت
دیابت نوع 2، یک وضعیت التهابی است که انتظار می‌رود افزایش سایتوکاین‌ها و تشکیل زیاد رادیکال‌های آزاد و افزایش اکسیداسیون در این بیماری، همگی باعث القای پاسخ پروتئین‌های شوک حرارتی شوند. در حقیقت نقش حیاتی پروتئین‌های شوک حرارتی در دیابت با توانایی آن‌ها برای خنثی کردن و دناتوره شدن پروتئین‌های بافتی و تسهیل ترمیم سلولی و سازوکارهای دفاعی پررنگ شده است. از طرفی در مطالعاتآزمایشگاهیدر مورد سطح پروتئین شوک حرارتی 70 در دیابت،



قیمت: 11200 تومان

Leave a Reply

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *