شناسایی و تعیین نژادهای ویروس وای سیب زمینی (PVY) بروشهای مولکولی در استان گلستان

centertop
2545080-530225
معاونت پژوهش و فناوری
به نام خدا
منشور اخلاق پژوهش
با یاری از خداوند سبحان و اعتقاد به این که عالم محضر خداست و همواره ناظر بر اعمال انسان و به منظور پاس داشت مقام بلند دانش و پژوهش و نظر به اهمیت جایگاه دانشگاه در اعتلای فرهنگ و تمدن بشری، ما دانشجویان و اعضا هیات علمی واحدهای دانشگاه آزاد اسلامی متعهد می گردیم اصول زیر را در انجام فعالیت‌های پژوهشی مدنظر قرار داده و از آن تخطی نکنیم:
1- اصل برائت: التزام به برائت جویی از هر گونه رفتار غیرحرفه‌ای و اعلام موضع نسبت به کسانی که حوزه علم و پژوهش را به شائبه های غیر علمی می‌آلایند.
2- اصل رعایت انصاف و امانت: تعهد به اجتناب از هر گونه جانب‌داری غیر علمی و حفاظت از اموال، تجهیزات و منابع در اختیار.
3- اصل ترویج: تعهد به رواج دانش و اشاعه نتایج تحقیقات و انتقال آن به همکاران علمی و دانشجویان به غیر از مواردی که منع قانونی دارد.
4- اصل احترام: تعهد به رعایت حریم ها و حرمت ها در انجام تحقیقات و رعایت جانب نقد و خودداری از هر گونه حرمت شکنی.
5- اصل رعایت حقوق: التزام به رعایت کامل حقوق پژوهشگران و پژوهیدگان (انسان، حیوان و نبات) و سایر صاحبان حق.
6- اصل راز داری: تعهد به صیانت از اسرار و اطلاعات محرمانه افراد، سازمان ها و کشورها و کلیه افراد و نهادهای مرتبط با تحقیق.
7- اصل حقیقت جویی: تلاش در راستای پی جویی حقیقت و وفاداری به آن و دوری از هر گونه پنهان سازی حقیقت.
8- اصل مالکیت مادی و معنوی: تعهد به رعایت کامل حقوق مادی و معنوی دانشگاه و کلیه همکاران پژوهش.
9- اصل منافع ملی: تعهد به رعایت مصالح ملی و در نظر داشتن به پیشبرد توسعه کشور در کلیه مراحل پژوهش.
-41910-33464500
دانشگاه آزاد اسلامی
واحد دامغان
دانشکده کشاورزی
پایان نامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد
گروه بیماری شناسی گیاهی
عنوان:
شناسایی و تعیین نژادهای ویروس وای سیب زمینی (PVY) بروشهای مولکولی در استان گلستان
استاد راهنما :
دکتر سعید نصراله نژاد
نگارنده :
سون آی بغدادی
شهریور 1391
سپاسگزاری

قبل از هر چیز خدای متعال را سپاس می‌گویم که به بنده حقیر خود توانایی اندوختن دانش و فرصت بهره‌گیری از محضر معلمان و اساتید دلسوز و شفیق را عنایت فرمود.
از مادر و پدر بزرگوار خویش نیز سپاسگزارم که سال‌های طولانی رنج به من آموختن را بر خود هموار کردند و اولین معلمان شایسته‌ام در طول زندگی بوده‌اند. با هیچ زبانی نخواهم توانست از عهده قدرشناسی از آنان برآیم.
برخود لازم می‌دانم از اساتید بزرگوار دانشگاه آزاد اسلامی واحد دامغان و بویژه استاد راهنمای محترم جناب آقای دکتر نصراله نژاد که با جهد و علاقه فراوان زحمت راهنمایی این پایان‌نامه را متقبل شدند بسیار تشکّر و قدردانی نمایم.

فهرست مطالب
TOC o “1-3” h z u چکیده  1مقدمه: PAGEREF _Toc413101269 h 41-1- سیب زمینی PAGEREF _Toc413101270 h 51-1-1- تاریخچه سیب زمینی PAGEREF _Toc413101271 h 51-1-2- گیاه شناسی PAGEREF _Toc413101272 h 61-1-3- دما : PAGEREF _Toc413101273 h 81-1-4- خاک و کود PAGEREF _Toc413101275 h 91-1-5- اهمیت اقتصادی سیب زمینی PAGEREF _Toc413101276 h 101-2-1- علایم بیماری های ویروسی سیب زمینی PAGEREF _Toc413101277 h 111-2-2- همه گیرشناسی و چرخه ی بیماری PAGEREF _Toc413101278 h 111-2-3- کنترل بیماریهای ویروسی سیب زمینی PAGEREF _Toc413101279 h 121-3- فرضیه ها PAGEREF _Toc413101280 h 121-4- اهداف PAGEREF _Toc413101281 h 12فصل دوم PAGEREF _Toc413101282 h 132-1- ویژگیهای گروه پوتی ویروس‏ها PAGEREF _Toc413101283 h 142-1-1- ویروس وای سیب زمینی PAGEREF _Toc413101284 h 152-1-1-1- دامنه میزبانی و علایم ویروس وای سیب زمینی PAGEREF _Toc413101285 h 162-1-1-2- وضعیت ویروس وای سیب زمینی در ایران PAGEREF _Toc413101286 h 172-1-1-3- ناقلین ویروس وای سیب زمینی PAGEREF _Toc413101287 h 182-1-1-4-ساختار ژنتیکی PAGEREF _Toc413101288 h 192-1-1-5-نژادهای ویروس وای سیب زمینی PAGEREF _Toc413101289 h 192-1-1-5-2- نژاد N PAGEREF _Toc413101290 h 202-1-1-5-3-نژاد C PAGEREF _Toc413101291 h 212-1-1-6-روشهای بررسی نژادهای PVY : PAGEREF _Toc413101292 h 212-1-1-7-نوترکیبی در ژنوم ویروس y سیب زمینی PAGEREF _Toc413101293 h 222-1-1-8-مقایسه دو روش رایج شناسایی PVY PAGEREF _Toc413101294 h 23فصل سوم PAGEREF _Toc413101295 h 263-1-نمونه برداری از مزارع سیب زمینی PAGEREF _Toc413101296 h 273-2- مواد گیاهی PAGEREF _Toc413101297 h 283-2-1- نگهداری نمونه ها در آزمایشگاه PAGEREF _Toc413101298 h 283-3-آزمون آزمون الایزای غیر مستقیم PAGEREF _Toc413101299 h 293-5- انتخاب جدایه های مثبت PAGEREF _Toc413101300 h 303-6- مطالعات گلخانهای PAGEREF _Toc413101301 h 303-6-1- آماده سازی گیاهان گلخانهای PAGEREF _Toc413101302 h 313-6-2- مایه زنی گیاهان گلخانهای PAGEREF _Toc413101303 h 313-7- روش آزمون RT-PCR PAGEREF _Toc413101304 h 333-7-1 روش تهیه cDNA PAGEREF _Toc413101305 h 333-7-3 مراحل به دام اندازی RNA ویروس PAGEREF _Toc413101306 h 343-9- انجام واکنش PCR PAGEREF _Toc413101308 h 353-9-1- طراحی پرایمر PAGEREF _Toc413101309 h 353-9-2 روش آزمون واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) PAGEREF _Toc413101310 h 363-10 روش تهیه ی ژل و انجام الکتروفورز برای بررسی نتایج آزمون PCR PAGEREF _Toc413101313 h 373-11- مقایسه توالی نوکلئوتیدی نژادهای PVYبا توالی مشابه در سایر جدایه های موجود در بانک ژن PAGEREF _Toc413101314 h 38فصل چهارم: PAGEREF _Toc413101315 h 424-1- منبع ویروس PAGEREF _Toc413101316 h 434-2- نتایج آزمون الایزای غیر مستقیم PAGEREF _Toc413101317 h 444-3 مطالعات گلخانه ای PAGEREF _Toc413101318 h 464-5- نتایج آزمون RT-PCR PAGEREF _Toc413101319 h 474-6- تنوع ژنتیکی PAGEREF _Toc413101320 h 524-7- بیشترین درصد تشابه جدایه های مورد بررسی با نژادهای اصلی PVY در جهان : PAGEREF _Toc413101321 h 524-7- مقایسه نتایج حاصله از آزمونهای الایزای غیرمستقیم و RT-PCR PAGEREF _Toc413101322 h 54فصل پنجم PAGEREF _Toc413101323 h 555-1- بررسی نوترکیبی در ایزولههای ایرانی ویروس Y سیب زمینی: PAGEREF _Toc413101324 h 585-2- پیشنهادات اجرایی و پژوهشی PAGEREF _Toc413101325 h 59فهرست منابع و ماخذ PAGEREF _Toc413101326 h 61منابع انگلیسی: PAGEREF _Toc413101327 h 64

فهرست جداول
جدول شمارهی 3-1- مواد لازم در مخلوط واکنش ترانویسی معکوس (RT)……………………………………….44
جدول 3-2- توالی و موقعیت آغازگرهای مورد استفاده در این تحقیق…………………………………………………………45
جدول شمارهی 3-3- مواد لازم در واکنش PCR…………………………………………………………………………….46
جدول شمارهی 3-4- چرخهی دمایی آزمون واکنش زنجیره ای پلیمراز………………………………………………47
جدول 3-5- مواد لازم و مقدار هر یک از آنها برای تهیه محلول پایه PCR………………………………………………….47
جدول3-6 جدابههای ویروس وای سیبزمینی که CP آنها مقایسه شده است………………………………………………49
جدول 4-1- فراوانی ویروس Y سیب زمینی در کل نمونهها به تفکیک منطقه نمونه برداری…………………………..55

فهرست اشکال
شکل 2-1- الف- ساختار فیزیکی (رشتهای خمشپذیر) (بینام، 2009). ب- تصویر شماتیک از اجزاء ژنوم PVY………………………………………………………………………………………………………………………………………….26
شکل3-1- علائم ویروس Y سیب زمینی برروی سیب زمینی( الف-نکروز رگبرگ، ب-روشنی رگبرگ)……………………………………………………………………………………………………………………………………..38
شکل 3-3- مرحله کاشت گیاهان گلخانهای……………………………………………………………………………………43
شکل 4-1- موزاییک و زردی ایجاد شده توسط ویروس Y سیب زمینی……………………………………………..53
شکل 4-2- علائم موزائیک در اثر PVY بر روی برگ سیب زمینی…………………………………………………….53
شکل 4-3- علائم ایجاد رگبرگ روشنی ونکروتیک بوسیله ویروس Y سیب زمینی بر روی سیب زمینی..54
شکل 4-4 نتایج تست سرولوژیک نمونه های آلوده به pvy درسطح مناطق مختلف استان…………………..55
شکل 4-5- نکروز و موزائیک برروی گیاه توتون رقم سامسون بوسیله تلقیح PVY……………………………..56
شکل 4-6- ایجاد موزائیک و بوسیله ویروس Y سیب زمینی…………………………………………………………….57
شکل 4-7- ایجاد نکروز رگبرگ بوسیله PVY ……………………………………………………………………………….57
شکل 4-8- نتایج آزمون PCR در ژل آگارز 1% با بافر TBE. سمت چپ: مارکر DNA. چاهک آلوده به PVY. قطعه ای به اندازه 990 نوکلئوتید تکثیر شده است…………………………………………………………………..58
شکل4-9- دندروگرام (درختواره) حاصل از گروهبندی ایزولههای توالییابی شده در این آزمایش به همراه ایزولهها و استرینهای ایرانی موجود در بانک ژن که به روش Parsimony Maximum-در نرم افزار MEGA5 به دست آمده است……………………………………………………………………………………………….59
شکل4-10- دندروگرام (درختواره) حاصل از گروهبندی ایزولههای توالییابی شده در این آزمایش به همراه ایزولهها و استرینهای ایرانی و جهان موجود در بانک ژن که به روش Parsimony Maximum-در نرم افزار MEGA5 به دست آمده است……………………………………………………………………………………..60
شکل 4-11- جدول بیشترین درصد تشابه جدایههای مورد بررسی با نژادهای اصلی PVY در دنیا…………63

چکیده  یکی از عوامل محدود کننده کشت سیب زمینی در استان گلستان، بیماریهای گیاهی میباشند که مهمترین آن ویروسها می باشند و در بین آنها، ویروس PVY) Potato virus Y )از مخربترین آنها میباشد. این ویروس بسیاری از گونه های خانواده سولاناسه به علاوه بیش از 60 گونه گیاهی دیگر را آلوده می کند. علائم این ویروس برحسب استرین و رقم سیب زمینی کاملاً متفاوت است. به طور کلی PVY دارای سه نژادPVYN, PVYC, PVYO در ایران گزارش شد. به منظور تعیین استرینهای این ویروس در سال زراعس 1391 تعداد 170 نمونه از 80 مزرعه سیب زمینی استان گلستان (گالیکش، مینودشت، آزادشهر، رامیان، دلند، قرق، فاضل آباد، علی آباد، گرگان و کردکوی) گرفته شد. نمونه ها  با روش سرولوژیک الیزای غیرمستقیم با آنتی سرم PVY تست شدند، و نمونه هایی که در این تست مثبت بودند روی گیاه محک مایه زنی گردید و قسمتی از این نمونه های مثبت، با کیت Capture mRNA، به دام اندازی RNA ویروس صورت گرفت. RNA به دام افتاده در واکنش رونویسی معکوس تبدیل به cDNA گردبد.، جهت تکثیر cDNAی تولید شده، واکنش PCR انجام شد. محصول نهایی PCR، به منظور تعیین ترادف به شرکت ماکروژن کره جنوبی ارسال و تعیین ترادف گردید این ترادفها با ترادف سایر جدایه های PVY موجود در بانک ژن توسط برنامه Clustal X همردیف سازی و مقایسه شد و مشابهت نوکلئوتیدی و آمینو اسیدی بین آنها در برنامه MegAlign  محاسبه شد. درخت فیلوژنتیکی حاصل از همردیف سازی ترادفها توسط برنامه MEGA5 به روش Neighbor-joining با متد Kimura-2 بدست آمد و به وسیله نرم افزار Treeview ارزیابی شد. نتایج این تحقیق نشان داد که از بین 170 نمونه، تعداد نمونه آلوده به ویروس بودند که سه نژاد PVYN, , PVYO ،PVYWilga برای اولین بار در این استان روی میزبان مذکور گزارش می شود. همچنین آنالیزهای فیلوژنتیک ناحیه CP جدایه های مورد بررسی در این تحقیق نشان داد که نژاد  PVYN با 03/64 درصد پراکنش به عنوان نژاد غالب در مزارع سیب زمینی استان گلستان شیوع داشته اما نژاد PVYC در این استان مشاهده نشد. همچنین نتایج نشان داد که منطقه کردکوی با 54.8 درصد فراوانی آلودگی بیشترین میزان آلودگی را به PVY در بین مناطق دیگر در سال زراعی 91 نشان داد. نتایج مقایسه ترادف ناحیه ژن پروتئین پوششی نشان داد که جدایه های گرگان و آزادشهر شباهت بیشتری (99تا97درصد) به یکدیگر داشتند اما جدایه مینودشت، گالیکش، کردکوی در زیر گروه علی آباد قرار گرفته اند. جدایه های گزارش شده از کرمان با جدایه های گلستان هم گروه شده اند که بیانگر رابطه نزدیک فیلوژنتیکی بین آنهاست. به دنبال آن بترتیب جدایه های خراسان، اصفهان، اردبیل، ، شیراز (نژاد بوشهر) نزدیک تر بوده اند. جدایه های زنجان و اردبیل در گروه جداگانه ای قرار گرفته اند که دارای شباهت بیشتری به جدایه ای از اردبیل ارزیابی شده است. در دندروگرام مربوط به مقایسات جدایه های ایران با سایر کشورهای دنیا نتایج نشان داد که جدایه های گلستان با جدایه های کرمان هم گروه بوده، که شباهت نزد یکی با جدایه های آلمان، کانادا و آمریکا داشته اند. که بیانگر رابطه ژنتیکی بالا(94% شباهت ژنتیکی) می‌باشد. همچنین نتایج  نشان داد که تنوع ژنتیکی بین جدائیه ها که با روش حداکثر درستنمایی1 در نرم افزار BioEdit نسبت جایگزینی انتقالی به

این نوشته در پایان نامه ها ارسال شده است. افزودن پیوند یکتا به علاقه‌مندی‌ها.

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *