شناسایی ارقامی از اسفناج که از نظر میزان اسید اگزالیک مطلوب هستند – Copy

فصل اول: مقدمه و اهداف
1-1 ضرورت و اهمیت موضوع
سبزی‏ها از نظر دارا بودن انواع ویتامین‏ها، مواد معدنی، مواد پروتئینی، ترکیبات قندی و به لحاظ داشتن مقدار قابل توجهی سلولز که باعث سهولت هضم غذا می‏شود، نقش بسیار مهمی در تغذیه انسان ایفا می‏کنند. بسیاری از مواد مورد احتیاج بدن که وجود آنها حتی به مقدار بسیار کم برای ادامه حیات ضروری است مانند ویتامین‏ها در غذاهای حیوانی یافت نمی‏شود و یا مقدار آنها بسیار کم است، درصورتیکه در سبزی‎ها به حد وفور وجود دارد. تحقیقاتی که توسط کارشناسان علم تغذیه انجام گرفته، بیانگر آن است که وجود سبزی‏ها در غذای روزانه انسان الزامی است، به طوریکه باید 80 درصد حجم کل غذا را محصولاتی مثل میوه و سبزی‏ها و 20 درصد بقیه را مواد پروتئینی و مواد قندی تشکیل دهد. سبزی‏ها به دلیل حجم زیادی که به غذا در دستگاه گوارش می‏دهند، باعث تسریع حرکات دودی روده شده و در نتیجه به دفع مواد زاید از روده کمک می‏کنند (دانشور، 1379).
اگزالیک اسید یک اسید قوی به شدت اکسید شده است که به طور گسترده‏ای در طبیعت، گیاهان و حیوانات و هم‏چنین در میان انواع وسیعی از قارچ‏ها و میکروارگانیسم‏ها وجود دارد (لانگ و همکاران، 1994). در بین گیاهان بیشترین غلظت اگزالات در خانواده‏های پلی‏گناسه، آمارانتاسه و کنوپودیاسه وجود دارد و از بین گونه‏هایی که در این خانواده‏ها وجود دارد اسفناج دارای بیشترین مقدار اگزالات است (سی‏ینر و همکاران، 2006). این اسید در اسفناج به صورت اسید آلی و هم چنین کریستال‏های معدنی که به صورت نمک‏های محلول مانند پتاسیم، سدیم و روی و نمک‏های غیر محلول که در روده نمی‏توانند جذب شوند و به وسیله مدفوع دفع می‏‏شود، وجود دارد. به همین علت جذب کلسیم، آهن و منیزیم علی‏‏‏رغم فراوانی آنها در اسفناج کاهش پیدا می‏کند (مو، 2008). اگزالات موجود در اسفناج با اتصال به آهن موجود در دستگاه گوارش به یک مولکول بیش از حد بزرگ تبدیل می‏شود که به خوبی جذب نمی‏شود و فقط 025/0 درصد آهن جذب می‏گردد (لانگ و همکاران، 1994).
ریزماهوارهها واحدهای نوکلئوتیدی دو، سه، چهار تا د‏ه‏تایی تکرار شوندهای هستند که در طول ژنوم موجودات یوکاریوتی مانند گیاهان به وفور یافت میشوند و به علت جهشهای فراوان از تنوع قابل ملاحظهای در بین افراد یک جمعیت برخوردار میباشند. این واحدهای تکراری توسط دو ردیف منحصربهفرد حفاظت شده در دو طرف واحد تکراری محدود شدهاند (داش و همکاران، 1996؛ داویروالا و همکاران، 2000)، بنابراین براساس این توالیهای حفاظت شده میتوان آغازگرهای اختصاصی طراحی نمود و نشانگرهای انحصاری مبتنی بر واکنش زنجیرهای پلی‏مراز برای هر جایگاه بهدست آورد (نیکولوسی و همکاران، 2000). مطالعات مقایسه‏ای در گونه‏های گیاهی نشان دادهاند که نشانگرهای ریزماهواره از بسیاری دیگر از نشانگرها متنوعتر بوده و ابزاری قدرتمند برای تمایز بین ژنوتیپ‏ها میباشند (پاول و همکاران، 1996 و روسل و همکاران، 1997). نشانگرهایSSR به علت همبارز بودن، چندشکلی بالا، تکرارپذیری بالا و پراکندگی در سراسر ژنوم نشانگرهای قوی هستند (خانام و همکاران، 2012). از این خصوصیات نشانگرهای SSR می‏توان برای شناسایی نواحی با ارزش تجاری در طول ژنوم موجودات زنده استفاده کرد.
با توجه به تنوع موجود در گیاه اسفناج و ضرورت جذب آهن توسط موجودات زنده به خصوص انسان میتوان تنوع موجود در آن را از طریق نشانگرهای ریزماهواره تحقیق حاضر با اهداف زیر طراحی و اجرا شد:
1-2 اهداف
1- شناسایی ارقامی که از نظر میزان اسید اگزالیک مطلوب هستند،
2- بررسی میزان تنوع داخلی و بین ارقام اسفناج مورد مطالعه،
3- شناسایی جایگاه‏ها و آلل‏های ریزماهواره‏ای که با ژن‏های موثر بر تولید اسیداگزالیک و نهایتاً جدب آهن موثر هستند.
فصل دوم: مروری بر پژوهش‏های انجام شده
2-1مشخصات گیاه‏شناسی اسفناج
2-1-1 برگ
اسفناج سبزی برگی یکساله، فصل خنک و علفی متعلق به تیره چغندرسانان (Chenopodiacea) می‏باشد که برگ‏ها و ساقه‏های ظریف آن به صورت تازه و یا فرآوری شده مصرف می‏شود (روباتزکی و یاماگوچی،1997).این گیاه دیپلوئید (12=n2) روز بلند و دو پایه است (بالکایا و همکاران، 2005 و عرشی، 1379). اسفناج پس از سبز شدن، برگ‏های طوقه‏ای تولید می‏کند به این ترتیب که برگ‏ها در یک سطح در اطراف ساقه کوتاهی نزدیک به سطح خاک قرار می‏گیرند. طی رشد بعدی این ساقه طویل شده و از آن شاخه‏های جانبی دیگری از محل اتصال برگ‏های طوقه‏ای به ساقه اصلی منشعب می‏شوند و ممکن است از ساقه اصلی ساقه‏های فرعی درجه 1 و 2 نیز به وجود آیند (پیوست، 1384). ساقه در بعضی از انواع اسفناج به رنگ قرمز رنگ دیده می‏شود که علت آن وجود رنگدانه آنتوسیانین می‏باشد (اسدی، 1385). ارتفاع بوته اسفناج به 30 تا 60 سانتیمتر می‏رسد. برگ‏ها به طور متناوب روی ساقه قرار می‏گیرند و شکل برگ‏ها متفاوت است. برگ‏های یک بوته همه یکسان نبوده ولی شبیه به یکدیگر می‏باشند (کاشی، 1376).
برگ‏ها در ارقام مختلف نیز دارای فرم متفاوتی هستند و به شکل‏های تخم مرغی، گرد و یا نیزه‏ای وجود دارند. کناره برگ‏ها می‏تواند کاملاً صاف و یا دندانه‏دار باشد. پهنک برگ نیز صاف و یا دارای چین و چروک است. ارقامی که دارای برگ‏های چین و چروک‏دار می‏باشند، از نظر نگهداری در انبار مناسب‏تر هستند، زیرا تهویه در آن‏ها بهتر صورت می‏گیرد، ولی در عوض به سختی قابل شستشو می‏باشند (اسدی، 1385). در انواع اسفناج برگ صاف، مقدار ماده خشک بیشتری نسبت به نوع برگ چروکیده گزارش شده است (عرشی، 1379). نوع پیچ‏دار در درجه اول برای استفاده تازه در بازار می‏باشد، نوع برگ صاف و بدون پیچ که برای آزمایشات و پردازش‏ها استفاده می‏شود و نوع اسفناج کوچک که برای طعم در سالاد استفاده می‏شود و به خاطر بافت ظریفش ترجیح داده می‏شود (پجیک و همکاران، 1998). دمبرگ‏ها معمولا از نظر طول، هم اندازه پهنک برگ هستند و اغلب زمانی که برگ‏ها کاملا رشد می‏کنند تو خالی می‏شوند. عادت رشد برگ‏های اسفناج از خوابیده تا کاملا ایستاده متفاوت است (اسدی،1385).
2-1-2ریشه
ریشه اسفناج از تعداد زیادی ریشه‏های فیبری جانبی که از یک ریشه اصلی ضخیم منشأ گرفته‏اند، تشکیل شده است (روباتزکی و یاماگوچی، 1997). ریشه اصلی عمیق است و می‏تواند تا عمق 140 سانتیمتری در خاک نفوذ کند.بدین دلیل می‏توان اینگیاه را در خاک‏های شور به خوبی کشت کرد. ریشه‏های فرعی این گیاه دوکی شکل و حداکثر تا 60 سانتیمتری در خاک پراکنده‏اند (پیوست،1384).
2-1-3گل
اسفناج از نظر جنسیت گیاهی دو پایه است و بوته‏هایی با گل‏های نر و بوته‏هایی با گل‏های ماده به وجود می‏آورد. البته در مواردی هم بوته‏های یک پایه‏ای که دارای گل‏های نر و ماده روی یک پایه هستند، نیز گزارش شده است(خاتک و همکاران، 2004).اگرچه گیاهان کوچک معمولاً نر هستند، ولی تشخیص جنسیت گیاهان اسفناج نرقبل از گلدهی دشوار است. همچنین بوته‏های نر و ماده بر اساس مقدار کربوهیدرات و رنگیزه‏های موجود در بوته‏ها شناسایی می‏شوند. قندها، کلروفیلو مقدار کارتنوئید در گیاهان ماده بیشتر از نر می‏باشد (عرشی، 1379).
در مناطقی که تابستان‏های گرمی دارند به علت گرمای هوا و همچنین به علت طول روز بلند، اسفناج را در پاییز برای برداشت زمستانه و در اسفند ماه برای محصول بهاره و نقاط سردسیر در اوایل بهار کشت می‏کنند (خوشخوی و همکاران،1374). زمان گل دادن اسفناج باتوجه به زمان کاشت در اکثر موارد در اواخر فروردین تا اوایل خرداد است (اسدی، 1385). گلدهی معمولا از قسمت میانی ساقه‏های بزرگ شروع شده و به طرف بالا و پایین ساقه ادامه پیدا می‏کند (عرشی، 1379).
گل‏های ماده در اسفناج اغلب در زاویه برگ‏ها قرار دارند و دارای تخمدانی چهار یا پنج خامه‏ای است که به دو تا چهار برچه ختم می‏شود. گل‏های نر بدون گلبرگ به صورت خوشه‏ای در طول ساقه به وجود می‏آیند و گرده‏افشانی آن بوسیله‏ی باد صورت می‏گیرد(عرشی، 1379).
2-1-4بذر
بذر اسفناج گرد و خاکستری و نسبتأ کوچک است و در بعضی از انواع آن 3 یا 4 برآمدگی شبیه به خار وجود دارد، به همین دلیل آن‏ها را بذر خاردار می‏گویند. کشت ارقام خاردار قدمت بیشتری دارد، امادر سطح تجاری از بذور صاف استفاده می‏شود زیرابذرهای صاف از نظر کاشت مخصوصا بوسیله‎‏ ماشین بذرکار بر انواع بذر خاردار برتری دارند (شیبانی، 1369).
2-2پرورش اسفناج
2-2-1شرایط آب و هوایی مناسب برای پرورش اسفناج
اسفناج یک محصول فصل خنک است (اسپیلتس توسر، 1990) که سرمای زیر صفر را بهتر از سایر سبزی‏های فصل خنک تحمل می‏کند. در دمای 18+ تا 20+ درجه سانتیگراد بهترین رشد را دارد و در دمای کمتر از 10+ درجه سانتیگراد، رشد این گیاه کند می‏شود. دمای مناسب برای جوانه زنی آن نیز 20+ درجه سانتیگراد است (روباتزکی و یاماگوچی،1997).
رطوبت کافیهوا در رشد و نمو وکیفیت اسفناج اثر مثبت دارد. خشکی هوا و گرما باعث به گل رفتن و بذر دادن اسفناج می‏شود، بنابراین در مناطقی که تابستان‏ها گرم می‏شود، اسفناج را در پاییز، برای برداشت زمستانه و در اسفند ماه، برای محصول بهاره کشت می‏کنند (کاشی، 1376).
2-2-2خاک
اسفناج را می‏توان در هر نوع خاک که از نظر مواد غذایی غنی باشد و زهکش نیز داشته باشد کشت کرد و محصول خوبی برداشت نمود. محیط کشت کم عمق و یا غیر قابل نفوذ برای کشت اسفناج مناسب نیست (کاشی،1376). مناسب‏ترین اسیدیته خاک 5/6 تا 8 گزارش شده است (روباتزکی و یاماگوچی،1997).
2-2-3آبیاری
اسفناج در خاک‏هایی که دارای رطوبت یکنواخت هستند، بهترین نتیجه را می‏دهد (مبلی و پیراسته، 1373). آبیاری منظم علاوه بر این که مقدار محصول را افزایش می‏دهد، گل دادن قبل از موعد گیاه را نیز به تأخیر می‏اندازد (پیوست، 1384).
2-2-3تنک کردن
در صورتی که بخواهند اسفناج را تنک کنند، هنگامی که ارتفاع بوته‏ها به 5/2 سانتیمتر رسید (خاتک و همکاران، 2004) و گیاه دارای دو برگ حقیقی کاملا توسعه یافته است انجام می‏شود (ساندرز، 1990).
2-2-5برداشت
زمان برداشت اسفناج هنگامی است که گیاهان به اندازه قابل فروش رسیده باشند. این اندازه بسته به فصل کشت و درجه حرارت محیط بین 80-30 روزبعد از کاشت می‏باشد (روباتزکی و یاماگوچی، 1997).
2-3ارزش غذایی اسفناج
2-3-1مواد مغذی موجود در اسفناج
وجود مقادیر فراوانی از بتا کاروتن (پیش ماده سنتز ویتامین آ)، فولات (ویتامین ب9)، ویتامین ث، کلسیم، آهن، فسفر، سدیم و پتاسیم در برگ‏های اسفناج نشان می‏دهد این گیاه دارای ارزش غذایی بالایی می‏باشد (دیکوتیو، 2000)، به طوری که در بین 42 نوع میوه و سبزی، از نظر مقدار نسبی 10 نوع ویتامین ومواد معدنی مورد نیاز بدن در رتبه دوم قرار دارد (سالونخه و همکاران، 1991). اسفناج از نظر ویتامین‏های آ و ث غنی است، این دو ماده آنتی‏اکسیدان‎‏های مهمی هستند که به کاهش تعداد رادیکال‏های آزاد در بدن کمک می‏کند (روباتزکی و یاماگوچی، 1997). تحقیقات نشان می‏دهد اسفناج، دارای بالاترین ارزش ORAC (ظرفیت جذب رادیکال اکسیژن) در بین سبزی‏ها می‏باشد (پری‏یر، 2003). این گیاه از نظر داشتن ویتامین ب-3 بسیار غنی است و برای کمک به جلوگیری از سرطان سینه به‏ دلیل محتوای بالای از لوتئین و سایر کارتنوئید‏ها بکار می‏رود(قهرمانی، 1387).
2-3-2 مواد ضد تغذیه‏ای موجود در اسفناج
در بافت‏های اسفناج مقادیر قابل ملاحظه‏ای اسید اگزالیک وجود دارد. اسید اگزالیک و نمک‏های آن، ممکن است اثرات مضری برای مصرف کننده داشته باشند و می‏توانند باعث تشکیل اکسالات کلسیم در مجاری ادراری شوند (سی‏ینر و همکاران، 2003). همچنین اسید اگزالیک باعث جلوگیری از جذب آهن از جدار روده می‏شود (هادکینسون، 1981).
از دیگر مواد ضد تغذیه‏ای در اسفناج ساپونین است. وجود مقادیر ساپونین در جریان خون خطرناک است و ممکن است به علت تجزیه کردن گلبول‏های قرمز خون (همولیز) مهلک باشد (روباتزکی و یاماگوچی، 1997).
2-4خواص دارویی
استفاده از اسفناج برای مصارف دارویی به گذشته‏های دور برمی‏گردد. در انگلستان از عصاره اسفناج برای تمیز کردن زخم‏ها و التیام زگیل استفاده می‏شد (روباتزکی و یاماگوچی، 1997). اسفناج گیاهی محرک و اشتها‏آورو ملین است و یبوست را برطرف می‏کند. به دلیل داشتن ماده‏ای به نام “اسپیناسین” هضم غذا را تسریع می‏کند(قهرمانی،1387). همچنین دارای سکرتین است که اثر تقویت کننده بر روی ترشحات معده، روده و لوزالمعده داشته، ترشحات صفرا را افزایش می‏دهد و حرکات دودی روده را تقویت می‏کند (اسدی،1387). بتا‏کاروتن موجود در آن باعث بهبود فعالیت ریه و کاهش خطر دیابت می‏گردد (سینگ و همکاران، 1997).
اثر مهم خون‏سازی که به اسفناج نسبت داده می‏شود مربوط به مواد موجود در آن مانند مس، ید، ویتامین ث، کلروفیل و آهن و ترکیباتی به نام فولاسید می‏باشد. به علت داشتن مقدار قابل توجهی کلسیم باعث جذب آب در بدن شده و اثرات مثبتی روی گردش خون و قلب دارد. مصرف آن در تغذیه کودکان به عنوان غذای کامل دوره نقاهت، همچنین به عنوان تقویت کننده اعصاب برای کسانی که کارهای فکری دارند، توصیه شده است (اسدی، 1387).
تحقیقات علمی حاکی از خاصیت ضد سرطانی بسیار بالای اسفناج بوده و از نظر پیشگیری به ابتلای سرطان به سلطان گیاهان معروف است. دانشمندان ژاپنی معتقدند که اسفناج در کاهش میزان کلسترول خون نیز موثر می‏باشد (قاسمی، 1382).این سبزی خنک کننده و پایین آورنده تب است. ورم روده کوچک را رفع کرده و برای ورم ریه نیز مفید می‏باشد (قهرمانی، 1387).
بذر اسفناج آرام بخش است و در کاستن التهاب روده و معده نقش مهمی دارد (سینگ و همکاران، 1997). بذور این گیاه به خاطر داشتن مقدار زیادی موسیلاژ دارای خاصیت تب بر می‏باشند (امین، 1370).
در تحقیقی بر روی مواد مغذی تشکیل شده در هفت رقم اسفناج ایرانی مشخص گردید، این رقم‎ها برای تغذیه انسان به عنوان منبع غنی از امگا سه و عناصر معدنی مفید می‏باشند، همچنینمیزان اگزالیک اسید اسفناج‏های ایرانی بسیار کمتر از مقدار گزارش شده در ارقام خارجی است (عرفانی و همکاران، 1385).
2-5منابع ژنتیکی گیاهی و ضرورت شناخت آن
در گذشته جهت تامین مواد غذایی ناشی از افزایش تقاضا، روش‏هایی همچون اصلاح‏نژاد دام‏ها و گیاهان همراه با تغذیه بیشتر زمین‏ها،برداشت بیشتر از ‏زمین‏های کشاورزی را ممکن کرد. اما اینکهدر آینده نیز بتوان با مصرفکودی بیشتر در زمین‏های کشاورزی، انتظار برداشت بیشتری از این زمین‏ها داشته باشیم، بعید به نظر می‏رسد. امنیت غذایی از جمله مباحث جهانی است که بر مفهوم دسترسی به غذای کافی برای تمام مردم در تمام اوقات به منظور زندگی سالم و فعال استوار است. مفهوم تنوع زیستی پایدار نیز در این راستا به عنوان هدفی مطلوب مطرح می‏گردد و حفظ تنوع گیاهی و دامی موجود و یا بهبود آن را مطرح می‏سازد. در دهه اخیر با افزایش روند نابودی محیط زیست در سطح جهان، توجه متخصصان به مسئله تنوع زیستی معطوف شده است. حفاظت و بهره‏برداری از منابع ژنتیکی ارزشمند در کشاورزی از اهمیت فوق‏العاده‏ای برخوردار می‎باشد. حفاظت ذخایر ژنتیکی را باید به عنوان سرمایه و ثروتی که روز به روز ارزش پیدا می‏کند در رأس اولویت‏های تحقیقات قرار داده و با یک برنامه ملی و همه جانبه امکان حفاظت و بهره‏برداری هرچه بهتر از ژن‏های موجود در تنوع زیستی موجود کشور را در برنامه‏های فن‏آوری زیستی فراهم نمود (مظفری و همکاران، 1380).
گیاهان سلسله بسیار مهمی از جانداران کره زمین را تشکیل می‏دهند و نقش اساسی و حیاتی در زندگی و بقاء بشر و سایر جانداران دارند. منابع ژنتیکی گیاهی که شامل توده‏های اولیه گیاهان، ارقام جدید امروزی وابستگان وحشی آن‏ها هستند، جزو با ارزش‏ترین و حیاتی‏ترین ذخایر و منابع طبیعی هر کشور محسوب گردیده و ارزش آن‏ها به هیچ عنوان با سایر ذخایر و منابع طبیعی قابل مقایسه نیست (نادری‏منش و همکاران، 1377).متأسفانه منابع ژنتیکی گیاهی به طور بی‏ساقه‏ای به دلایل گوناگونی در حال از بین رفتن می‏باشند. در کشاورزی مدرن واریته‏های جدید به طور قابل توجهی جایگزین ارقام و توده‏های بومی شده و این توده‏ها که اغلب منابع ژنتیکی ارزشمندی می‏باشند، در حال از بین رفتن هستند. از بین رفتن منابع ژنتیکی گیاهی خطری جدی برای امنیت غذایی بشر در بلند مدت محسوب می‏شود (رائو،2004).
2-6اهمیت منابع ژنتیکی ایران
شناسایی صفات مهم گونه‏های گیاهی که در سازگاری، عملکرد و کیفیت نقش دارند و ارزیابی پتانسیل ژنتیکی این صفات و همچنین منابعی از ژن‏ها برای استفاده در برنامه‏های اصلاحی و انتقال ژن‏های مطلوب به ارقام مورد نظر از جمله راهکارهای اصلاح نبات است. توجه به این اصول، بیانگر این واقعیت است که تنوع ژنتیکی، اساس و پایه کار اصلاح نباتات است. شناسایی و ارزیابی ذخایر توارثی از نظر وجود ژن‏های مورد نیاز، گامی اساسی در این راه است (ارزانی،1389). به طور کلی غنی‏ترین منبع ژنتیکی برای هر گونه، مرکز پیدایش آن یا منطقه جغرافیایی است، که آن گونه از آنجا منشاء گرفته است. این مرکز، غالبا مرکز تنوع، منطقه‏ای است که حداکثر ژنوتیپ‏های مختلف نیز در آنجا یافت می‏شود. ایران به دلیل موقعیت جغرافیایی خاص خود، از نظر مواد ژنتیکی بسیاری از گیاهان یکی از غنی‏ترین نقاط دنیا محسوب می‏شود (خوشخوی و همکاران، 1374) و جزء پنج کشور نخست دنیا از لحاظ تنوع زیستی در گونه‏های گیاهی است (قره یاضی، 1375).
2-7تاریخچه و پراکنش اسفناج
اسفناج خوراکی (Spinacia oleracea L.) بومی مناطق مرکزی آسیا و به احتمال قوی ایران است (عرشی، 1379 و هوچمات و همکاران، 2003). این سبزی از 2000 سال قبل در ایران کشت می‏شده و ایرانیان باستان به خواص آن پی برده بودند (اسپیلتس توسر، 1990). اسفناج به صورت وحشی در سراسر ایران بخصوص در تبریز و خوی انتشار دارد (افتخاری و همکاران، 1389). این گیاه در سال 1100 میلادی بوسیله بازرگانان از ایران به اسپانیا و سپس از اروپا به آمریکا انتقال یافت. کشت گسترده اسفناج به ویژه در هلند، فرانسه و انگلستان از قرن 18 میلادی شروع شده است(اسدی، 1387).
اسفناج اگرچه از زمانهای بسیار قدیم کشت شده، لیکن اهمیت تجاری خود را هنوز پیدا نکرده است. این سبزی از نظر سطح زیر کشت در بین سایر سبزی‏ها در رتبه بیستم قرار دارد و این در حالی است که از نظر مواد معدنی و ارزش غدایی پس از کلم بروکلی در جایگاه دوم اهمیت می‏باشد (اسپیلتس توسر، 1990).
2-8تولید جهانی اسفناج
کشور چین با سهمی معادل 76% تولید جهانی اسفناج، بزرگترین تولید کننده اسفناج در دنیا محسوب می‎‏شود. بعد از آن کشورهای ایالات متحده آمریکا، اندونزی، ژاپن و ترکیه قرار دارند. ایالات متحده آمریکا حدود 4% تولید جهانی اسفناج را به خود اختصاص داده و در جایگاه دوم قرار گرفته است. سطح زیر کشت سبزی‏ها در ایران 803,000 هکتار است که از این سطح زیر کشت حدود 21 میلیون تن انواع سبزی برگی از جمله حدود 000/10 تن اسفناج با متوسط عملکرد 3/14 تن در هکتار برداشت می‏شود (فائو،2007). با وجود بومی بودن اسفناج در کشور تحقیقات جامعی در مورد شناسایی، ارزیابی و اصلاح ژرم پلاسم‏های این سبزی با ارزش نه تنها در ایران بلکه در دنیا صورت نگرفته است. این بی توجهی ممکن است منجر به انقراض برخی از ژنوتیپ‏های با ارزش موجود گردد.
2-9نشانگر‏ها
هر شاخص قابل ارزیابی اعم از فنوتیپی یا ژنوتیپی و یا تفاوت‏های موجود بین کروموزوم‏های دو فرد که به نتایج آنها منتقل می‏گردد را می‏توان نشانگر نامید. رنگ گل، رنگ بذر، یک ترکیب شیمیایی خاص، بو و طعم خاص، فرم‏های مختلف یک آنزیم، پروتئین‏هایذخیره‏ای بذر، تفاوت طولی قطعات DNA و غیره همگی را می‏توان به عنوان نشانگر در نظر گرفت (نقوی و همکاران،1386 و فصیحی هرندی، 1374). به عبارت دیگر هر تفاوت پایداری که بتواند باعث تشخیص دو فرد، دو جمعیت یا دو ژنوتیپ از همدیگر شود به عنوان نشانگر بین آنها شناخته می‏شود (فصیحی هرندی، 1374). پس به طور کلی برای آنکه صفتی به عنوان نشانگر ژنتیک مورد استفاده قرار گیرد باید حداقل واجد دو ویژگی زیر باشد:
1- در بین دو فرد متفاوت باشد (چند شکلی نشان دهد) و
2- به توارث برسد.
به طور کلی می‏توان نشانگرها را به سه دسته مورفولوژیکی، سیتوژنتیکی و مولکولی تقسیم بندی کرد:
2-9-1نشانگرهای مورفولوژیکی
نشانگرهای مورفولوژیکی عمدتاً هم‏ردیف با صفات کیفی هستند که در طبیعت یافت می‏شوند و یا در آزمایشات جهش‏زایی بدست می‏آیند (یوجایل و همکاران، 2003) و اولین نشانگرهای ژنتیکی بودند که از اوایل قرن 20 میلادی مورد استفاده قرار گرفته و از طریق مشاهده رتبه‏بندی می‏شدند (باسیل و همکاران، 2004). این نشانگرها پیامد جهش‏های قابل رویت در مورفولوژی سازواره‏اند و عمدتاً توسط یک ژن کنترل می‏شوند و در صورتی می‏توانند به عنوان نشانگر ژنتیکی مورد استفاده قرار گیرند که بیان آنها در طیف وسیعی از محیط‏های مختلف تکرارپذیر باشد (نقوی و همکاران، 1386). برآورد روابط ژنتیکی و ارزیابی تنوع ژنتیکی بر مبنای صفات مورفولوژیک، فیزیولوژیک و زراعی می‏تواند برای سازماندهی ژرم‏پلاسم، گزینش والدین مناسب برای دورگ‏گیری و تولید جمعیت‏های در حال تفرق سودمند باشد. توسعه کلکسیون‏های مرکزی برای شناسایی ژن‏های مفید و همچنین ارزیابی صفاتی که اندازه‏گیری آنها سخت و پرهزینه است، مؤثر می‏باشد (هارچ و همکاران، 1997). با وجود اینکه بررسی‏های مورفولوژیک هم‏چنان به عنوان مبنا و اولین مرحله در مطالعه پتانسیل ژرم‏پلاسم و طبقه‏بندی آنها مورد استفاده قرار می‏گیرند، اما اغلب به تنهایی نمی‏توانند برای شناسایی روابط ژنتیکی ارقام بکار گرفته شوند (کری‏هالو و دوایودی، 2003). از جمله معایب این نوع ارزیابی اثرات شدید محیط بر این گونه صفات از جمله صفات زراعی است و این امر موجب می‏گردد، صفات زراعی نتوانند انعکاس دقیق و درستی از میزان تنوع ژنتیکی در اختیار اصلاح‏گر قرار دهند (کرمی و همکاران، 1389). و علاوه بر تأثیر محیط ، سن گیاه نیز مشکل بعدی است زیرا برای مشاهده آنها باید تا مدت‏ها منتظر ظهورشان ماند که برای گیاهان چند ساله بسیار مشکل است (میرمحمدی میبدی، 1382)، از جملع معایب دیگر آ‏ن‏ها این است که اغلب دارای توارث غالب و مغلوبی بوده و اثرات اپیستازی و پلیوتروپی دارند، فراوانی و تنوع کمی دارند و کار مشاهده و ثبت آنها زمان‏بر است (نقوی و همکاران، 1386).
2-9-2نشانگرهای مولکولی
اصطلاحانگشت‏نگاریمولکولیبطورکلیبهکاربردتوالیخاصیازمولکولDNAجهتشناساییافراد،ژنوتیپ‏هاولاین‏هااطلاقمی‏شود. روش‏انگشت‏نگاریمولکولیبه همراهنشانگرهایمورفولوژیکی وفیزیکوشیمیاییکاربردوسیعیرادرژنوتیپ‏یابیوتجزیهتحلیلتنوعژنتیکیگیاهانزراعیووحشیپیدانمودهاستکهمی‏توانبه مواردشناساییارقام،تعیینحقوقمالکیتمعنویارقام،آزمون خلوصژنتیکی،بررسیقرابتژنتیکی،آزمونتمایزیکنواختیپایداری(DUS)اشارهنمود.سازمانبینالمللیحمایتازارقامجدیدگیاهی(UPOV)، کمیتهروش‏هایمولکولیوبیوشیمیاییرابرایبررسیکاربردنشانگرهایمولکولیدرسیستمثبترقمتشکیلدادهاست.این کمیته،ازمیاننشانگرهایمولکولیمختلفنشانگرهایریزماهوارهرابه عنوانبهترینروشموجودبرایانگشت‏نگاریDNAجهتقضاوت درشناساییوتشخیصارقاممشتقشدهمعرفینمود (سینگ و همکاران، 2004وUPOV-BMT، 2002). این نشانگرها با انواع متعدد و مزایای بسیار، به عنوان یک نشانگر ابزار تکمیلی همراه نشانگرهای مورفولوژیکی و فیزیولوژی در بررسی روابط فیلوژنتیکی گیاهی مورد استفاده قرار می‏گیرند، زیرا تحت تأثیر شرایط محیطی نبوده و در هر مرحله از رشد گیاه قابل استفاده هستند (مانیفستو و همکاران، 2001). از نشانگرهای مولکولی در مواردی مانند ایحاد نقشه‏های ژنتیکی و فیزیکی در موجودات زنده و شناسایی ژن‏های کمی و کیفی و طبقه‏بندی دقیق آنها استفاده می‏شود (قره‏یاضی، 1375). امروزه استفادهاز نشانگرهای مولکولی برای انگشت‏نگاری ژنتیکی جایگاه ویژه‏ای پیدا نموده است و نشانگرهای مولکولی خصوصاً در آشکار نمودن تنوع ژنتیکی گیاهان خویشاوند وقتی نشانگرهای فنوتیپی قادر به تشخیص آن نیستند، مفید می‏باشند.
نشانگرهای DNA نسبت به نشانگرهای مورفولوژیکی کاراتر و قابل اعتمادتر بوده، از نظر تعداد نامحدود و معمولاً کمتر تحت تأثیر محیط قرار می‏گیرند (نقوی و همکاران، 1386). استفاده از اطلاعات مولکولی در مقایسه با خصوصیات مورفولوژیکی برای بررسی روابط فیلوژنی، از چندین مزیت برخوردار است. به عنوان مثال: الف) هیچ گونه ارزیابی شخصی در تعیین وضعیت دخیل نیست، ب) به دلیل اینکه ساختمان DNA در تمام موجودات زنده از چهار باز نوکلئوتید تشکیل شده است، بنابراین امکان مطالعه مستقیم متنوع‏ترین اشکال حیات وجود دارد، ج) میزان اطلاعات حاصله بسیار زیاد بوده و بدست آوردن این اطلاعات برای گونه‏های مورد نظر در آزمایشگاه نسبتاً ساده است. همچنین در اختیار بودن مزایایی مثل هزینه کم، کامپیوترهای پرقدرت و نرم‏افزارهای جدید، منجر به استفاده رایج از روش‏های مولکولی در بازسازی تاریخ تکاملی موجودات زنده در سطوح مختلف تاکسونومیکی شده است (کومار و فیلیپسکی، 2001). اساس این دسته از نشانگرها تجزیه و تحلیل مستقیم DNA می‏باشد. در مدت یک دهه نشانگرهای DNA تکامل قابل توجهی پیدا کردند به طوری‏که انواع مختلف نشانگرهای DNA با تفاوت‏های زیادی از نظر تکنیکی و روش تولید، نحوه کاربرد، امتیازبندی و تفسیر نتایج ابداع و معرفی گردیدند. بدون تردید، کشف واکنش زنجیره‏ای پلی‏مراز PCR بیشترین نقش را در توسعه و تکامل نشانگرهای DNA داشته است (نقوی و همکاران، 1386). علی‏رغم توانایی بسیار زیاد نشانگرهای مولکولی هنوز ابهامات زیادی وجود دارد که باید قبل از تحقق کامل این تکنولوژی به آنها پاسخ داده شود. به عنوان مثال عدم شناسایی تنوع در سطح مولکولی از طریق این تکنیک‏ها الزاماً به منزله عدم وجود تنوع ژنتیکی مفید برای اصلاح کننده نیست، زیرا همواره ممکن است روند انتقال‏پذیری این نشانگرها نسبت به هم و در ژنوم‏های متفاوت متغیر باشد (باقری و همکاران، 1377). نشانگرهای مولکولی را به دو دسته نشانگرهای پروتئینی و نشانگرهای مبتنی بر DNA تقسیم‏بندی می‏کنند (عبدمیشانی و شاه‏نجات، 1377).
2-9-3نشانگرهای پروتئینی
مطالعات اولیه مولکولی با اهداف طبقه‏بندی با استفاده از نشانگرهای پروتئینی انجام می‏شد. نشانگرهای پروتئینی فرآورده نهایی ژن‏های ساختاری بوده که در واقع بیانگر تنوع موجود در سطح نوکلئوتیدی ژنوم هستند. اما از آنجا که محصولات ژن از روی قسمتی از توالی‏های DNA ساخته می‏شوند در برگیرنده همه تغییرات موجود در سطح DNA نیستند و نمی‏توانند نماینده کل ژنوم باشند. یکی از نشانگرهای پروتئینی معمول نشانگرهای آیزوزایمی هستند که چندین دهه است از آنها استفاده می‏شود. آیزوزایم‏های شکل‏های مختلف یک آنزیم‏اند که اغلب تحرک الکتروفورزی متفاوتی دارند که در بسترهای نشاسته‏ای یا اکریل‏آمیدی از یکدیگر جدا می‏شوند (چاوالا، 2000). این نشانگرها اکثراً همبارز هستند و در بررسی‏های طبقه‏بندی، ژنتیکی و تکاملی گیاهان و همچنین مطالعات اکولوژیکی کاربرد فراوانی داشته و می‏توانند ارقام قابل کشت را از همدیگر تفکیک کنند اما به دلایلی از جمله وقت‏گیر و پرهزینه بودن، نیاز به حجم زیاد نمونه با کیفیت بالا و حجم اطلاعات دریافتی اندک با وجود دقیق بودن زیاد کنار گذاشته شدند (ویدن و لمب، 1987). از دیگر عیوب این نشانگرها کم بودن تعداد آنها و محدود شدن به بافت‏های خاص و مراحل رشدی موجود زنده است، همچنین در مورد آیزوزایم‏ها برای هر آنزیم یک روش رنگ‏آمیزی خاصی بایستی انجام شود که کاربرد این روش‏ها را محدود می‏سازد. بعضی از تغییرات پروتئینی نیز به علت تغییرات پس از ترجمه است نه ناشی از توالی ژنوم و نمی‏توان از این تغییرات به عنوان نشانگر استفاده کرد (چاوالا، 2000).
2-10نشانگرهایDNA
تاکنون انواع مختلف نشانگرهای DNA با تفاوت‏های زیاد از نظر تکنیکی و روش تولید، نحوه کاربرد، امتیازبندی، تجزیه و تحلیل و تفسیر نتایج به سرعت ابداع و معرفی گردیده‏اند. در این نشانگرها توالی خاصی از مولکول DNA به راحتی آشکار شده و توارث آن قابل رؤیت است. این نشانگرها اطلاعات مفیدی را در تعیین خصوصیات منابع ژنتیکی گیاهی، ارزیابی تنوع ژنتیکی و روابط خویشاوندی فراهم می‏آورند.استفاده از این نشانگرهای مولکولی، بر پایه چندشکلی طبیعی در DNA می‏باشد و بدون تردید ابداع و معرفی واکنش زنجیره‏ای پلی‏مراز یا PCR، بیشترین نقش را در توسعه و تکامل نشانگرهای DNA داشته است.نشانگرهای مولکولی مبتنی بر DNA بسته به چگونگی نشان دادن چندشکلی، به دو دسته کلی تقسیم می‏شوند.
الف) نشانگرهای DNA غیر مبتنی بر واکنش زنجیره‏ای پلیمراز
ب- نشانگرهای DNA مبتنی بر واکنش زنجیره‏ای پلیمراز
2-11واکنش زنجیره‏ای پلی‏مراز (PCR)
واکنش PCR تکنیک بسیار قوی و نوینی است که در مدت زمان بسیار کوتاهی تکثیر ردیف منتخب و مورد نظر از مولکول DNA را فراهم می‏سازد (بهار و همکاران، 1385 و باسیل و همکاران، 2006). این فرایند در حقیقت تقلیدی از فرایند همانندسازی DNA در طبیعت است. این تکنیک در سال 1985 به وسیله کری مولیسو همکارانش ابداع شد و اکنون کاربردهای نامحدودی در تمامی حوزهها یافتهاست (نیکولاس، 1996).
این تکنیک ساده امکان ایجاد رونوشتهایی نامحدود از قطعات خاصی از DNA را فراهممینماید. DNA الگوکه PCR روی آن انجام میگیرد، میتواند DNA ژنومی و یا قطعهای از DNA باشد.PCR تقریباً یک میلیون رونوشت از قطعهای کوچک از DNA الگو ایجاد مینماید که این مقدار برای استفاده در هر نوع مطالعه ژنتیکی (ردیف یابی، انتقال ژن، هضم آنزیمی و غیره) کافی است. قبل از انجام PCR لازم است ردیف قطعهای که باید تکثیر شود و یا حداقل ردیف هر دو انتهای آن شناسایی گردد. با استفاده از این ردیفها دو قطعه‏ی چند نوکلئوتیدی که هر یک حدود 20 باز طول دارند طراحی و ساخته میشود که یکی از آنها مکمل پایانهʹ3یکی از رشتههای قطعهای است که تکثیر خواهد شد و دیگری نیز مکمل پایانهʹ3 رشته دیگر میباشد. از آنجاییکه وجود این دو قطعه‏ی چند نوکلئوتیدی برای شروع سنتز رشتههای جدید DNA لازم است، آنها را آغازگر مینامند. DNAالگو، آغازگرها، مقداری دیاکسینوکلئوتیدها شامل نوکلئوتیدهای گوانین ((G ، سیتوزین (C)، تیمین (T) و آدنین (A) و مقداریآنزیم DNAپلیمراز در داخل تیوب کوچکی قرارداده میشوند. برای آنکه DNA الگو واسرشته شدهو دو رشته آن از هم جدا شوند، مخلوط مذکور تا حدود 95 درجه سانتیگراد گرم میگردد. کاملاً واضح است که با این وصف آنزیم DNAپلیمراز موجود باید بتواند دماهای بالای این مرحله را تحمل نماید. شکلی از این آنزیم که معمولاً مورد استفاده قرار میگردد، تکپلیمراز است که از باکتریگرمادوست Thermus aquaticus حاصل میگردد. پس از مرحله واسرشتهسازی، دما به حدود60-50 درجه سانتیگراد کاهش داده میشود تا امکان اتصال آغازگرها به ردیفهای مکمل مربوطه فراهم گردد. این مرحله را مرحله جفت شدن میگویند. به محض اتصال آغازگرها، دما به حدود 70 درجهسانتیگراد افزایش داده میشود. این دما برای فعالیت آنزیم تکDNAپلیمراز مناسب است. در این مرحله که مرحله بسطنامیده میشود، آنزیم به انتهایʹ3 هر آغازگر وصل شده و ساخت و بسط رشته جدید را آغاز مینماید. پس از طی زمان کافی برای ساخت رشتههای جدید، مجدداً دما تا95 درجهسانتیگراد افزایش داده میشود و بدین ترتیب چرخهی جدید از واکنش آغاز میگردد و سه مرحله قبلی این بار بر روی DNA دو رشتهای جدید صورت میگیرد و این رشتهها خود به عنوان الگو برای چرخههای بعدی عمل خواهند کرد. طول هر چرخه که چرخه تکثیر نامیده میشود حدود 5 دقیقه است (نیکولاس، 1996).
چرخههای تکثیر معمولاً در ماشینهای PCRکه از نظر طول و دمای هر مرحله در هر چرخه دقیقاً قابل برنامهریزی و کنترل هستند، انجام میگردد. تعداد چرخهها 30 تا 35 بار میباشد. نتیجه این تعداد چرخه بین 230 تا 235 رونوشت از قطعه مورد نظر است که معادل حدود یک میلیون قطعه مشابه میباشد (این مقدار رونوشت فرآوردهPCRنامیدهمیشود). در عمل، این تکثیر نمایی کامل نیست ولی احتمال رسیدن به حداقل یک میلیون بار تکثیر و در نتیجه بدست آوردن یک میکروگرم فرآورده PCR بسیار زیاد است (نیکولاس، 1996).
واکنش زنجیره‏ای پلی‏مراز از زمان شروع، در بسیاری از روش‏های استاندارد زیست‏شناسی مولکولی و بیوتکنولوژی انقلاب ایجاد کرده و باعث تولید نشانگرهای مختلفی از قبیل DAF، STS، RAPD، DFLP، SCAR، RGA، ISA، ISSR، PBR، CAPs، ALPs، RT-PCR، AP-PCR، MP-PCR و SSR شده است از نشانگرهای فوق نشانگرهای RAPDs، RFLPs، AFLPs و SSRs بیشترین استفاده را برای مطالعات تاکسونومیک و تکاملی داشته‏اند (کارپ و همکاران، 1997). از نظر کاربردی نشانگرهای بارز برای استفاده در مطالعات تنوع ژنتیکی، همسانه‏سازی مکانی و اشباع سریع نقشه‏های ژنتیکی مناسب‏اند و در مقابل، نشانگرهای هم‏بارز جهت تهیه و افزایش دقت نقشه‏های عمومی برای یک گونه، نقشه‏یابی مقایسه‏ای بین گونه‏ها، نقشه‏یابی جایگاه‏های صفات کمی(QTLs)، تهیه نقشه‏های ژنی و مطالعات ژنتیک کاربرد بیشتری دارند (دوین، 2003). هر کدام از این نشانگرهای DNA مجموعه‏ای از مزایا و معایب را در نوع وراثت، تکرارپذیری، میزان اطلاعات بدست آمده، میزان پیچیدگی روش و همچنین جنبه‏های اقتصادی از قبیل هزینه و زمان مورد نیاز تا حصول نتیجه نهایی را دارا هستند (راکوکزی، 2004). از این رو لازم است که قبل از کاربرد هر کدام از آنها سودمندی و کارایی نشانگر سنجیده و ارزیابی شود (کومار و فیلیپسکی، 2001). یک نشانگر مناسب بایستی قابل دسترس بوده و تفسیر نتایج آسانی داشته، از تکرارپذیری بالایی برخوردار بوده و وراثت هم‏بارز داشته باشد. همچنین باید فراوانی مناسب در ژنوم، دامنه هتروزیگوسیتی بالایی را نشان دهد (دوین، 2003). از میان انواع نشانگرهای مولکولی، ابتدا نشانگرهای RAPD، AFLP، RFLP و SSRکه عمومی‏تر بوده و از اهمیت بیشتری برخوردارند، بطور مختصر توضیح داده شده و نشانگر ریزماهواره نیز جداگانه و به تفصیل شرح داده خواهد شد.
2-12DNA چند شکل تکثیر شده تصادفی (RAPD)
نشانگر RAPD نخستین‏بار در سال 1990 به طور همزمان ولی به صورت مجزا توسط دو گروه ویلیامز و همکاران و نیز ولش و مک‏کللند به عنوان یکی از روش‏های آشکارسازی چندشکلی ژنتیکی در گیاهان معرفی شدند (ویلیامزو همکاران، 1990). این روش مبتنی بر واکنش زنجیره‏ای پلیمراز با یک آغازگردلخواه الیگونوکلئوتیدی به طول 9 تا 10 باز می‏باشد (ولش و مک‏کللند، 1990 و ویلیامز و همکاران، 1990). که معمولا ردیف بازی آغازگرها به طور قراردادی تعیین می‏گردد و طی واکنش یک تک آغازگر نقاط مکمل خود را بر روی رشته DNA پیدا کرده و به آن متصل می‏شود. چنانچه محل اتصال آغازگرها بر روی دو رشته مقابل، به هم نزدیک باشد (اغلب کمتر از bp2000)، قطعه DNA بین آن دو نقطه طی واکنش زنجیره‏ای پلیمراز تکثیر خواهد شد (لیو، 2004). این آغازگرها دارای 80-60 درصد باز G/C می‏باشند و دمای اتصال نیز برای آن‏ها تا اندازه‏ای پایین می‏باشد. قطعات DNA تکثیر یافته با روش RAPD در سراسر ژنوم توزیع یافته است و می‏تواند توالی‏های منحصر به فرد و تکراری را در بر گیرد (ویلیامز و همکاران، 1990). در RAPD فرآورده‏های واکنش PCR معمولا بر روی ژل آگارز از یکدیگر جدا می‏شوند و بوسیله رنگ‏آمیزی با اتیدیوم بروماید قابل مشاهده خواهند بود. بطور معمول هرآغازگر تکثیر چندین جایگاه مختلف را در DNA ژنومی هدایت خواهد کرد. وجود یا عدم وجود یک باند واحد در ژل‏های RAPD حاصل جهش نقطه‏ای در محل اتصال آغازگرها و اضافه یا حذف شدن در ناحیه بین مکان‏های اتصال آغازگرهاست (لیو، 2004).
از مزایای نشانگر RAPD می‏توان به سادگیروش کار، سرعت بالای کاربرد، هزینه کم، عدم نیاز به اطلاعات اولیه در مورد توالی DNA، عدم قرارگیری تحت تأثیر کیفیت DNA، امکان بررسی همزمان چندین جایگاه و عدم نیاز به کاوشگر و مواد رادیواکتیو اشاره نمود (وولی و همکاران، 2000؛ ویرک و همکاران، 2000 و احمدی‏خواه، 2008).قدرت RAPD در نمایش چندشکلی، نسبتاً بالاست و تقریباً برای هر آغازگر 20-5 باند تولید می‏کند، لذا برای بررسی کل ژنوم لازم است آغازگرهای متعددی استفاده شود (لیو، 2004). همچنین مطالعات نشان داده است که بخش زیادی از نوارهای RAPD در صورتی که در آزمایشات با رعایت دقت لازم تکرار انجام شود دارای تکرارپذیری بالاو نتایجقابل اعتمادی خواهد بود (ویسینگ و همکاران، 2005).
از معایب این روش می‏توان به موارد زیر اشاره نمود: 1- ممکن است که قطعات متفاوتی ازDNA با طول مشابه و یکسان، به عنوان یک جایگاه در نظر گرفته شوند، به همین دلیل نباید در مطالعات RAPD به یک گونه یا مجموعه‏ای از گونه‏های نزدیک محدود شد، 2- به دلیل تکرارپذیری کم ناشی از دمای اتصال پایین، احتمال تکثیر تعداد زیادی محصول بی اهمیت انتخابی وجود دارد، 3- حساسیت زیاد به آلودگی و تغییرات شرایط PCR، 4- به دلیل تکرارپذیری پایین این نشانگر، امتیازدهی باندهای آن تا حدودی اختیاری است و نتایج حاصل از آن برای مطالعات تاکسونومیکی در سطح گونه‏ها و تعیین گونه، قابل تردید است که البته امروزه مشکل اخیر به واسطه تکنیک‏های آزمایشگاهی پیشرفته و روش‏هایجدید امتیازدهی باندها تا حدودی مرتفع شده است. 5- همچنین مطالعات انجام شده نشان می‏دهد که نشانگرهای RAPD در مقایسه با سایر نشانگرها، فاصله ژنتیکی افراد غیر خویشاوند را کمتر از مقدار واقعی نشان می‏دهند (لیو، 2004 و پاول و همکاران، 1996).
از مهم‏ترین کاربردهای نشانگرهای RAPDمی‏توان به مطالعه ژنتیکی، تجزیه و تحلیل مجموعه‏های ژرسم‏پلاسم، ارزیابی روابط فیلوژنی و بررسی ژنتیک افراد، شناسایی نشانگرهای پیوسته با صفات مورد نظر، تکمیل نقشه‏های ژنتیکی، ایجاد نقشه‏های فیزیکی، مکان‏یابی و جداسازی ژن‏ها، شناسایی ارقام و مطالعات ژنتیک جمعیت اشاره نمود (نقوی و همکاران، 1386).
2-13چندشکلی طول قطعات برش یافته (RFLPs)
نخستین بار بوتستین و همکاران در سال 1980 روش RFLP را برای تهیه نقشه لینکاژ ژنتیکی در انسان ارائه دادند. در این روش توالی‏هایی که دارای نسخ کمی در ژنوم هستند، توسط رادیوایزوتوپ‏ها یا با استفاده از روش‏های بیوشیمیایی نشاندار شده و به عنوان کاوشگر جهت شناسایی قطعات متناظر در DNA متعلق به نمونه‏های متعدد مورد استفاده قرار می‏گیرند (بوتستین و همکاران، 1980).
در گذشته با استفاده از آزمون لکه‏گذاری سادرن، قطعات از یکدیگر تفکیک و بررسی می‏شدند ولی در روش‏های جدیدتر، تکنیک‏های مبتنی بر PCR جایگزین آن شده است. اگر توالی‏های اطراف جایگاه مورد نظر شناخته شده باشد، قطعات حاوی ناحیه RFLP توسط PCR تکثیر می‏شوند، در صورتیکه چند شکلی طولی، حاصل موتاسیون‏های حذف و اضافه نسبتاً بزرگ (تقریباً بزرگتر از 100 جفت باز)، چندشکلی بر اساس اندازه حاصل می‏شود، در حالی‏که اگر چند شکلی طولی حاصل جایگزینی نوکلئوتید در محل سایت برش آنزیم باشد، محصول PCR بایستی توسط یک آنزیم برشی، برش داده شود تا چندشکلی RFLP بدست آید (لیو، 2004).
از مهمترین مزایای نشانگرهای RFLP این است که این نشانگر، ماهیت وراثت هم‏بارز داشته و از تکرارپذیری و دقت بالا و فراوانی مناسبی برخوردار است. راحتی تفسیر نتایج و امتیازدهی آسان باندها به دلیل تفاوت زیاد اندازه قطعات، از دیگر مزایای این نشانگر محسوب می‏شود (لیو، 2004).
تکنیک RFLP در موارد شناسایی ارقام، تهیه نقشه‏های ژنتیکی، ارزیابی ذخایر ژنتیکی و گزینش غیر مستقیم به کمک نشانگر استفاده می‏شود و هنوز هم با وجود معایبی چون گران بودن، زمان‏بر بودن، نیاز به مقدار نسبتاً زیاد DNA، نشان دادن آلل‏های مشابه در گونه‏های بسیار نزدیک و مهم‏تر از همه، سطح پایین چندشکلی ایجاد شده نسبت به پیچیدگی روش، که باعث محدودیت استفاده از آن می‏شود، از قدرتمندترین و معتبرترین نشانگرهای DNA محسوب می‏شود (لیو، 2004 و تستولین و همکاران، 2004).
2-14چندشکلی طول قطعات تکثیر شده(AFLP)
نشانگر AFLP، تکنیکی مبتنی بر واکنش زنجیره‏ای پلیمراز است که توسط ووس و همکاران معرفی گردید و به نظر می‏رسد بسیاری از محدودیت‏های نشانگرهای پیشین را ندارد (ووس و همکاران، 1995). این نشانگر ترکیبی از روش‏های RFLP و PCR است که قطعات برش یافته توسط آنزیم‏های برشی را به صورت تصادفی تکثیر می‏کند. در این روش پس از اتصالسازگارسازها به انتهای قطعات برش خورده، آغازگرهایی تکثیر را شروع می‏کنند که همولوگ با دنباله‏های مذکور ‏‏باشند. افزودن نوکلئوتیدهای دلخواه به انتهای ʹ3 آغازگرها سبب انتخابی بودن تکثیر می‏شود که علاوه بر انتخابی کردن آغازگر، باعث کاهش پیچیدگی فرآورده‏های حاصل نیز می‏گردد (ووس و همکاران، 1995). در واقع اساس این روش تکثیر انتخابی برخی قطعه‏ها از بین تمام قطعه‏های هضم شده DNA است و سه مرحله مجزا را شامل می‏شود: الف) هضم DNA با دوآنزیم برشی متفاوت و اتصال قطعات حاصله به سازگارسازهای الیگونوکلئوتیدی مناسب، ب) تکثیر اولیه تمامی قطعات DNA حاصل از برش و در ادامه، تکثیر انتخابی دسته‏ای از آن‏ها و ج) جداسازی قطعه‏های حاصل از تکثیر انتخابی بر روی ژل‏های توالی‏یابی و مشاهده آن‏ها با استفاده از رنگ‏آمیزی نیترات نقره. هر یک از این قطعه‏ها که به صورت باندی بر روی ژن ظاهر می‏شوند، می‏توانند به عنوان یک نشانگر ژنتیکی مورد استفاده قرار گیرند. تعداد قطعه‏هایی که با این روش مشاهده می‏شوند، به دقت و توانمندی روش‏های الکتروفورز و تعداد نوکلئوتید اضافه شده به انتهای آغازگر بستگی دارد. معمولاً در این روش حدود 50 تا 10 قطعه حاصل از هضم تکثیر شده و با استفاده از ژل پلی‏اکریل‏آمید واسرشته‏ساز ثبت می‏شوند (نقوی و همکاران، 1386).
امکان بررسی همزمان چندین مکان ژنی، عدم نیاز به اطلاعات اولیه جهت طراحی آغازگر، عدم حساسیت به غلظت DNA الگو، ظرفیت بررسی کل ژنوم برای نمایان ساختن چندشکلی، تولید تعداد زیاد نوار تکرارپذیر در مدت زمان کوتاه و صرفه اقتصادی نسبی به ازای هر نشانگر از مزایای این روش محسوب می‏شود (پجیک و همکاران، 1998؛ ساسانوما و همکاران، 2002 و ووس و همکاران، 1995). اگرچه هم‏اکنون مجموعه نرم‏افزارهایی برای امتیازدهی باندهای AFLP به صورت هم‏بارز، موجود است ولی چون نشانگرهای AFLP توارث بارز دارند در برخی مطالعات از جمله مطالعات ژنتیک جمعیت، امتیازدهی هم‏بارز نشانگرهای AFLP مشکل است (دوین، 2003 و لیو، 2004). علاوه بر این پیچیدگی نسبی کاربرد آن‏ها در مقایسه با سایر روش‏های مبتنی بر PCR، عدم اطلاع از جایگاه ژنی نشانگرها، عدم امکان تشخیص آلل‏های هر نشانگر و در نهایت تکثیر قطعات غیر واقعی DNA در مواردی موجب کاهش استفاده از این نشانگر شده است (لیو، 2004).
2-15چندشکلیهای تک نوکلئوتیدی(SNP)
نشانگرهای SNPجدیدترین نشانگرهای وابسته به DNA بوده و به عنوان نشانگر ژنتیکی دو آللی شناخته می‏شوند. این نشانگرها مبتنی بر تفاوتهای مربوط به تک جفت بازها میباشند و در مقایسه با SSR کمتر تحت تأثیر موتاسیون قرار می‏گیرند. یک SNP وضعیتی است که درآن دو باز با فراوانی محسوسی جایگزین هم شده باشند..SNPرا می توان به روشهای متعددی تشخیص داد اما یک فناوری نسبتاً جدید در این رابطه، استفاده از ریزآرایههایDNAمیباشد. این فناوری را میتوان برای بررسی تعداد زیادی نمونه و درحداقل زمان بهکار برد (نیکولاس، 1996). ریزآرایهها قطعات DNAمربوط به هزاران ژن هستند که بر روی یک ماده زمینهای کوچک مرتب شدهاند. این ریزآرایههاcDNA (DNA تک رشتهای که از روی RNAنسخه برداری شده است) نشاندار شده حاصل از یک بافت برگزیده را کاوش میکنند.چنین نشانگرهایی را می‏توان در نقشه‏یابی فیزیکی و ژنتیکی و هم‏چنین در انتخاب همسانه‏های BAC به منظور بررسی توالی کامل ژن‏ها بکار برد (مونتالدو و مزا، 1998).
2-16موقعیت توالی نشان‏دار(STS)STS یک ردیف منحصر به فرد و با موقعیت کروموزومی معین میباشد. از آنها اغلب برای تلفیق اطلاعات نقشهیابی حاصل از آزمایشگاههای مختلف بهره میگیرند. یک STS معمولا 200 تا 400 جفت باز طول دارد و از طریق PCR قابل تکثیر میباشد. ریزماهوارهها نمونههایی از یکSTS میباشند (مونتالدو و مزا، 1998).
2-17ردیف‏های بیان شده نشان‏‏دار(EST)ترکیب DNA پستانداران بسیار تکرارشونده است، به طوریکه ممکن است ارائه یک STS بسیار وقتگیر باشد. یک روش برای افزایش شانس جداسازی یک STS منحصر به فرد استفاده از ردیفهای بیان شده نشاندار یا ESTمیباشد. برای تولید یک EST ابتدا از روی RNA پیامبرcDNAتولید میشود. آنگاه 200 تا 400 جفت باز مربوط به پایانههای cDNA مذکور ردیف‏یابی میگردند. اینها همان EST میباشند. هر چه mRNA از ردیفهای تکراری عاریتر باشد، احتمال انحصاری بودن EST بیشتر است (مونتالدو و مزا، 1998).
2-18تعداد متغیر تکرارهای متوالی(VNTR)علیرغم آنکه تعویض، حذف یا درجبازها بخش بسیار مهمی از تفاوتهای ژنتیکی بین آللها وافراد هستند، ولی تنها نوع تفاوتهای ژنتیکی نمیباشند.
نوع مهم دیگری از تفاوتهای ژنتیکی تفاوت در تعداد تکرارهای متوالی درDNA تکرارشونده میباشد.
دو نوعDNA تکرارشونده شامل DNA تکرارشونده پراکنده و متوالی وجود دارد (نیکولاس، 1996).
نوع پراکنده را از نظر اندازه واحد تکرارشونده تقسیم بندی مینمایند. واحدهای بلندتر را عناصر پراکنده بلند(LINE) مینامند که بهطور نمونه بیش از 1000 باز طول دارند. اشکال کوتاهتر را عناصر پراکنده کوتاه(SINE) مینامند که معمولا از 1500 باز کوتاهترند. بطور نمونه LINEها حدود 10 هزار بار در ژنوم روی میدهند در حالیکه SINEها حدود 100 هزار بار رخ میدهند. مجموع این دو 20 درصد



قیمت: 11200 تومان

Leave a Reply

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *