رابطه¬ی بین چند¬شکلی ژن هورمون رشد و گیرنده¬ی آن با عملکرد تولیدی و تولید مثلی در گاوهای هلشتاین

دانشکده کشاورزی
بخش علوم دامی
پایا‌ن‌نامه کارشناسی ارشد در رشتهی علوم دامی گرایش اصلاح دام
رابطهی بین چندشکلی ژن هورمون رشد و گیرندهی آن با عملکرد تولیدی و تولید مثلی در گاوهای هلشتاین
به کوشش
زینب هادی
استاد راهنما
دکتر هادی آتشی
استادان مشاور
دکتر محمد دادپسند
دکتر عبداله درخشنده
بهار 1393

به نام خدا
اظهارنامه
اینجانب زینب هادی (901259) دانشجوی رشتهی علوم دامی گرایش اصلاح دام دانشکدهی کشاورزی متعهد میشوم که مطالب مندرج در این پایاننامه حاصل کار پژوهشی اینجانب است و به دستاوردهای پژوهشی دیگران که در این پژوهش از آنها استفاده شده است، مطابق مقررات ارجاع و در فهرست منابع ذکر گردیده است. این پایاننامه قبلاً برای احراز هیچ مدرک هم سطح یا بالاتر ارائه نشده است. تعهد می نمایم که بدون مجوز دانشگاه دستاوردهای آن را منتشرننموده و یا در اختیار غیر قرار ندهم. کلیه حقوق این اثر مطابق با آیین نامه مالکیت فکری و معنوی متعلق به دانشگاه شیراز است.
نام و نام خانوادگی: زینب هادی
تاریخ و امضا: 18/3/1393

تقـدیم به
پدر و مادر مهربانم
خواهر و دوبرادر دلسوزم
و
همه بزرگوارانی
که به من
فاصله خرد و دانش را آموختند.
سپاسگزاری
حمد و سپاس پروردگار مهربانم که گستره لطفش انتهایی ندارد.
سپاس خداوند را که شادی و آرامش را با حضور پدر و مادری مهربان و خواهر و دوبرادر دلسوز به من هدیه داد.
سپاسگزارم از دکتر آتشی، استاد راهنمای محترم که در تمامی مراحل مختلف پایاننامه نسبت به اشتباهات اینجانب نهایت سعه صدر را مبذول داشتند.
متشکرم از استاد مشاور دکتر دادپسند که با حسن خلق، مرا رهین منت خویش ساختند.
سپاسگزارم از دکتر درخشنده بابت کمکهای بیدریغشان در مراحل مختلف پایان نامه.
و سپاسگزارم:
از اساتید محترم بخش بابت مشاوره و راهنمایی اینجانب در طول تحصیل.
از کارمندان و پرسنل گروه علوم دامی.
از تمامی همکلاسی هایم که آشنایی و همراهیشان برای من تجربه ای تکرار نشدنی بود.
واز جناب دکتر قهرمانی که لطف بی دریغشان همیشه شامل حالم بود.
این پژوهش با همکاری قطب علمی مطالعات تولیدمثل در گاو شیری پر تولید دانشکده دامپزشکی دانشگاه شیراز انجام شد. مراتب سپاس خود را بابت این همکاری تقدیم مینمایم.
امید که پیوسته شادمان باشند، آسوده خاطر و آرام.
چکیده
رابطهی بین چندشکلی ژن هورمون رشد و گیرندهی آن با عملکرد تولیدی و تولید مثلی در گاوهای هلشتاین
به کوشش
زینب هادی
هدف این پژوهش بررسی همراهی چند ریختی جایگاه 5 ژن هورمون رشد و چندریختی جایگاه 10 ژن گیرندهی هورمون رشد، با صفات تولیدی و تولید مثلی در گاوهای هلشتاین بود. در این پژوهش از 130 گاو هلشتاین خونگیری شد و سپس DNA ژنومیک آنها با استفاده از کیت استخراج DNA شرکت ژن فنآوران استخراج شد. ژنهای مورد مطالعه، با استفاده از پرایمرهای اختصاصی و با واکنشهای زنجیرهای پلیمراز تکثیر شدند. برای تعیین ژنوتیپ در دو ژن، آنزیم محدود کنندهی AluI استفاده شد، و سپس نمونهها روی ژل 5/2 درصد آگارز الکتروفورز شدند. واکاوی همراهی چندریختیها و صفات تولیدی و تولید مثلی با استفاده از نرمافزار SAS انجام شد. دادههای صفات پیوسته با رویهی MIXEDو دادههای صفات گسسته با رویهی GENMOD واکاوی شدند. مقایسهی میانگین با روش میانگین حداقل مربعات در سطح معنی داری 5 درصد انجام شد. چندریختی AluI در جایگاه 5 ژن هورمون رشد با سختزایی همراهی معنیدار داشت، اما با دیگر صفات همراهی نداشت. چندریختی AluI در جایگاه 10 ژن گیرندهی هورمون رشد با صفات تولید شیر و صفات تولیدمثلی همراهی نداشت.
کلیدواژهها: آنزیم محدود کنندهیAluI، ژن گیرندهی هورمن رشد، ژن هورمن رشد، گاو هلشتاین
فهرست مطالب
عنوانصفحه
فصل اول: مقدمه2
فصل دوم: مروری بر پژوهشهای انجام شده
2-1- هورمون رشد 6
2-1-1- ژن هورمون رشد8
2-1-2- چندریختیهای RFLP شناسایی شده در ژن هورمون رشد8
2-1-3- همراهی چندریختیهای ژن هورمون رشد و صفات تولیدی و تولیدمثلی9
2-2- گیرندهی هورمون رشد11
2-2-1- فرآیند انتقال پیام توسط گیرندهی هورمون رشد 12
2-2-2- ژن گیرندهی هورمون رشد 12
2-2-3- چندریختیهای ژن گیرندهی هورمون رشد 13
2-2-4- همراهی چندریختیهای ژن گیرندهی هورمون رشد و صفات تولیدی و تولید
مثلی14
فصل سوم: مواد و روش ها
3-1- محل اجرای پژوهش 17
3-2- استخراج DNA 17
عنوانصفحه
3-3- بررسی کمیت و کیفیت استخراج19
3-3-1- الکتروفورز DNAی استخراج شده روی ژل آگارز یک درصد19
3-3-2- تهیهی بافر TAE 50X20
3-3-3- تهیهی بافر TAE 1X20
3-4- واکنشهای زنجیره پلیمراز (PCR)20
3-4-1- ژن هورمون رشد20
3-4-2- ژن گیرندهی هورمون رشد22
3-5- هضم محصولات PCR با آنزیمهای برشی24
3-6- واکاوی همراهی چندریختیها و صفات تولیدی و تولیدمثلی25
فصل چهارم: یافتهها
4-1- DNA ژنومیک28
4-2- فرآوردههای واکنشهای PCR ژنهای هورمون رشد و گیرندهی آن29
4-3- هضم محصولات PCR با آنزیمهای برشی29
4-3-1- هضم محصولات PCR جایگاه 5 ژن هورمون رشد با آنزیم برشی AluI29
4-3-2- فراوانیهای اللی و ژنوتیپی در جایگاه 5 ژن هورمون رشد29
4-3-3- واکاوی همراهی ژنوتیپهای جایگاه 5 ژن هورمون رشد با صفات تولیدی
و تولیدمثلی.31
4-3-4- هضم محصولات PCR جایگاه 10 ژن گیرندهی هورمون رشد با آنزیم برشی
AluI32
4-3-5- فراوانی اللی و ژنوتیپی در جایگاه 10 ژن گیرندهی هورمون رشد33
عنوانصفحه
4-3-6- واکاوی همراهی ژنوتیپهای جایگاه 10 ژن گیرندهی هورمون رشد با صفات
تولیدی وتولیدمثلی34
فصل پنجم: بحث
بحث 37
فهرست منابع و مآخذ
منابع انگلیسی 41
فهرست جدول‌ها
عنوانصفحه
جدول 3-1- آغازگرهای استفاده شده در ازدیاد ژن هورمون رشد21
جدول 3-2- مواد استفاده شده در هر واکنش PCR در ازدیاد ژن هورمون رشد .21
جدول 3-3- چرخهی گرمایی استفاده شده در ازدیاد ژن هورمون رشد21
جدول 3-4- آغازگرهای استفاده شده در ازدیاد ژن گیرندهی هورمون رشد22
جدول 3-5- مواد استفاده شده در هر واکنش PCR در ازدیاد ژن گیرندهی هورمون رشد22
جدول 3-6- چرخهی گرمایی استفاده شده در ازدیاد ژن گیرندهی هورمون رشد23
جدول 3-7- ترکیبهای لازم برای هضم آنزیمی در هر واکنش هضم24
جدول 4-1- فراوانی اللی و ژنوتیپی ژن هورمون رشد30
جدول 4-2- میانگین و انحراف معیار دادههای صفات تولیدی و تولیدمثلی31
جدول 4-3- همراهی ژنوتیپهای جایگاه 5 ژن هورمون رشد با صفات چنددستهای31
جدول4-4- میانگین حداقل مربعات (خطای استاندارد) همراهی ژنوتیپهای جایگاه 5 ژن هورمون رشد با صفات پیوسته32
جدول 4-5- اثر جایگزینی آللهای جایگاه 5 ژن هورمون رشد بر صفات پیوسته32
جدول 4-6- فراوانی اللی و ژنوتیپی ژن گیرندهی هورمون رشد33
جدول 4-7-همراهی ژنوتیپهای جایگاه 10 ژن گیرندهی هورمون رشد با صفات چند دستهای34
عنوانصفحه
جدول 4-8- میانگین حداقل مربعات (خطای استاندارد) همراهی ژنوتیپهای جایگاه 10ژن گیرندهی هورمون رشد با صفات پیوسته…………………………………………………………………………………….34
جدول4-9- اثر جایگزینی آللهای جایگاه 10 ژن گیرندهی هورمون رشد بر صفات پیوسته35
فهرست نگاره‌ها
عنوانصفحه
نگارهی 4-1- الکتروفورز چند نمونه از DNA ژنومیک استخراج شده 28
نگارهی 4-2- فرآوردههای PCR در ازدیاد ژن هورمون رشد و گیرندهی آن29
نگارهی 4-3- ژنوتیپهای جایگاه 5 ژن هورمون رشد30
نگارهی 4-4- ژنوتیپهای جایگاه 10 ژن گیرندهی هورمون رشد33
فصل اولمقدمهتولید و تولید مثل از مهمترین سازههای موثر بر بهرهوری و سودآوری در صنعت پرورش گاو شیری هستند (Meadows et al., 2005)، و تحت تاثیر ژنتیک و سازههای محیطی گوناگون قرار دارند (Berglund, 2008). تغذیه، بهداشت و شرایط اقلیمی از مهمترین سازههای محیطی موثر بر راندمان تولید و تولید مثل هستند (West, 2003; Tamminga and Kemp, 2005; Fulwider et al., 2007). ژنها با رمز کردن پروتئینها بر عملکرد تاثیر دارند. از جمله پروتئینهای موثر بر تولید و تولیدمثل میتوان به هورمونها اشاره کرد. هورمونها مواد بیوشیمیایی هستند که با اثر بر سلولهای گوناگون بدن باعث بروز فرآیندهای فیزیولوژیک میشوند (Sperelakis, 2001). هورمون رشد، تیروکسین، استروژن، پرولاکتین و پروژسترون از مهمترین هورمونهای موثر بر تولید شیر و باروری هستند (Travers et al., 1996; Lammers et al., 1999; Bonczek et al., 1988 (Anderson et al., 2003 . تغییر در توالی ژنهای رمز کنندهی این هورمونها میتواند بر مقدار تراوش و ساختار این هورمونها تاثیر بگذارد، و در نتیجه بر بروز صفات تاثیر داشته باشند.بهبود راندمان تولید و تولید مثل در روشهای انتخاب کلاسیک، محدودیتهایی دارد. از یک سو گردآوری رکوردهای صفات تولید شیر و باروری تنها پس از نخستین زایش، شدنی است؛ و از سوی دیگر وراثتپذیری صفات تولید مثلی پایین است. با پیشرفت و توسعهی روشهای ژنتیک مولکولی، شناسایی ژنهای موثر بر تولید و تولید مثل امکانپذیر شده است (Jiang and Ott, 2010)، بنابراین، با شناسایی ژنهای موثر بر صفات و استفاده از روش انتخاب به کمک نشانگرها میتوان در گامههای آغازین زندگی، حیوانهای برتر را شناسایی کرد، وکارایی برنامـــههای اصلاح نژادی را افزایش داد (Lande and Thompson, 1990). هورمون رشد یک هورمون پروتئینی است، و پژوهشها نشان دادهاند که بر تولید شیر و باروری تاثیر دارد؛ بنابراین، میتوان از ژن هورمون رشد به عنوان یک ژن کاندیدا در برنامههای اصلاح نژادی استفاده کرد. هورمون رشد در هیپوفیز پیشین ساخته میشود، و در رشد پس از تولد نقش دارد (Butler and Roith, 2001). پژوهشها نشان دادهاند که تزریق هورمون رشد باعث افزایش تولید شیر در گاو و بز میشود (Knight et al., 1992; Chaiyabutr et al., 2005). درگلههای گاو شیری، استفاده از هورمون رشد گاوی نوترکیب(rbGH)، تداوم شیردهی و مقدار شیر در گامهی اوج را افزایش داد Etherton and Bauman, 1998; Capuco et al., 2003)). غلظت هورمون رشد در سرم خون گاوهای پر شیر نسبت به گاوهای کم شیر بیشتر است (Lucy et al., 2009)، و نشان داده شده است که در یک دورهی شیردهی، تولید شیر با غلظت هورمون رشد خون همبستگی دارد (Bell, 1995)
هورمون رشد هدایت مواد مغذی به سمت سلولهای پستان را افزایش میدهد و باعث تولید شیر میشود (Etherton and Bauman, 1998). به دیگر سخن، هورمون رشد از یک سو باعث کاهش جذب گلوکز در سلولهای ماهیچهی اسکلتی و بافت چربی و همچنین کاهش حساسیت سلولها به انسولین میشود، و از سوی دیگر جذب گلوکز توسط سلولهای پستان را افزایش میدهد؛ در نتیجه گلوکز بیشتری برای سنتز لاکتوز در اختیار سلولهای پستان قرار میگیرد (Sechen et al., 1990; Faulkner, 1999; Drackley et al., 2006). با افزایش سنتز لاکتوز، فشار اسمزی در سلولهای پستانی بیشتر میشود و در پی آن حجم شیر افزایش مییابد (McManaman and Neville, 2003). اثر هورمون رشد بر تولید مثل توسط پژوهشگران زیادی بررسی شده است. در موشهای تراریخت که در ژن گیرندهی هورمون رشد آنها جهش مصنوعی ایجاد شده بود، و گیرندهی آنها دچار نقص شده بود، کاهش پاسخ تخمدان به گونادوتروپینها، کاهش شمار فولیکولها پیش از تخمکریزی، و کاهش شمار فرزندان در هر زایش دیده شد؛ و حتا با تزریق هورمون رشد شبه انسولین نیز برطرف نشد، که نشاندهندهی اثر مستقیم هورمون رشد بر تخمدان و فولیکولها است (Bachelot et al., 2002). با تزریق هورمون رشد به گاوهای دهندهی تخمک، و سپس تلقیح آنها، شمار سلولهای تخم که به گامهی بلاستوسیست رسیدند، افزایش یافت (Moreira et al., 2002a). از سوی دیگر، افزودن این هورمون به محیط کشت در لقاح برون تنی (IVF)، سلول تخم با سرعت بیشتری به گامهی بلاستوسیست رسید (Moreira et al., 2002a; Moreira et al., 2002b).چند جهش در ژنهای هورمون رشد و گیرندهی آن شناسایی شده است (Falaki et al., 1996; Aggrey et al., 1999)، این جهشها ممکن است، توالی اسیدهای آمینه هورمونهای رمز شده توسط این ژنها را تغییر دهند، و در نتیجه بر میزان تاثیر این هورمونها بر سلولهای هدف و به دنبال آن بر بروز صفات تاثیر داشته باشند.
هدف پژوهش
هدف این پژوهش، بررسی چندریختی در ژنهای هورمون رشد و گیرندهی آن و همراهی آنها با صفات تولیدی و تولیدمثلی در یک نمونه از گاوهای هلشتاین است.
فصل دوّم
پیشینهی پژوهش2-1- هورمون رشد
در دههی 1920 مشخص شد که عصارهی بدست آمده از هیپوفیز گاو باعث تحریک رشد در موش میشود؛ این عصاره را هورمون رشد یا سوماتوتروپین نامیدند (Evans and Long, 1921). پژوهشهای بعدی نشان داد که این هورمون باعث افزایش تولید شیر در بزهای شیری نیز میشود (Asdell, 1932). آسیموف و کروز (Asimov and Krouze, 1937) نشان دادند که مصرف عصارهی هیپوفیز در گاوهای شیری تولید شیر را افزایش می دهد. فالی و یانگ (Folley and Young, 1938) نشان دادند که با تزریق عصارهی استخراج شده از هیپوفیز گاوهای کشتار شده به گاوهای شیرده، تولید شیر افزایش مییابد. هورمون رشد در سال 1945 برای نخستین بار از غدهی هیپوفیز موش صحرایی استخراج شد (Li et al., 1945) با تزریق هورمون رشد، تجزیهی چربی در بافت چربی افزایش (Davidson, 1987)، و سنتز اسیدهای چرب کاهش مییابد (Walton and Etherton, 1986). هورمون رشد همچنین باعث افزایش سنتز چربی (Forsyth, 1986)، تولید لاکتوز و کازیین (Skarda et al., 1982) و کاهش تجزیهی پروتئینها در بافت پستان میشود (Eisemann et al., 1986)، با افزایش ساخت چربی، پروتئین و لاکتوز در بافت پستان (Bauman and Bruce Currie, 1980)، حجم شیری که به آلویولها تراوش میشود، افزایش مییابد. هورمون رشد باعث افزایش تولید آنزیمهای کلیدی در سنتز شیر مانند استیل کوآنزیم آ کربوکسیلاز، استیل کوآنزیم آ سنتتاز (Knight et al., 1990; Baldwin and Knapp, 1993) و افزایش mRNA بتاکازین در سلولهای بافت پستانی گاو میشود (Yang et al., 2005). با تزریق هورمون رشد به گاوهای شیرده، بافت پارانشیم و سلولهای پستانی (Sejrsen et al., 1986) و در تلیسهها رشد غدههای پستان افزایش مییابد (Bauman, 1992). در گامهی رشد و نمو غدههای پستان، هورمون رشد نقش مهمی در افزایش رشد طولی مجراها و تمایز سلولهای اپیتلیال برای تبدیل شدن به جوانهی انتهایی ایفا میکند (Coleman et al., 1988). گیرندهی هورمون رشد در بافت سلولهای بزرگ جسم زرد (Lucy, 1993a)، فولیکولهای اولیهی پیش و پس از توّلد، اووسیت اولیهی گاو بالغ (Kölle et al., 1998)، سلولهای گرانولوزا، سلولهای کومولوس و اووسیت (Zhao et al., 2002) دیده شده است. پژوهشها نشان دادهاند که در تخمدان بیشتر گونهها از جمله موش صحرایی (Zhao et al., 2002)، انسان (Sharara and Giudice, 1997)، گاو (Kölle et al., 1998) و گوسفند (Eckery et al., 1997) گیرندهی هورمون رشد وجود دارد. پژوهشها نشان دادهاند که تزریق هورمون رشد، پیش از تلقیح، نرخ گیرایی و آبستنی در گاو را افزایش میدهد (Starbuck et al., 2006; Flores et al., 2007). همچنین، با تزریق این هورمون به گاوهای شیری در دورهی پس از زایش، اندازهی فولیکول غالب در گاوهای آنستروس و شمار فولیکولهای کلاس 2 و 3 بیشتر شد (Flores et al., 2007; De La Sota et al., 1993). هورمون رشد استرویدسازی و گامتسازی را افزایش میدهد (Sharara and Giudice, 1997). این هورمون بر حساسیت سلولها به هورمون LH نیز تاثیر دارد. در موشهای صحرایی که کمبود هورمون رشد داشتند و گاوهای شیری که دچار نقص در گیرندهی هورمون رشد (GHRD) بودند، کاهش بیان گیرندهی LH و کاهش پاسخ به LH گزارش شده است (Chase et al., 1998; Liu et al., 1998). در فرآیند بلوغ آزمایشگاهی اووسیت (IVM)، هورمون رشد، سرعت بلوغ هسته و سرعت تشکیل بلاستوسیست را افزایش داد (Izadyar et al., 1997). یکی از اثرهای بیولوژیک هورمون رشد، تحریک ساخت فاکتور رشد شبه انسولین-1 (IGF-I) است (Argetsinger and Carter-Su, 1996). با افزایش غلظت فاکتور رشد شبه انسولین-1 در خون، این ماده با انسولین جهت اتصال به گیرندهی انسولین رقابت میکند، و گیرندههای انسولین در سطح سلولهای محیطی را اشغال میکند (Zapf et al., 1986)؛ در نتیجه حساسیت سلول به انسولین کاهش مییابد، گلوکز جذب سلولها نمیشود، و برای تولید شیر در اختیار سلولهای پستان قرار میگیرد. فاکتور رشد شبه انسولین-1 باعث افزایش دسترسی پیشسازهای تولید شیر در غدهی پستان میشود (McBride et al., 1988)، ظرفیت تولید سلولهای تراوشی را افزایش میدهد و با کاهش سرعت پسروی سلولهای پستان، تداوم شیردهی را افزایش میدهد (Gallo and Block, 1990). هورمون رشد به خانوادهی هورمونهای لاکتوژنیک تعلق دارد، که شامل لاکتوژن و لاکتوژن جفتی است (Arkins et al., 1993). هورمون رشد یک پلیپپتید تکزنجیرهای با 190-191 اسید آمینه و وزن مولکولی 22 کیلو دالتون است (Wallis, 1973). هورمون آزاد کنندهی هورمون رشد و گرلین تراوش هورمون رشد را افزایش و سوماتواستاتین تراوش آن را کاهش میدهد (Kazmer et al., 2000; Shingu et al., 2004; Dimaraki and Jaffe, 2006;).2-1-1- ژن هورمون رشد
ژن هورمون رشد روی بازوی بلند (q) کروموزوم 19 گاو قرار دارد (Hediger et al., 1990). این ژن 1793 جفت باز، 4 اینترون و 5 اگزون دارد (Gordon et al., 1983).2-1-2- چندریختیهای RFLP شناسایی شده در ژن هورمون رشد
جابهجایی، حذف یا اضافه شدن نوکلئوتیدها توسط برخی از آنزیمهای محدود کننده قابل شناسایی هستند. با شناسایی محل برش این آنزیمها در مولکولهای DNA، قطعات DNA با طولهای متفاوت ایجاد میشود که به آنها چندریختی در طول قطعات برشی یاRFLP گویند (Botstein et al., 1980). در نوکلئوتید شمارهی 2141 از اگزون شمارهی 5 ژن هورمون رشد، یک جهش شناسایی شده است، که در آن نوکلئوتید دارای باز گوانین جایگزین نوکلئوتید دارای باز سیتوزین شده است، و در پی آن در اسید آمینه شماره 127 هورمون رشد، اسید آمینهی والین جایگزین اسید آمینهی لوسین میشود. این جهش، یک ناحیهی برشی برای آنزیم برشی AluI (گرفته شده از باکتری Arthrobacter luteus) ایجاد میکند (Lucy et al., 1991). جهش دیگر، در نوکلئوتید شمارهی 2291 شناسایی شده است، که در آن نوکلئوتید دارای باز سیتوزین جایگزین نوکلئوتید دارای باز آدنین میشود، اما چون هر دو کدون، اسید آمینهی آرژنین را رمز میکنند، در پروتئین حاصل تغییر ایجاد نمیشود. این جهش با آنزیم برشی DdeI (گرفته شده از باکتری Desulfovibrio desulfuricans) قابل شناسایی است (Yao et al., 1996). یک جهش در نوکلئوتید شمارهی 1547 در اینترون شمارهی 3 شناسایی شده است که ناحیهی برشی برای آنزیم MspI (گرفته شده از باکتریMoraxella sp.) ایجاد میکند. در این جهش نوکلئوتید دارای باز تیمین با نوکلئوتید دارای باز سیتوزین جایگزین شده است (Zhang et al., 1993).
2-1-3- همراهی چندریختیهای ژن هورمون رشد با صفات تولیدی و تولید مثلی
همراهی برخی چندریختیهای ژن هورمون رشد با صفات تولیدی و تولید مثلی در چندین پژوهش بررسی شده است. پژوهشها نشان دادهاند که چندریختی MspI در اینترون 3 با تولید چربی، تولید شیر و رشد بیضهها همراهی معنیدار دارد (Høj et al., 1993; Unanian et al., 2002; Yao et al., 1996). در یک پژوهش همراهی چندریختی HaeIII (گرفته شده از باکتری Haemophilus aegyptius.) با ضخامت چربی پشت در گاو گوشتی معنیدار گزارش شد (Suguisawa et al., 2006). چند ریختی AluI در اگزون 5 ژن هورمون رشد با جایگزین شدن نوکلئوتید دارای باز گوانین با نوکلئوتید دارای سیتوزین در نوکلئوتید شماره 2141 ایجاد شده است، و در پی آن در اسید آمینه 127 هورمون رشد، اسید آمینهی والین جایگزین اسید آمینهی لوسین میشود. بنابراین، این چند ریختی دارای دو الل لوسین (L) و والین (V) است. سورنسن و همکاران (Sørensen et al., 2002) نشان دادند که بین چند ریختی AluI با آزادسازی هورمون رشد همراهی وجود دارد، به گونهای که در گوسالههای با ژنوتیپهای LL و LV آزاد سازی هورمون رشد، بیشتر بود. کیوری و همکاران (Curi et al., 2006) چند ریختی AluI را در نژادهای نلور، کانچیم، آنگوس و سیمنتالبررسی کردند و گزارش کردند که فراوانی الل L در این چهار نژاد به ترتیب 1، 3/93، 2/92 و 7/71 درصد بود؛ و همچنین گاوهای با ژنوتیپ LL وزن لاشه و افزایش وزن روزانهی بیشتری داشتند. گروچوفسکی و همکاران (Grochowska et al., 2001) نشان دادند که بین غلظت هورمون رشد و فاکتور رشد شبه انسولین-1 (IGF-I) با تولید شیر، پروتئین و چربی همراهی وجود دارد. در این پژوهش با بررسی چندریختی AluI مشخص شد که گاوهای دارای الل L نسبت به گاوهای بدون این الل، چربی و پروتئین بیشتری تولید کردند. بالو و همکاران (Balogh et al., 2009) گزارش کردند که چندریختی AluI با تولید شیر، نخستین تخمکگذاری پس از زایش و نمرهی بدنی در ماه اول پس از زایش در گاو هلشتاین همراهی ندارد. برندز و همکاران (Barendse et al., 2006) گزارش کردند که فراوانی آلل L در نژاد آنگوس 77 درصد و در نژاد شورت هورن 76 درصد است. این چندریختی با صفت ماربلینگ گوشت و چربی کپل همراهی معنیدار داشت. همراهی چندریختی AluI در اگزون 5 با تولید شیر در گاوهای هلشتاین نخستین بار توسط لوسی بررسی شد (Lucy, 1993b)، که گزارش کرد گاوهای دارای الل L نسبت به گاوهای دارای الل V شیر بیشتری تولید کردند. شریفلو و همکاران (Shariflou et al., 2000) گزارش کردند گاوهای با ژنوتیپهای LL و LV، شیر، پروتئین و چربی بیشتری تولید کردند، و آلل L نسبت به آلل V غالب بود. خاتمی و همکاران (Khatami et al., 2005) گزارش کردند که چندریختی AluI با تولید شیر و چربی همراهی دارد. در این پژوهش، گاوهای دارای ژنوتیپ LV شیر بیشتری تولید کردند. دیباس و همکاران (Dybus, 2002) نشان دادند که فراوانی آلل L در نژاد هلشتاین 5/81 درصد است، و این چندریختی با تولید شیر در شکم اول همراهی معنیدار دارد؛ به گونهای که تولید شیر، چربی و پروتئین در ژنوتیپ LL بیشترین بود.
2-2- گیرندهی هورمون رشد
هورمون رشد با اثر بر گیرندههای خود در سطح سلول هدف، بر رشد و متابولیسم تاثیر دارد (Lanning and Carter-Su, 2006)، بنابراین، گیرندهی هورمون رشد میانجیگر اثرهای سوماتوژنیک و متابولیک هورمون رشد بر سلول هدف است. گیرندهی هورمون رشد در دستهی یک ابر خانوادهی گیرندههای سایتوکین-هورمون رشد-پرولاکتین قرار دارد. اعضای این خانواده شامل گیرندههای اریتروپویتین، فاکتور محرک کلنی گرانولوسایت، اینترلوکین 2-9-11-12، ترومبوپویتین و فاکتورهای مهار سرطان خون است (Kelly et al., 1991). این نوع گیرنده، دارای بخش خارج سلولی هیدروفوبیک، بخش داخل غشایی و بخش داخل سلولی (سیتوپلاسمی) است (Kelly et al., 1994). در بخش سیتوپلاسمی گیرنده و نزدیک غشای سلولی، یک توالی سرشار از پرولین وجود دارد که به جعبهی یک موسوم است و در همهی گیرندههای این خانواده وجود دارد (Argetsinger and Carter-Su, 1996). آزمایشها نشان دادهاند که وزن مولکولی گیرندهی هورمون رشد 100 تا 130 کیلودالتون است و دارای 620 اسیدآمینه است (Govers et al., 1999). مطالعهی ساختمان کریستالی هورمون رشد نشان داده است که یک مولکول از این هورمون به بخش خارج سلولی گیرندهی خود متصل میشود، و اثر خود بر سلول را اعمال میکند (De Vos et al., 1992; Wells, 1996).
2-2-1- فرآیند انتقال پیام توسط گیرندهی هورمون رشد
مطالعات اولیه در مورد نحوهی پیوند هورمون رشد به بخش خارج سلولی گیرندهی آن نشان داد که هورمون رشد به صورت پیدرپی به دو گیرنده متصل میشود و دایمر تشکیل میدهد. در گذشته، به نظر میرسید که ایجاد ترکیب هورمون-گیرنده برای آغاز انتقال پیام ضروری است (Wells, 1996). با این حال مطالعات جدیدتر نشان دادهاند که گیرندهی هورمون رشد پیش از پیوند هورمون به آن، به صورت دایمر است (Gent et al., 2002; Brown et al., 2005). هورمون رشد دارای دو جایگاه اتصال جداگانه و نامتقارن در دو سمت ساختار خود است، که پیوند این دو نقطه با نقاط اتصال در گیرنده، منجر به یک چرخش در گیرنده میشود (Brown et al., 2005). با چرخش دایمر گیرنده آنزیمهای غیرفعال تایروزین کیناز از خانواده جانوس کیناز 2، که در زیر غشا در بخش سیتوپلاسمی دو گیرنده قرار دارند، فسفریله میشوند (Argetsinger et al., 1993; Argetsinger et al., 2004). جانوس کیناز 2 فعال شده، نقاط فعالی برای جذب فاکتورهای رونویسی مانند STAT5 ایجاد میکند (Herrington et al., 2000). STAT5 فسفریله شده، به عنوان فاکتور رونویسی در بیان ژنهایی که توسط هورمون رشد تنظیم میشوند، عمل میکنند، این فاکتورها در بیان ژن هایی که در فرآیندهای حیاتی مثل تغییرات متابولیکی و رشد دخالت دارند، موثر هستند (Herrington et al., 2000).
2-2-2- ژن گیرندهی هورمون رشد
گیرندهی هورمون رشد در گاو توسط یک ژن روی کروموزوم 20 رمز میشود (Moody et al., 1995). این ژن دارای 9 اگزون در بخش ترجمه شونده و یک بخش ‘5 است که ترجمه نمیشود (5’UTR) است. بخش ‘5 ترجمه ناپذیر نیز 5 اگزون دارد (1A-1I) که به گونهای پیدرپی بهم چسبیده و شروع رونویسی هر کدام بصورت اختصاصی است (Heap et al., 1995; Lucy et al., 1998)
2-2-3 چندریختیهای ژن گیرندهی هورمون رشد
در راهانداز ژن گیرندهی هورمون رشد در فاصله 154-، نوکلئوتید دارای باز آدنین جایگزین نوکلئوتید دارای باز گوانین میشود، که با آنزیم برشی NsiI (گرفته شده از باکتری Neisseria sicca) قابل شناسایی است (Ge et al., 1999). سه جهش در بخش ‘5 ترجمهناپذیر(5’UTR) شناسایی شده است. بدین صورت که، جایگزین شدن نوکلئوتیدی دارای باز آدنین با نوکلئوتیدی دارای باز تیمین برای آنزیم AluI و جایگزین شدن نوکلئوتیدی دارای باز سیتوزین با نوکلئوتیدی دارای باز تیمین برای آنزیمهای AccI (گرفته شده از باکتری Acinetobacter calcoaceticus) و StuI (گرفته شده از باکتری Streptomyces tubercidicus) ناحیهی برشی ایجاد میکند. (Aggrey et al., 1999). چندریختی دیگری نیز در بخش ‘5 ترجمه ناپذیر، گزارش شده است که در آن جابجایی نوکلئوتید دارای باز سیتوزین با نوکلئوتید دارای باز تیمین در دو نقطه بالای راهانداز یک و داخل راه انداز یک ایجاد شده است و به ترتیب با آنزیمهای محدودکنندهی Fnu4HI/Tsel (گرفته شده از باکتری Fusobacterium nucleatum 4H) و Sau961 (گرفته شده از باکتری Staphylococcus aureus PS96) قابل شناسایی هستند (Maj and Zwierzchowski, 2006). در اگزون 10، در فاصلهی 257 جفت باز از نقطهی ‘5، جایگزینی نوکلئوتید دارای باز آدنین با نوکلئوتید دارای باز گوانین برای آنزیم AluI ناحیهی برشی ایجاد کرده است. همچنین گزارش شده است که در فاصلهی 200 جفت باز از نقطهی ‘5 در این اگزون، جایگزینی نوکلئوتید دارای باز آدنین با نوکلئوتید دارای باز گوانین برای آنزیم NarI (گرفته شده از باکتری Nocardia argentinensis) و جایگزینی باز تیمین با باز سیتوزین برای آنزیم MaeI (گرفته شده از باکتری Methanococcus aeolicus PL-15/H) قابل شناسایی است (Ge et al., 2000). جایگزینی در فاصلهی 257 جفت باز از نقطهی ‘5 باعث جایگزین شدن اسید آمینه سرین با گلایسن (S555G) در اسید آمینهی شمارهی 555 بخش داخل سیتوپلاسمی گیرندهی هورمون رشد میشود. در اگزون 8، نوکلئوتید دارای باز تیمین با نوکلئوتید دارای باز آدنین جایگزین میشود، و به دنبال آن در بخش داخل غشایی اسید آمینهی فنیلآلانین که بار آن خنثی است، جایگزین تایروزین قطبی میشود (F279Y) و ناحیهی برشی برای آنزیم VspI (گرفته شده از باکتری Vibrio sp. 343)(Blott et al., 2003) و آنزیم SspI (گرفته شده از باکتری Sphaerotilus sp.) ایجاد میکند (Fontanesi et al., 2007)
2-2-4- همراهی چندریختیهای گیرندهی هورمون رشد و صفات تولیدی و تولیدمثلی
فلکی و همکاران (Falaki et al., 1996) با بررسی چندریختی TaqI در اگزونهای 9 و 10 در گاوهای هلشتاین، نشان دادند که این چندریختی با تولید چربی همراهی دارد. اگری و همکاران (Aggrey et al., 1999) با بررسی چندریختیهای AccI، StuI و AluI در بخش 5′ UTR در گاوهای هلشتاین گزارش کردند که چندریختی AluI با ارزش اصلاحی چربی شیر همراهی معنیدار دارد. مج و همکاران (Maj et al., 2004) گزارش کردند که چندریختیهای NsiI و AccIدر بخش غیر رمزکنندهی گیرندهی هورمون رشد با صفات تولید شیر و ترکیبات شیر همراهی معنیدار دارد. کومیسرک و همکاران (Komisarek et al., 2011) گزارش کردند که همراهی چندریختی VspI در اگزون 8 با درصد چربی، شیر و پروتئین شیر معنی دار است.چند ریختی AluI با جایگزینی باز گوانین با آدنین ایجاد میشود و درپی آن در گیرندهی هورمون رشد، اسید آمینهی سرین جایگزین گلایسین میشود. این تغییر دو آلل A و G ایجاد میکند. دایاس تاسیو و همکاران (Di Stasio et al., 2005) گزراش کردند که چند ریختی AluI در اگزون 10 با صفت افت وزن در گوشت گوسالههای نژاد پایمانتیز رابطه معنی دار دارد. اولنسکی و همکاران (Oleński et al., 2010) گزارش کردند که چندریختی AluI در اگزون 10 با صفات تولید شیر و ترکیبات آن در گاوهای شیری و ارزش اصلاحی گاوهای نر همراهی معنی دار دارد. آلل A برچربی و پروتئین و آلل G بر مقدار تولید شیر موثر بود. کواکس و همکاران (Kovacs et al., 2006) گزارش کردند که چندریختی AluI در اگزون 10 با تولید شیر و فاصلهی زایش در گاوهای هلشتاین همراهی معنی دار ندارد. هاردکا و همکاران (H–ecká et al., 2008) با بررسی چند شکلی AluI در اگزون 10 گزارش کردند که فراوانی آلل A در نژاد هلشتاین1/95 درصد است. بین این چندریختی و ارزش اصلاحی چربی شیر همراهی معنیدار وجود دارد و گاوهای دارای ژنوتیپ GG ارزش اصلاحی کمتری برای چربی شیر نسبت به گاوهایی با ژنوتیپ AA بودند.
فصل سوم

مواد و روشها3-1- محل اجرای پژوهشاین پژوهش با همکاری دو واحد پرورش گاو شیری هلشتاین در استان فارس انجام شد. در این پژوهش، از 130 گاو شیری که دستکم برای یک دورهی شیردهی رکورد تولیدی و تولید مثلی داشتند، با استفاده از ونوجکتهای دارایEDTA خونگیری شد. نمونهها درون یخ قرار داده شدند و در آزمایشگاه مرکزی دانشکده دامپزشکی دانشگاه شیراز، در دمای منفی 20 درجهی سانتیگراد نگهداری شدند. همهی فرآیندهای آزمایشگاهی در آزمایشگاه مرکزی دانشکدهی دامپزشکی انجام شد.
3-2- استخراج DNA
استخراج DNA ژنومیک با استفاده از کیت استخراج DNA شرکت ژن فناوران در چند گامه انجام شد:
1-100 میکرولیتر از نمونهی خون در داخل میکروتیوبهای 5/1 میلیلیتری ریخته شد.
2-400 میکرولیتر مادهی Lysis Reagent به هر نمونه افزوده شد، نمونهها به هم زده شدند تا در ته میکروتیوبها رسوب دیده شود.
3- نمونهها به مدت 5 دقیقه در داخل انکوباتور با حرارت 65 درجه سانتیگراد قرار داده شد.
4- نمونهها از انکوباتور خارج شدند، و 20 میکرولیتر ماده جذب کنندهی Nuclease به هرنمونه افزوده شد، و به مدت 10 دقیقه بههم زده شدند.
5- به مدت 10 ثانیه و در سرعت g 5000 نمونهها سانتریفیوژ شدند، و سپس مایع بالایی آنها دور ریخته شد.
6-200 میکرولیتر ماده Lysis Reagent به رسوب سفید رنگ ته میکروتیوبها افزوده شد، و با ورتکس محیط یکسانی حاصل شدند.
7- به محیط همگن شده، 400 میکرولیتر Saline Buffer افزوده شد و نمونهها چند بار بالا و پایین شدند.
8- نمونهها به مدت 10 ثانیه در سرعت g 5000 سانتریفیوژ شدند، و سپس مایع بالایی آنها دور ریخته شدند.
9- 500 میکرولیتر Saline Buffer به رسوب سفید رنگ ته میکروتیوبها افزوده شد، و با ورتکس محیط یکسانی حاصل شد.
10- نمونهها به مدت 10 ثانیه در سرعتg 5000 سانتریفیوژ شدند.
11- میکروتیوبها به مدت 10 دقیقه به صورت دربباز در انکوباتور با درجهی حرارت 65 درجه قرار داده شدند.
12- بعد از خارج کردن نمونهها از انکوباتور در صورتی که بوی الکل نداشت، 80 میکرولیتر Extra Gene E به هر نمونه اضافه شد و با ورتکس مخلوطی همگن حاصل شد.
13 – نمونهها، به مدت 10 دقیقه، در انکوباتور با دمای 65 درجه سانتیگراد قرار گرفتند.
14- بعد از خارج کردن نمونهها از انکوباتور، با ورتکس محیط همگن شدند.
15- نمونهها به مدت 2 دقیقه با سرعت g 10000 سانتریفیوژ شدند.
16- بخش بالایی میکروتیوبها که دارای DNA بود، به میکروتیوبهای جدید منتقل شد و در دمای منفی 20 درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
3-3- بررسی کمیت و کیفیت استخراج
پس از استخراج DNA، کمیت و کیفیت DNAی استخراج شده، با استفاده از دستگاه نانودراپ (Nanodrop) مدل T100 و الکتروفورز روی ژل آگارز یک درصد بررسی شد.
3-3-1 الکتروفورز DNAی استخراج شده روی ژل آگارز یک درصد
مقدار 1 گرم آگارز در 100 میلیلیتر بافر 1X TAE حل و چند دقیقه جوشانده شد. بعد از اضافه کردن اتیدیوم برماید به محلول (رنگ محلول صورتی پوست پیازی شود)، درون سینی ژل که دو طرف آن بسته شده و شانه مخصوص روی آن گذاشته شده بود، ریخته شد.
بعد از سرد شدن ژل، دو طرف سینی را باز کرده و شانه به آرامی خارج شد. ژل به همراه سینی در تانک دارای بافر 1X TAE قرار داده شد. ارتفاع بافر باید به حدی باشد که سطح ژل را تا چند میلیلیتر بپوشاند.
مقدار 4 میکرولیتر از DNA استخراج شده، با یک میکرولیتر بافر بارگذاری آمیخته و به چاهک ژل انتقال داده شد.
ولتاژ دستگاه در 80 ولت تنظیم و برای 90 دقیقه فرآیند الکتروفورز انجام شد.
پس از پایان الکتروفورز، ژل روی صفحهی U.V. Transilluminator بررسی و از آن عکسبرداری شد.
3-3-2- تهیه بافر 50x TAE
مقدار 2/242 گرم تریس باز، 57 میلیلیتر اسید استیک 99 درصد و 100 میلیلیتر EDTA نیم مولار با pH 5/7 تا 8، با هم مخلوط شدند.
حجم محلول با استفاده از آب مقطر به یک لیتر رسید.
3-3-3-تهیه بافرTAE 1X
برای استفاده از بافر، باید غلظت آن از50x به 1x کاهش یابد. بدین منظور، 20 میلیلیتر از بافر 50x با 980 میلیلیتر آب مقطر مخلوط شد و یک لیتر بافر 1x بدست آمد.
3-4- واکنشهای زنجیرهای پلیمراز(PCR)
3-4-1- ژن هورمون رشد
برای ازدیاد قطعهی 428 جفت بازی از اگزون 5 ژن هورمون رشد از آغازگرهای ارایه شده در جدول 3-1 استفاده شد. در واکنشهای PCR از میکروتیوبهای 25 میکرولیتری استفاده شد. مواد مورد استفاده در واکنشهای PCR در جدول 3-2 ارایه شده است و از دستگاه ترموسایکلر Eppendorf AG Master cycler G–iant مدل 23331 استفاده شد. چرخههای گرمایی مورد استفاده در PCR در جدول 3-3 نشان داده شده است.
جدول 3-1 – آغازگرهای استفاده شده در ازدیاد ژن هورمون رشد ( Lucy et al., 1993)
نام ژن اندازه قطعه آغازگر
هورمون رشد bp 428 F.5′-CCG TGT CTA TGA GAA GC-3′
R.5′-GTT CTT GAG CAG CGC GT-3′
جدول 3-2- مواد استفاده شده در هر واکنش PCR در ازدیاد ژن هورمون رشد
ماده میزان مصرف
آب دیونیزه شده 15/15 میکرولیتر
بافر PCR 10X 5/2 میکرولیتر
dNTP 200 میکرومولار
MgCl2 2/1 میلی مولار
هرآغازگر 400 نانو مولار
آنزیم Taq یک واحد
DNA 60 نانو گرم ( 2 میکرولیتر)
جدول 3-3- چرخهی گرمایی استفاده شده در ازدیاد ژن هورمون رشد
گامه ی واکنش دما(سانتیگراد) زمان شمار چرخه
واسرشته سازی اولیه 94 10 دقیقه 1
واسرشته سازی 94 30 ثانیه 30

همجوشی آغازگر و DNA 56 60 ثانیه بسط 72 35 ثانیه بسط نهایی 72 10 دقیقه 1
3-4-2- ژن گیرندهی هورمون رشد
برای ازدیاد قطعهی 342 جفت بازی از ژن گیرندهی هورمون رشد از آغازگرهای ارایه شده در جدول 3-4 استفاده شد. در واکنشهای PCR، از میکروتیوبهای 25 میکرولیتری استفاده شد. مواد مورد استفاده در واکنشهای PCR در جدول 3-5 ارایه شده است و از دستگاه ترموسایکلر Eppendorf AG Master cycler G–iant مدل 23331 استفاده شد. چرخههای گرمایی مورد استفاده در واکنشهای PCR در جدول 3-6 نشان داده شده است.
جدول 3-4 – آغازگرهای استفاده شده در ازدیاد ژن گیرندهی هورمون رشد (Di Stasio et al., 2005)
نام ژن اندازهی قطعه آغازگر
گیرندهی
هورمون رشد bp 342 F.5′-GCT AAC TTC ATC GTG GAC AAC-3′
R.5′-CTA TGG CAT GAT TTT GTT CAG-3’
جدول 3-5- مواد استفاده شده درهر واکنش PCR در ازدیاد ژن گیرندهی هورمون رشد
ماده میزان مصرف
آب دیونیزه شده 8/15 میکرولیتر
بافر PCR 10X 5/2 میکرولیتر
dNTP 200 میکرومولار
MgCl2 2 میلی مولار
هرآغازگر 400 نانو مولار
آنزیم Taq یک واحد
DNA 60 نانو گرم (2 میکرولیتر)
جدول 3-6- چرخهی گرمایی استفاده شده در ازدیاد ژن گیرندهی هورمون رشد
گامهی واکنش دما (سانتیگراد) زمان(ثانیه) شمار چرخه
واسرشته سازی اولیه 94 5 دقیقه 1
واسرشته سازی 94 45 ثانیه 35

همجوشی آغازگر با DNA 50 30 ثانیه بسط 72 50 ثانیه بسط نهایی 72 5 دقیقه 1
برای بررسی نتیجه واکنشهای PCR، ژل آگارز یک درصد به شیوهی بیان شده در بخش 3-1-1 تهیه شد. سپس، 4 میکرولیتر از فرآوردههای PCR با یک میکرولیتر بافر بارگذاری آمیخته شد، و به چاهک ژل انتقال یافت. ولتاژ دستگاه در 80 ولت تنظیم و برای 90 دقیقه فرآیند الکتروفورز انجام شد. پس از پایان الکتروفورز، ژل روی صفحهی U.V. Transilluminator بررسی و از آن عکسبرداری شد. به کمک خطکشهای DNA که همراه نمونهها در ژل بارگذاری شده بود، قطعات تکثیر شده، اندازهگیری شدند. خطکشهای DNA، قطعاتی از مولکول DNA با وزن مولکولی مشخص و استاندارد هستند که برای تعیین اندازهی قطعات DNA استفاده میشوند.
3-5- هضم محصولات PCR با آنزیمهای برشی
پس از انجام واکنشهای زنجیرهای پلیمراز و بررسی درستی قطعههای مورد نظر (bp 428 برای ژن هورمون رشد و bp 342 برای ژن گیرنده هورمون رشد) با ژل آگارز یک درصد، واکنشهای هضم آنزیمی با آنزیم محدودکنندهی AluI برای هر دو ژن انجام شد. واکنشهای هضم در حجم 15 میکرولیتر و به صورت زیر انجام شد. آنزیم محدودکننده AluI توالی AGCT را شناسایی میکند و اتصال بین باز گوانین و سیتوزین را برش میزند. این آنزیم توسط باکتری گرم مثبت و خاکزی Arthrobacter luteus تولید میشود. پس از افزودن آب دو بار تقطیر، بافر، و آنزیم AluI به میزان مناسب برای هر نمونه (جدول 3-7) و تهیه مخلوط واکنش، برای شمار نمونههای مورد نظر، 10 میکرولیتر از فرآورده PCR به آن افزوده شد. واکنشهای هضم در طول شب در انکوباتور با دمای 37 درجه سانتیگراد انجام شدند.
جدول 3-7- ترکیبهای لازم برای هضم آنزیمی در هر واکنش هضم
ترکیب مقدار
آب دیونیزه 2.1 میکرولیتر
بافر آنزیم 5.1 میکرو لیتر
آنزیم AluI سه واحد
فرآورده PCR 10 میکرولیتر
تهیه ژل 5/2 درصد آگارز مشابه ژل یک درصد است، با این تفاوت که در این حالت، 5/2 گرم آگارز در 100 میلیلیتر بافر TAE 1x ،حل میشود. بعد از انجام واکنشهای هضم، برای بررسی اندازهی قطعات حاصل از هضم آنزیمی، کل حجم هر نمونه با 2 میکرولیتر بافر بارگذاری، آمیخته و به چاهک ژل 5/2 درصد انتقال داده شد. سپس، ولتاژ دستگاه در 75 ولت تنظیم و به مدت 90 دقیقه فرآیند الکتروفورز انجام شد. پس از پایان زمان الکتروفورز، ژل روی صفحه U.V. Transilluminator بررسی و از آن عکسبرداری شد. به کمک خطکشهای DNA که همراه نمونهها در ژل بارگذاری شده بود، قطعات حاصل از برش، اندازهگیری شد.
3-6- واکاوی همراهی چندریختیها با صفات تولیدی و تولیدمثلی
در این پژوهش همراهی چندریختیهای ژن هورمون رشد و گیرندهی آن با صفات تولید شیر، سختزایی، دوقلوزایی، مردهزایی، فاصلهی زایش، شمار روزهای باز، فاصلهی بین زایش تا اولین فحلی و شمار تلقیح به ازای هر آبستنی بررسی شد. مدل آماری استفاده شده، به صورت زیر بود.
yijklm = µ + hysi +pj+ gk +sirel +b1(FCAijklm) + eijklm
yijklm= عملکرد تولیدی یا تولید مثلی حیوان mام، با ژنوتیپ k، در دستهی lامین گاو نر، jامین شکم زایش، iامین دستهی گله- سال- فصل زایش
µ= میانگین کل
hysi= اثر ثابت iامین گله – سال- فصل زایش
pj= اثر ثابت jامین شکم زایش
gk= اثر ثابت kامین ژنوتیپ
sirel= اثر تصادفی lامین گاو نر
b1= ضریب رگرسیون متغیرهای وابسته (صفات) از سن در هنگام اولین زایش
FCAijklm= سن در هنگام اولین زایش در گاو mام، با ژنوتیپ kام، در دستهی l امین گاو نر، j امین شکم زایش، iامین گله – سال – فصل زایش
eijklm= اثر تصادفی باقیمانده با میانگین صفر و توزیع نرمال
واکاوی چندریختیها با صفات تولیدی و تولید مثلی با استفاده از نرمافزارSAS انجام شد. آنالیز همراهی صفات پیوسته با رویهی MIXEDو صفات گسسته با رویهی GENMOD انجام شد. میانگین حداقل مربعات ژنوتیپها در صفات پیوسته، در سطح 5 درصد با هم مقایسه شدند. در واکاوی صفات گسسته، ژنوتیپهای هر ژن با روش رگرسیون لجستیک مقایسه شدند و در آن از معیار نسبت بخت استفاده شد.
دادههای تولید شیر از مرکز اصلاح نژاد دام کشور گرفته شدند و دادههای صفات تولیدمثلی از مدیریت گاوداریهای مورد مطالعه، دریافت شدند. شمار دادهها برای هر یک از صفات تولید شیر، فاصلهی زایش، سختزایی، تعداد تلقیح به ازای هر آبستنی، مردهزایی، دوقلوزایی، نخستین فحلی پس از زایش و رزوهای باز، 452 داده بود. در واکاوی صفات پیوسته، افزون بر مقایسهی میانگین ژنوتیپهای هر ژن، اثر جایگزینی اللها نیز بررسی شد.
فصل چهارم

یافتهها
4-1- DNA ژنومیک
کیفیت و کمیت DNA ژنومیک بوسیله الکتروفورز با ژل آگارز یک درصد و دستگاه نانودراپNanodrop)) مدل T100 بررسی شد. غلظت DNA استخراج شده، 50-30 نانوگرم DNA در هر میکرولیتر بود. نتایج الکتروفورز برخی از نمونههای DNA استخراج شده در نگارهی 4-1 نشان داده شده است.

نگاره 4-1-الکتروفورز چند نمونه از DNA ژنومیک استخراج شده
4-2- فرآوردههای واکنشهای PCR ژنهای هورمون رشد و گیرندهی آن
برای ازدیاد قطعهی 428 جفت بازی از ژن هورمون رشد از آغازگرهای ارایه شده توسط (Lucy, 1993b) و برای ازدیاد قطعهی 342 جفت بازی از ژن گیرندهی هورمون رشد از آغازگرهای ارایه شده توسط (Di Stasio et al., 2005) استفاده شد. نتیجه الکتروفورز محصولات PCR در نگارهی 4-2 ارایه شده است.

نگارهی 4-2- فرآوردههای PCR در ازدیاد ژن هورمون رشد و گیرندهی آن
4-3- هضم محصولات PCR با آنزیمهای برشی
4-3-1 هضم محصولات PCR جایگاه 5 ژن هورمون رشد با آنزیم برشی AluI
پس از ازدیاد قطعهی 428 جفت بازی ژن هورمن رشد، فرآوردههای PCR با آنزیم AluI هضم شدند. پس از الکتروفورز نتایج هضم با آنزیم AluI، و عکسبرداری از آن بوسیله اشعه UV، دو ژنوتیپ (LL,LV) دیده شد (نگاره4-3). با توجه به ناحیهی برشی آنزیم AluI، آلل V دارای قطعههای 265 ، 147 ،16 جفت بازی و آلل L دارای قطعههای 16 ،51 ،96 ،265 جفت بازی هستند. بنابراین، گاوهای هتروزیگوت LV دارای قطعههای 51 ،96 ،147 ،265 جفت بازی و گاوهای هموزیگوت LL دارای قطعههای 51 ،96 ،265 جفت بازی بودند. قطعهی 16 جفت بازی در ژل آگاروز قابل دیدن نبود.

نگارهی4-3- ژنوتیپهای جایگاه 5 ژن هورمون رشد
4-3-2- فراوانیهای اللی و ژنوتیپی در جایگاه 5 ژن هورمون رشد
فراوانیهای اللی در جایگاه 5 ژن هورمون رشد برای آللهای L و V به ترتیب برابر با 69 و 31 درصد و همچنین فراوانی ژنوتیپی برای ژنوتیپهای LL و LV به ترتیب برابر با 61 و 39 درصد بود (جدول 4-1)
جدول 4-1- فراوانی اللی و ژنوتیپی ژن هورمون رشد
فراوانی ژنوتیپی(درصد) فراوانی اللی(درصد) شمار ژنوتیپ
LL LV VV L V LL LV VV
0 61 39 31 69 0 77 49
4-3-3- واکاوی همراهی ژنوتیپهای جایگاه 5 ژن هورمون رشد با صفات تولیدی و تولیدمثلی
آمارههای توصیفی دادههای صفات تولیدی و تولیدمثلی در جدول 4-2 ارایه شده است.
جدول 4-2- میانگین و انحراف معیار دادههای صفات تولیدی و تولیدمثلی
صفت شمار روزهای شیردهی شمار تلقیح به ازای هر آبستنی فاصلهی زایش (روز) شمار روزهای باز فاصلهی بین زایش تا اولین فحلی (روز) تولید شیر (کیلوگرم)
میانگین 2/321 8/1 6/402 125 3/65 5/9285
انحراف معیار 1/98
1/1 7/71 6/63 6/42 8/2708
نتایج حاصل از واکاوی همراهی ژنوتیپهای جایگاه 5 ژن هورمون رشد با صفات تولیدی و تولیدمثلی در جدولهای 4-3 و 4-4 ارایه شده است. یافتهها نشان داد که به جز در صفت سختزایی، همراهی ژنوتیپهای جایگاه


رابطه¬ی بین چند¬شکلی ژن هورمون رشد و گیرنده¬ی آن با عملکرد تولیدی و تولید مثلی در گاوهای هلشتاین پایان نامه ها
قیمت: 11200 تومان

این نوشته در پایان نامه ها ارسال شده است. افزودن پیوند یکتا به علاقه‌مندی‌ها.

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *