جداسازی و همسانه‏سازی ژن‏های93 hrpW و hrpG جهت انتقال به لیمو ترش در راستای ایجاد مقاومت به شانکر مرکبات

8940801497965
2372360-176530وزارت علوم، تحقیقات و فناوری
پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری
پایان نامه كارشناسي‌ ارشد
در رشته زیست‏فناوری کشاورزی
عنوان:‌
جداسازی و همسانه‏سازی ژن‏های hrpW و hrpG جهت انتقال به لیمو ترش در راستای ایجاد مقاومت به شانکر مرکبات
پژوهشگر:
فرشید شریفیان
اساتید راهنما:
دكترسید مهدی علوی
دکتر علی‏اکبر حبشی
استاد مشاور:
دكترناصر فرخی
شهریورماه1393

سپاسگزاري
سپاس و ستایش مر خدای را جل و جلاله که آثار قدرت او بر چهره روز روشن، تابان است و انوار حکمت او در دل شب تار، درفشان. آفریدگاری که خویشتن را به ما شناساند و درهای علم را بر ما گشود و عمری و فرصتی عطا فرمود تا بدان، بنده ضعیف خویش را در طریق علم و معرفت بیازماید. راز و رمز پویای علم و کشف معانی بدیع و تجلی جلوه های شهودی معرفت کیمیایی است که آسمان علم به برکت سیما و سیره ی نورانی نبی مکرم صلی الله علیه و آله و سلم، انسان دربند خاک را به معراج حضور می‏خواند .و چه خرم علمی که از چشمه ی معارف سیراب شود و چه زیبا دانشی که قبای پرنیانش به عطر و بوی گلستان محمدی معطر شود و چه معماری باشکوهی، بنایی که سنگ هویت و فرهنگ آن ریشه درمدینه النبی بیابد. و امروز کاخ آباد علم به سروش معنوی و مفهوم پیام او بیش از پیش محتاج راهنمایانی است که علاوه بر حفظ آبادانی آن در راه اعتلای آن به فرزندان خویش محبت نمایند.
سپاس و تشکر فراوان از اساتید ارجمندم آقایان دکتر سید مهدی علوی، دکتر علی اکبر حبشی و دکتر ناصر فرخی اساتید محترم راهنما و مشاورم،شما روشنايي بخش تاريكي جان ، چگونه سپاس گويم مهرباني و لطف شما را كه سرشار از عشق و يقين است. چگونه سپاس گويم تأثير علم آموزي شما را كه چراغ روشن هدايت را بر كلبه ي محقر وجودم فروزان ساخته است. آري در مقابل اين همه عظمت و شكوه مرا نه توان سپاس است و نه كلام وصف.
همچنبن مراتب قدردانی خود را از کلیه کارشناسان محترم آزمایشگاه و همچنین همراهی‏های معنوی و علمی تمامی دوستانم در پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست‏فناوری و به‏خصوص آزمایشگاه زیست‏فناوری گیاهی سپاس‏گزاری کرده و فرصت را مغتنم شمرده و از زحمات بهترین دوستانم آقای رسول لوایی، سعدی فتح‏الهی، محمد پایدارزاده ، محمد‏جواد شیرچیان، علی امیری، متین عادل ، مهندس سهیلوند و همچنین خانم سارا کاظم‏زاده، پردیس ریاحی، مریم رشیدی‏فر، فهیمه نسودیان، مریم رمضانی، بهاره زارع و مریم خوشنامی خالصانه تشکر نمایم.
پروردگارا:
نه میتوانم موهایشان را که در راه عزت من سفید شد، سیاه کنم و نه برای دستهای پینه بسته شان که ثمره تلاش برای افتخار من است، مرهمی دارم . پس توفیقم ده که هر لحظه شکر گزارشان باشم و ثانیه های عمرم را در عصای دست بودنشان بگذرانم.
تقدیم به مقدسترین واژه ها در لغت نامه دلم،
پدرم،مهربانی مشفق، بردبار و حامی.
مادر م،که زندگیم را مدیون مهر و عطوفت آن می دانم.
همسرم، که نشانه لطف الهی در زندگی من است.
برادر و خواهرانم همراهان همیشگی و پشتوانه های زندگیم.
چکیده
بیماری شانکر به‏وسیله‏ی باکتری (Xanthomonas citri pv. citri) ایجاد می‏شود که هر ساله عملکرد و کیفیت محصولات خانواده مرکبات، به‏ویژه لیمو‏ترش و پرتقال را تحت تاثیر خود کاهش می‏دهد. این پژوهش با هدف جداسازی و همسانه‏سازی دو ژن رمز کننده‏ی هارپین‏های HrpW و HrpG از باکتری Xcc سویه NIGEB-088 و ساخت پلاسمید‏های نوترکیب pBI-hrpG و pBI-hrpW به‏منظور توسعه‏ی استراتژی مقاومت به بیماری شانکر بر مبنای القای واکنش دفاعی در گیاه لیموترش انجام شد. بدین منظور آغازگرهای اختصاصی (رفت و برگشت) برای تکثیر این ژن‏ها با استفاده از توالی کامل DNA ژنومی باکتری عامل این بیماری، طراحی شد. ژن‏های تکثیر شده سپس به منظور همسانه‏سازی، در پلاسمید‏های pGEM7zf(-) و همچنین pUC19 به ترتیب برای ژن‏های hrpW و hrpG، با جایگاه‏های برشی XbaI و SacI و همچنین XbaI وBamHI وارد شد و پلاسمیدهای نوترکیب در باکتری E.coli سویه DH5α تراریخت شدند. به منظور بیان ژن‏ها در گیاه، قطعه‏ی مورد نظر در ناقل pBI121 و در جایگاه‏های برشی برای ژن‏های هدف همسانه‏سازی شد، به‏طوری ‏که ژن‏های مورد نظر تحت کنترل پیشبر ویروس موزائیک گل کلم 35S و پایان‏بر NOS در ناحیه‏ی DNA T- این ناقل قرار گرفت. با استفاده از واکنش زنجیره‏ای پلیمراز، هضم آنزیمی و توالی‏یابی حضور ژن‏های هدف در کلونی‏های مثبت مورد تایید قرار گرفت. این ناقل‏های پلاسمیدی نوترکیب را می‏توان در انتقال ژن به گیاهان حساس به این بیماری مانند لیمو ترش و پرتقال با استفاده از آگروباکتریوم مورد استفاده قرار داد. در نهایت پلاسمیدهای نوترکیب به سویه‏های مورد نظر آگروباکتریوم تومفاسینس منتقل و حضور ژن‏های مربوطه مورد تایید واقع شد. سویه‏های آگروباکتریوم تومفاسینس تایید شده در برنامه‏های انتقال ژن مورد استفاده قرار خواهند گرفت.
کلمات کلیدی: شانکر مرکبات، همسانه‏سازی ژن، باکتری زانتوموناس سیتری، ژن‏های هارپین
فهرست مطالب
عنوان صفحه
فصل اول: مقدمه و مروری بر منابع
TOC o “1-4” u 1-مقدمه………………………………………………………………………………………………………………. 2
1-1- مقدمه‏ای بر مرکبات………………………………………………………………………2
1-2- تاریخچه‌ی کشت درختان مرکبات در ایران و جهان…………………………………………4
1-3- سطح زیر کشت، میزان تولید و عملکرد درختان مرکبات در ایران و جهان…………………….4
1-4- اهمیت و انواع بیماری‌های مرکبات…………………………………………………………6
1-4-1- تاریخچه و اهمیت بیماری شانکر مرکبات……………………………………………….7
1-4-2- عامل بیماری…………………………………………………………………………10
1-4-3- علایم و چرخه‌ی بیماری………………………………………………………………13
1-4-4- ابزارهای ایجاد بیماری تحت اختیار باکتری……………………………………………..14
1-4-5- جذب، اتصال و ورود باکتری به گیاه……………………………………………………14
1-4-6- سیستم‌های ترشحی باکتری……………………………………………………………15
1-4-7- سیستم ترشحی نوع III (TTSS)………………………………………………………16
1-4-8- ژن‌های hrp و نقش دوگانه‌ی آنها……………………………………………………….17
1-4-9- هارپین‌ها و نقش آنها در القای پاسخ ………………………………………………HR20
1-5- بهره‌گیری از مهندسی ژنتیک در مقاومت به بیماری‌ها………………………………………21
فصل دوم: مواد و روش‏ها
2- محل انجام پژوهش……………………………………………………………………………………………..25 PAGEREF _Toc398685950 h 25
2-1- مواد شیمیایی، آنزیم‏ها و کیت‏ها………………………………………………………….25
2-2- سویه‏های باکتری………………………………………………………………………..25
2-3- پلاسمیدهای مورد استفاده……………………………………………………………….26
2-4- محیط کشت باکتری‏ها…………………………………………………………………….26
2-5- آنتی‏بیوتیک‏ها……………………………………………………………………………27
2-6- طراحی آغازگر………………………………………………………………………….27
2-7- شناسایی و جداسازی باکتری Xcc…………………………………………………………………………………….29
2-8- خالص سازی DNA ژنومی باکتری Xcc سویه‏ی ………………………..NIGEB.088(A*)31
2-9- تعیین کمیت و کیفیت DNA استخراج شده……………………………………………….31
2-10- واکنش زنجیره‏ای پلیمراز با آنزیم‏هایTaq و Pfu دی.ان.آ پلیمراز جهت جداسازی ژن‏های هدف……………………………………………………………………………………………………………………………………..31
2-11- الکتروفورز محصولات واکنش زنجیره‏ای پلیمراز……………………………………………33
2-12- خالص‏سازی محصول واکنش زنجیره‏ای پلیمراز………………………………………….33
2-13- جداسازی محصول PCR و یا محصول حاصل از هضم آنزیمی از روی ژل آگارز……………34
2-14- هضم آنزیمی با آنزیم‏های محدود کننده تیپ …………………………………………..II35
2-15- الکتروفورز محصولات واکنش‏های هضم آنزیمی…………………………………………39
2-16- واکنش اتصال………………………………………………………………………….39
2-17- تکثیر پلاسمید………………………………………………………………………….42
2-18- اندازه‏گیری دانسیته نوری(OD) باکتری…………………………………………………..42
2-19- تکنیک Colony-PCR: غربالگری کلونی‏های نوترکیب……………………………………42
2-20- استخراج پلاسمید در مقیاس کم ……………………………………(Mini-Preparation)43
2-21- توالی‏یابی………………………………………………………………………………43
2-22- انتقال پلاسمید‏های نوترکیب pBI-hrpW و pBI-hrpG به سویه‏های آگروباکتریوم تومفاسینس با‏ استفاده از روش ذوب و انجماد…………………………………………………………………43
فصل سوم: نتیجه‏گیری و بحث
3- شناسایی باکتری Xcc (A*)……………………………………………………………………………………………………………………..47
3-1- شناسایی به کمک تست بیماریزایی بر روی گیاه میزبان C.auratifolia…………………………………47
3-2- شناسایی به کمک آغازگرهای اختصاصیMS+/MS- و Xac01 / Xac02……………………………….48
3-3- استخراج DNA ژنومی از باکتری XCC……………………………………………………………………………49
3-4- تعیین کیفیت و کمیت DNA استخراج شده………………………………………………50
3-5- تکثیر ژن‏هایhrpW و hrpG با واکنش زنجیره‏ای پلیمراز………………………………….51
3-5-1- طراحی آغازگرهای مناسب……………………………………………………………51
3-5-2- بهینه‏سازی شرایط واکنش زنجیره‏ای پلیمراز……………………………………………51
3-5-3- الکتروفورز محصول واکنش زنجیره‏ای پلیمراز………………………………………….53
3-6- تایید ناقل‏های کلونینگ و بیانی از طریق الگوهای برشی حاصل از هضم توسط آنزیم‏های برشی نوع II…………………………………………………………………………………………………………………………………….54
3-7- همسانه‏سازی ژن‏هایhrpG و hrpW در ناقل‏های کلونینگ (PGEM7zf(-) , pUC19)………….55
3-8- تایید همسانه‏سازی ژن‏های هدف در ناقل‏های کلونینگ (pGEM7zf(-))،( pUC19)………………57
3-8-1- واکنش کلونی PCR کلون‏های گزینش شده……………………………………………57
3-8-2- تایید همسانه‏سازی ژن‏هایhrpW/G در ناقل‏های کلونینگ با روش هضم آنزیمی…………58
3-8-3- تایید همسانه‏سازی ژن‏های hrpW/G در ناقل‏های کلونینگ با روش واکنش زنجیره‏ای پلیمراز……………………………………………………………………………………………………………………………………59
3-9- همسانه سازی ژن‏های hrpG/W در ناقل بیانی pBI121………………………………………………………59
3-10- تایید همسانه سازی ژن‏های hrpG/W در ناقل بیانی pBI121…………………………………………….62
3-10-1- واکنش کلونی PCR کلون‏های تشکیل شده……………………………………………62
3-10-2- تایید همسانه‏سازی ژن‏های hrpG/W در ناقل بیانی pBI121 با روش واکنش هضم آنزیمی.63
3-10-3- تایید همسانه‏سازی ژن‏های hrpW/G در ناقل بیانی pBI121 با روش واکنش زنجیره‏ای پلیمراز……………………………………………………………………………………….64
3-11- توالی‏یابی……………………………………………………………………………..65
3-11-1- نتایج توالی‏یابی……………………………………………………………………..66
3-12- انتقال پلاسمیدهای نوترکیب pBI.hrpG و pBI.hrpW به سویه‏های آگروباکتریوم تومفاسینس.67
3-13- تایید انتقال پلاسمیدهای نوترکیب pBI.hrpW/G به سویه‏های آگروباکتریوم تومفاسینس……..67
3-13-1- تایید انتقال پلاسمیدهای نوترکیب pBI.hrpW/G با روش کلونی PCR…………………………..67
فصل چهارم: جمع‏بندی کلی و پیشنهادها
4- جمع‏بندی کلی نتایج……………………………………………………………………….70
4-1- پیشنهادها………………………………………………………………………………71
پیوست
5- دستورالعمل استخراج و خالص‏سازی DNA ژنومی باکتری xanthomonas citri pv. citri سویه 088(A*) NIGEB-……………………………………………………………………………………………………………………………………84
5-1- محلول‏های لازم جهت استخراج DNA ژنومی……………………………………………84
5-1-1- مراحل استخراج DNA ژنومی…………………………………………………………85
5-1-2- روش اسپکتروفوتومتری………………………………………………………………86
5-1-3- الکتروفورز بر روی ژل آگارز………………………………………………………….87
6- الکتروفورز با ژل آگارز……………………………………………………………………………………. 88
6-1- نماي ساده از دستگاه الكتروفورز…………………………………………………………88
6-2- ژل آگارز……………………………………………………………………………….89
6-3- اتيديوم برومايد………………………………………………………………………….89
6-4- بافر بارگزاری ژل آگارز………………………………………………………………….90
6-5- طرز تهیه محلول …………………………………………………………….TBE 0.5X91
6-6- طرز تهیه آگارز 1%……………………………………………………………………………………………..91
7- دستورالعمل خالص‏سازی فرآورده‏های تکثیر شده و قطعات DNA از روی ژل آگارز…………………92
7-1- خالص‏سازی فرآورده‏های تکثیر شده با کیت ……………………………………..Bioneer92
7-2- خالص‏سازی قطعات DNA از ژل آگارز……………………………………………………………………………93
8-

Author:

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *