جداسازی و همسانه‏سازی ژن‏های93 hrpW و hrpG جهت انتقال به لیمو ترش در راستای ایجاد مقاومت به شانکر مرکبات

8940801497965
2372360-176530وزارت علوم، تحقیقات و فناوری
پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری
پایان نامه کارشناسی‌ ارشد
در رشته زیست‏فناوری کشاورزی
عنوان:‌
جداسازی و همسانه‏سازی ژن‏های hrpW و hrpG جهت انتقال به لیمو ترش در راستای ایجاد مقاومت به شانکر مرکبات
پژوهشگر:
فرشید شریفیان
اساتید راهنما:
دکترسید مهدی علوی
دکتر علی‏اکبر حبشی
استاد مشاور:
دکترناصر فرخی
شهریورماه1393

سپاسگزاری
سپاس و ستایش مر خدای را جل و جلاله که آثار قدرت او بر چهره روز روشن، تابان است و انوار حکمت او در دل شب تار، درفشان. آفریدگاری که خویشتن را به ما شناساند و درهای علم را بر ما گشود و عمری و فرصتی عطا فرمود تا بدان، بنده ضعیف خویش را در طریق علم و معرفت بیازماید. راز و رمز پویای علم و کشف معانی بدیع و تجلی جلوه های شهودی معرفت کیمیایی است که آسمان علم به برکت سیما و سیره ی نورانی نبی مکرم صلی الله علیه و آله و سلم، انسان دربند خاک را به معراج حضور می‏خواند .و چه خرم علمی که از چشمه ی معارف سیراب شود و چه زیبا دانشی که قبای پرنیانش به عطر و بوی گلستان محمدی معطر شود و چه معماری باشکوهی، بنایی که سنگ هویت و فرهنگ آن ریشه درمدینه النبی بیابد. و امروز کاخ آباد علم به سروش معنوی و مفهوم پیام او بیش از پیش محتاج راهنمایانی است که علاوه بر حفظ آبادانی آن در راه اعتلای آن به فرزندان خویش محبت نمایند.
سپاس و تشکر فراوان از اساتید ارجمندم آقایان دکتر سید مهدی علوی، دکتر علی اکبر حبشی و دکتر ناصر فرخی اساتید محترم راهنما و مشاورم،شما روشنایی بخش تاریکی جان ، چگونه سپاس گویم مهربانی و لطف شما را که سرشار از عشق و یقین است. چگونه سپاس گویم تأثیر علم آموزی شما را که چراغ روشن هدایت را بر کلبه ی محقر وجودم فروزان ساخته است. آری در مقابل این همه عظمت و شکوه مرا نه توان سپاس است و نه کلام وصف.
همچنبن مراتب قدردانی خود را از کلیه کارشناسان محترم آزمایشگاه و همچنین همراهی‏های معنوی و علمی تمامی دوستانم در پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست‏فناوری و به‏خصوص آزمایشگاه زیست‏فناوری گیاهی سپاس‏گزاری کرده و فرصت را مغتنم شمرده و از زحمات بهترین دوستانم آقای رسول لوایی، سعدی فتح‏الهی، محمد پایدارزاده ، محمد‏جواد شیرچیان، علی امیری، متین عادل ، مهندس سهیلوند و همچنین خانم سارا کاظم‏زاده، پردیس ریاحی، مریم رشیدی‏فر، فهیمه نسودیان، مریم رمضانی، بهاره زارع و مریم خوشنامی خالصانه تشکر نمایم.
پروردگارا:
نه میتوانم موهایشان را که در راه عزت من سفید شد، سیاه کنم و نه برای دستهای پینه بسته شان که ثمره تلاش برای افتخار من است، مرهمی دارم . پس توفیقم ده که هر لحظه شکر گزارشان باشم و ثانیه های عمرم را در عصای دست بودنشان بگذرانم.
تقدیم به مقدسترین واژه ها در لغت نامه دلم،
پدرم،مهربانی مشفق، بردبار و حامی.
مادر م،که زندگیم را مدیون مهر و عطوفت آن می دانم.
همسرم، که نشانه لطف الهی در زندگی من است.
برادر و خواهرانم همراهان همیشگی و پشتوانه های زندگیم.
چکیده
بیماری شانکر به‏وسیله‏ی باکتری (Xanthomonas citri pv. citri) ایجاد می‏شود که هر ساله عملکرد و کیفیت محصولات خانواده مرکبات، به‏ویژه لیمو‏ترش و پرتقال را تحت تاثیر خود کاهش می‏دهد. این پژوهش با هدف جداسازی و همسانه‏سازی دو ژن رمز کننده‏ی هارپین‏های HrpW و HrpG از باکتری Xcc سویه NIGEB-088 و ساخت پلاسمید‏های نوترکیب pBI-hrpG و pBI-hrpW به‏منظور توسعه‏ی استراتژی مقاومت به بیماری شانکر بر مبنای القای واکنش دفاعی در گیاه لیموترش انجام شد. بدین منظور آغازگرهای اختصاصی (رفت و برگشت) برای تکثیر این ژن‏ها با استفاده از توالی کامل DNA ژنومی باکتری عامل این بیماری، طراحی شد. ژن‏های تکثیر شده سپس به منظور همسانه‏سازی، در پلاسمید‏های pGEM7zf(-) و همچنین pUC19 به ترتیب برای ژن‏های hrpW و hrpG، با جایگاه‏های برشی XbaI و SacI و همچنین XbaI وBamHI وارد شد و پلاسمیدهای نوترکیب در باکتری E.coli سویه DH5α تراریخت شدند. به منظور بیان ژن‏ها در گیاه، قطعه‏ی مورد نظر در ناقل pBI121 و در جایگاه‏های برشی برای ژن‏های هدف همسانه‏سازی شد، به‏طوری ‏که ژن‏های مورد نظر تحت کنترل پیشبر ویروس موزائیک گل کلم 35S و پایان‏بر NOS در ناحیه‏ی DNA T- این ناقل قرار گرفت. با استفاده از واکنش زنجیره‏ای پلیمراز، هضم آنزیمی و توالی‏یابی حضور ژن‏های هدف در کلونی‏های مثبت مورد تایید قرار گرفت. این ناقل‏های پلاسمیدی نوترکیب را می‏توان در انتقال ژن به گیاهان حساس به این بیماری مانند لیمو ترش و پرتقال با استفاده از آگروباکتریوم مورد استفاده قرار داد. در نهایت پلاسمیدهای نوترکیب به سویه‏های مورد نظر آگروباکتریوم تومفاسینس منتقل و حضور ژن‏های مربوطه مورد تایید واقع شد. سویه‏های آگروباکتریوم تومفاسینس تایید شده در برنامه‏های انتقال ژن مورد استفاده قرار خواهند گرفت.
کلمات کلیدی: شانکر مرکبات، همسانه‏سازی ژن، باکتری زانتوموناس سیتری، ژن‏های هارپین
فهرست مطالب
عنوان صفحه
فصل اول: مقدمه و مروری بر منابع
TOC \o “1-4” \u 1-مقدمه………………………………………………………………………………………………………………. 2
1-1- مقدمه‏ای بر مرکبات………………………………………………………………………2
1-2- تاریخچه‌ی کشت درختان مرکبات در ایران و جهان…………………………………………4
1-3- سطح زیر کشت، میزان تولید و عملکرد درختان مرکبات در ایران و جهان…………………….4
1-4- اهمیت و انواع بیماری‌های مرکبات…………………………………………………………6
1-4-1- تاریخچه و اهمیت بیماری شانکر مرکبات……………………………………………….7
1-4-2- عامل بیماری…………………………………………………………………………10
1-4-3- علایم و چرخه‌ی بیماری………………………………………………………………13
1-4-4- ابزارهای ایجاد بیماری تحت اختیار باکتری……………………………………………..14
1-4-5- جذب، اتصال و ورود باکتری به گیاه……………………………………………………14
1-4-6- سیستم‌های ترشحی باکتری……………………………………………………………15
1-4-7- سیستم ترشحی نوع III (TTSS)………………………………………………………16
1-4-8- ژن‌های hrp و نقش دوگانه‌ی آنها……………………………………………………….17
1-4-9- هارپین‌ها و نقش آنها در القای پاسخ ………………………………………………HR20
1-5- بهره‌گیری از مهندسی ژنتیک در مقاومت به بیماری‌ها………………………………………21
فصل دوم: مواد و روش‏ها
2- محل انجام پژوهش……………………………………………………………………………………………..25 PAGEREF _Toc398685950 \h 25
2-1- مواد شیمیایی، آنزیم‏ها و کیت‏ها………………………………………………………….25
2-2- سویه‏های باکتری………………………………………………………………………..25
2-3- پلاسمیدهای مورد استفاده……………………………………………………………….26
2-4- محیط کشت باکتری‏ها…………………………………………………………………….26
2-5- آنتی‏بیوتیک‏ها……………………………………………………………………………27
2-6- طراحی آغازگر………………………………………………………………………….27
2-7- شناسایی و جداسازی باکتری Xcc…………………………………………………………………………………….29
2-8- خالص سازی DNA ژنومی باکتری Xcc سویه‏ی ………………………..NIGEB.088(A*)31
2-9- تعیین کمیت و کیفیت DNA استخراج شده……………………………………………….31
2-10- واکنش زنجیره‏ای پلیمراز با آنزیم‏هایTaq و Pfu دی.ان.آ پلیمراز جهت جداسازی ژن‏های هدف……………………………………………………………………………………………………………………………………..31
2-11- الکتروفورز محصولات واکنش زنجیره‏ای پلیمراز……………………………………………33
2-12- خالص‏سازی محصول واکنش زنجیره‏ای پلیمراز………………………………………….33
2-13- جداسازی محصول PCR و یا محصول حاصل از هضم آنزیمی از روی ژل آگارز……………34
2-14- هضم آنزیمی با آنزیم‏های محدود کننده تیپ …………………………………………..II35
2-15- الکتروفورز محصولات واکنش‏های هضم آنزیمی…………………………………………39
2-16- واکنش اتصال………………………………………………………………………….39
2-17- تکثیر پلاسمید………………………………………………………………………….42
2-18- اندازه‏گیری دانسیته نوری(OD) باکتری…………………………………………………..42
2-19- تکنیک Colony-PCR: غربالگری کلونی‏های نوترکیب……………………………………42
2-20- استخراج پلاسمید در مقیاس کم ……………………………………(Mini-Preparation)43
2-21- توالی‏یابی………………………………………………………………………………43
2-22- انتقال پلاسمید‏های نوترکیب pBI-hrpW و pBI-hrpG به سویه‏های آگروباکتریوم تومفاسینس با‏ استفاده از روش ذوب و انجماد…………………………………………………………………43
فصل سوم: نتیجه‏گیری و بحث
3- شناسایی باکتری Xcc (A*)……………………………………………………………………………………………………………………..47
3-1- شناسایی به کمک تست بیماریزایی بر روی گیاه میزبان C.auratifolia…………………………………47
3-2- شناسایی به کمک آغازگرهای اختصاصیMS+/MS- و Xac01 / Xac02……………………………….48
3-3- استخراج DNA ژنومی از باکتری XCC……………………………………………………………………………49
3-4- تعیین کیفیت و کمیت DNA استخراج شده………………………………………………50
3-5- تکثیر ژن‏هایhrpW و hrpG با واکنش زنجیره‏ای پلیمراز………………………………….51
3-5-1- طراحی آغازگرهای مناسب……………………………………………………………51
3-5-2- بهینه‏سازی شرایط واکنش زنجیره‏ای پلیمراز……………………………………………51
3-5-3- الکتروفورز محصول واکنش زنجیره‏ای پلیمراز………………………………………….53
3-6- تایید ناقل‏های کلونینگ و بیانی از طریق الگوهای برشی حاصل از هضم توسط آنزیم‏های برشی نوع II…………………………………………………………………………………………………………………………………….54
3-7- همسانه‏سازی ژن‏هایhrpG و hrpW در ناقل‏های کلونینگ (PGEM7zf(-) , pUC19)………….55
3-8- تایید همسانه‏سازی ژن‏های هدف در ناقل‏های کلونینگ (pGEM7zf(-))،( pUC19)………………57
3-8-1- واکنش کلونی PCR کلون‏های گزینش شده……………………………………………57
3-8-2- تایید همسانه‏سازی ژن‏هایhrpW/G در ناقل‏های کلونینگ با روش هضم آنزیمی…………58
3-8-3- تایید همسانه‏سازی ژن‏های hrpW/G در ناقل‏های کلونینگ با روش واکنش زنجیره‏ای پلیمراز……………………………………………………………………………………………………………………………………59
3-9- همسانه سازی ژن‏های hrpG/W در ناقل بیانی pBI121………………………………………………………59
3-10- تایید همسانه سازی ژن‏های hrpG/W در ناقل بیانی pBI121…………………………………………….62
3-10-1- واکنش کلونی PCR کلون‏های تشکیل شده……………………………………………62
3-10-2- تایید همسانه‏سازی ژن‏های hrpG/W در ناقل بیانی pBI121 با روش واکنش هضم آنزیمی.63
3-10-3- تایید همسانه‏سازی ژن‏های hrpW/G در ناقل بیانی pBI121 با روش واکنش زنجیره‏ای پلیمراز……………………………………………………………………………………….64
3-11- توالی‏یابی……………………………………………………………………………..65
3-11-1- نتایج توالی‏یابی……………………………………………………………………..66
3-12- انتقال پلاسمیدهای نوترکیب pBI.hrpG و pBI.hrpW به سویه‏های آگروباکتریوم تومفاسینس.67
3-13- تایید انتقال پلاسمیدهای نوترکیب pBI.hrpW/G به سویه‏های آگروباکتریوم تومفاسینس……..67
3-13-1- تایید انتقال پلاسمیدهای نوترکیب pBI.hrpW/G با روش کلونی PCR…………………………..67
فصل چهارم: جمع‏بندی کلی و پیشنهادها
4- جمع‏بندی کلی نتایج……………………………………………………………………….70
4-1- پیشنهادها………………………………………………………………………………71
پیوست
5- دستورالعمل استخراج و خالص‏سازی DNA ژنومی باکتری xanthomonas citri pv. citri سویه 088(A*) NIGEB-……………………………………………………………………………………………………………………………………84
5-1- محلول‏های لازم جهت استخراج DNA ژنومی……………………………………………84
5-1-1- مراحل استخراج DNA ژنومی…………………………………………………………85
5-1-2- روش اسپکتروفوتومتری………………………………………………………………86
5-1-3- الکتروفورز بر روی ژل آگارز………………………………………………………….87
6- الکتروفورز با ژل آگارز……………………………………………………………………………………. 88
6-1- نمای ساده از دستگاه الکتروفورز…………………………………………………………88
6-2- ژل آگارز……………………………………………………………………………….89
6-3- اتیدیوم بروماید………………………………………………………………………….89
6-4- بافر بارگزاری ژل آگارز………………………………………………………………….90
6-5- طرز تهیه محلول …………………………………………………………….TBE 0.5X91
6-6- طرز تهیه آگارز 1%……………………………………………………………………………………………..91
7- دستورالعمل خالص‏سازی فرآورده‏های تکثیر شده و قطعات DNA از روی ژل آگارز…………………92
7-1- خالص‏سازی فرآورده‏های تکثیر شده با کیت ……………………………………..Bioneer92
7-2- خالص‏سازی قطعات DNA از ژل آگارز……………………………………………………………………………93
8- دستورالعمل تهیه باکتری‏های مستعد برای پذیرش DNA خارجی…………………………………….95
8-1- تهیه سلول‏های مستعد E.coli……………………………………………………………………………95
8-2- دستورالعمل تراریزش باکتری مستعد به روش شوک حرارتی………………………………………………96
8-3- تهیه‏ی سلول‏های مستعد و انتقال پلاسمید‏های نوترکیب pBI-hrpW و pBI-hrpG به سویه‏های آگروباکتریوم تومفاسینس با استفاده از روش ذوب و انجماد……………………………………………………….97
9- استخراج پلاسمید در مقیاس کم از باکتری E.coli سویه DH5α……………………………………………..99
9-1- استخراج پلاسمید به روش دستی…………………………………………………………99
9-2- استخراج پلاسمید با استفاده از کیت MBST (دکتر شایان)…………………………………….101
9-3- روش تهیه محلول های IPTG و …………………………………………………X-Gal103
9-3-1- تهیه محلول ایزوپروپیل D-B تیوگالاکتوپیرانوزید (IPTG)…………………………………………….103
9-3-2- تهیه 5 برمو-3 کلرو- اتیدولیل D-B گالاکتوزید (X-Gal)………………………………103
10- تهیه مایه تلقیح و بهینه‏سازی شرایط مایه‏زنی گیاه میزبان……………………………………………………..103

فهرست جداول
عنوان صفحه TOC \t “جدول,1”
1-1- بیماریزایی فرم‏های مختلف شانکر روی چهار گونه از مرکبات………………………………….12
1-2- مشخصات آغازگرهای اختصاصی برای تکثیر و شناسایی………………………………………….29
2-2- برنامه Multipelex PCR با آغازگر‏های MS+/MS- و Xac01/Xac02………………………30
3-2- ترکیب محلول مادری برای واکنش Multipelex PCR جهت شناسایی باکتری…………….30
4-2- شیب‏ دمایی به‏کار رفته برای تعیین بهترین دمای اتصال با آنزیم Taq………………………….32
5-2- ترکیب محلول مادری برای واکنش زنجیره‏ای پلیمراز با آنزیم pfu دی.ان.آ پلیمراز……….32
6-2- چرخه حرارتی به‏کار ‏رفته برای تکثیر نهایی با آنزیم pfu………………………………………….33
7-2- شرایط واکنش هضم ژن hrpW و ناقل همسانه‏سازی مربوطه (pGEM7zf(-))…………….36
8-2- شرایط واکنش هضم ژن hrpG و ناقل همسانه‏سازی مربوطه (pUC19)……………………..36
9-2- شرایط واکنش دوتایی هضم آنزیمی جهت تایید ناقل‏های همسانه‏سازی ((-)pGEM7zf) و (pUC19)……………………………………………………………………………………………………………..37
10-2– شرایط واکنش هضم دوتایی آنزیمی جهت تایید ناقل بیانی(pBI121)……………………..37
11-2- شرایط واکنش هضم آنزیمی ژن hrpW و pBI121 جهت بازیابی قطعات مورد نظر از روی ژل……………………………………………………………………………………………………………………….38
12-2– شرایط واکنش هضم ژن hrpG و ناقل بیانی جهت بازیابی قطعات مورد نظر از روی ژل………………………………………………………………………………………………………………………….38
13-2- شرایط واکنش اتصال (pBI121-hrpG)…………………………………………………………..40
14-2- شرایط واکنش اتصال (pBI121-hrpW)……………………………………………………………40
15-2- شرایط واکنش اتصال (pUC19-hrpG)…………………………………………………………….41
16-2- شرایط واکنش اتصال (pGEM7zf(-)-hrpW)……………………………………………………41
17-2- چرخه حرارتی به‏کار رفته برای واکنش کلونی PCR به منظور تایید همسانه‏سازی در وکتور بیانی……………………………………………………………………………………………………………………..45
18-2- ترکیبات محلول مادری واکنش زنجیره‏ای کلونی PCR جهت تایید عمل همسانه‏سازی دروکتورهای کلونینگ و بیانی……………………………………………………………………………………45
1-5- مواد و مقدار مورد نیاز جهت تهیه بافر Loading dye………………………………………………91

فهرست شکل‏ها
عنوان صفحه
1-3- تست بیماریزایی روی لیمو………………………………………………………………………………………………482-3- تست (Xaco1 / Xaco2 / MS+/MS) Multiplex PCR……………………………………………………..493-3- اکتروفورزDNA ژنومی استخراج شده بر روی ژل آگارز 1%………………………………………………..504-3- واکنش زنجیره‏ای پلیمراز با Taq دی.ان.آ پلیمراز و گرادیان دمایی جهت بهینه‏سازی بهترین دمای اتصال با پرایمرهای اختصاصی………………………………………………………………………………………………….535-3- واکنش زنجیره‏ای پلیمراز برای تکثیر ژن‏های hrpG , hrpW با آغازگرهای اختصاصی و آنزیم pfu دی.ان.آ پلیمراز………………………………………………………………………………………………………………………..536-3- الکتروفورز محصول هضم آنزیمی ناقل‏های کلونینگ و بیانی با آنزیم‏های برشی نوع II بر روی ژل آگارز 1%………………………………………………………………………………………………………………………………..547-3- هضم آنزیمی فراورده ژن‏هایhrpG و hrpW جهت بازیابی از روی ژل آگارز)الف) و قطعات بازیابی شده(ب)………………………………………………………………………………………………………………………558-3- هضم آنزیمی ناقل‏های کلونینگpUC19 و pGM7zf(-) جهت بازیابی از ژل آگارز(الف) قطعات بازیابی شده(ب)……………………………………………………………………………………………………………………..559-3- واکنش کلونی PCR برای کلون‏های سفید حاصل ازhrpG و hrpW……………………………………5810-3- هضم آنزیمی پلاسمیدهای استخراج شده از کلونی‏های حاصل از واکنش اتصال pGEM و hrpw و همچنینhrpG و pUC19……………………………………………………………………………………………………..5811-3- الکتروفورز محصول واکنش زنجیره‏ای پلیمراز پلاسمیدهای تایید شده بر روی ژل آگارز 1%….5912-3- هضم آنزیمی ناقل بیانی جهت بازیابی از روی ژل آگارز (الف) قطعات بازیابی شده (ب)……..6113-3- فراورده بازیابی شده ناقل بیانی و ژن‏های hrpW/G جهت تعیین نسبت واکنش اتصال…………..6214-3- واکنش کلونی PCR تعدادی از کلون‏های حاصل از مخلوط اتصال وکتور pBI121 و ژن‏های hrpG و hrpW……………………………………………………………………………………………………………………….6315-3- هضم آنزیمی دوتایی پلاسمیدهای نوترکیبpBI.hrpG و pBI.hrpW با آنزیم‏هایXbaI/BamHI XbaI/SacI……………………………………………………………………………………………………………………………..6416-3- واکنش زنجیره‏ای پلیمراز برای پلاسمیدهای نوترکیبpBI.hrpG و pBI.hrpW جهت بررسی حضور ژن‏های مذکور……………………………………………………………………………………………………………..6517-3- پلاسمیدهای نوترکیب استخراج شده……………………………………………………………………………..6618-3- واکنش کلونی PCR تعدادی از کلون‏های حاصل از انتقال پلاسمیدهای نوترکیب pBI.hrpW/G به سویه‏های آگروباکتریوم تومفاسینس…………………………………………………………………………………………. 68 فصل اول
مقدمه و بررسی منابع
مقدمه
مقدمه‏ای بر مرکبات
مرکبات با نام علمی Citrus spp. از خانواده‌ی Rutaceae و زیرخانواده‌ی Auranutideae هستند. مرکبات گیاهانی بوته‌ای، درختچه‌ای با شاخ و برگ متراکم می‏باشند، اغلب گونه‌های مرکبات (مانند پرتقال، گریپ‌فروت و دورگ‌های نارنگی) در نواحی نیمه‌ گرمسیری با زمستان سرد فقط یک ‌بار در سال در اواخر زمستان و اوایل بهار گل می‌دهند. اما در نواحی گرمسیر و ساحلی ممکن است درختان مرکبات مانند لیموها و لایم‌ها که در بهار و تابستان گل می‌دهند، در طول سال چندین مرتبه گل داده و یا اینکه دوره‌ی گلدهی بسیار طولانی داشته باشند (دیویس و همکاران، 1994). در مرکبات گل‌ها 8-4 گلبرگ ضخیم سفید، قرمز یا ارغوانی رنگ، 5-4 کاسبرگ و 32-16 پرچم دارند. تخمدن دارای 14-6 برچه‌ی بیضوی متصل به خامه‌ی خیلی باریک و گاهی متورم و پهن بوده که به کلاله‌ی کروی ختم می‌شود. گل‌ها در مرکبات دو جنسی هستند و همچنین نوع گرده‌افشانی مرکبات برحسب گونه متفاوت است و خودگشن، خودگشن- دگرگشن و پارتنوکارپ هستند. به‏عنوان مثال، لیموترش عموماً خودگشن می‌باشد (کاستل و جمیتر، 1999).
میوه‌ی مرکبات غنی از ویتامین‌های A، B، C، فیبر، کربوهیدرات (قندهای ساده، فروکتوز، گلوکز و ساکارز) و مقادیری کلسیم، پتاسیم، نیاسین و اسیدفولیک می‌باشد که موجب پایین آوردن کلسترول خون، پیشگیری از عفونت‌های ویروسی و احتمال بروز سرطان روده و معده می‌شود (گورنستئین و همکاران، 2001). تولید مرکبات در جهان امروز از اهمیت بسزایی برخوردار است و یکی از منابع مهم ثروت، مبادلات تجاری و اشتغال به کار ساکنین حدود 137 کشور مرکبات‌خیز جهان به‌شمار می‌آید. حدود یک‏صد صنعت در جهان، از مرکبات در تولید فرآورده‌های خود استفاده می‌کنند. از موارد مهم و قابل توجه در صنعت مرکبات بالا بودن ارزش افزوده‌ی این محصول از طریق تولید محصولات جانبی آن است، که شامل مواد اولیه‌ی دارویی، غذایی و آرایشی و بهداشتی می‌شود (اسماعیل و ژانگ، 2004).
کشت و کار مرکبات بین عرض‌های جغرافیایی 40 درجه‌ی شمالی و جنوبی از خط استوا صورت می‌گیرد که در سطوح تجاری مناطق عمده‌ی تولید مرکبات جهان در بین عرض‌های جغرافیایی 5/23-40 درجه‌ی شمالی و جنوبی قرار دارند. حداقل حرارت مورد نیاز برای شروع رشد مرکبات (صفر فیزیولوژیک) 5/12 درجه‌ی سانتی‏گراد و متوسط دمای مناسب جهت رشد مطلوب 5/18 درجه سانتی‏گراد است، مرکبات ماهیانه به 180 ساعت مجموعه‌ی حرارتی نیاز دارند (فتوحی و همکاران، 1385). دما و آب به صورت چشمگیری در تنظیم زمان و دوره‌ی گلدهی، توزیع گل، درصد تشکیل میوه و وضعیت نمو و ریزش میوه‌ی درختان مرکبات تأثیر دارند. مرکبات جهت رشد و نمو در مناطق مرطوب به میزان 750 و در مناطق خشک به 1500 میلی‌متر (15 هزار متر مکعب آب در هکتار) آب در سال نیاز دارند (خوشخوی و همکاران، 1373). سرما و یخبندان از جمله مسائل محیطی خطرساز برای مرکبات در کنار بیماری‌ها و آفات به شمار می‌روند.
بهترین نوع خاک برای کشت و کار مرکبات، خاک شنی- لومی می‌باشد، و همچنین در محدوده‌ی 5/5 تا 5/7 از pH عملکرد خوبی دارند. در بین محصولات باغی، مرکبات حساس‌ترین گروه به شوری خاک می‌باشند (خوشخوی و همکاران، 1364).
تاریخچه‌ی کشت درختان مرکبات در ایران و جهانمنشأ مرکبات را می‌توان جنوب شرق آسیا، چین و مجمع الجزایر هند و از 2400 سال قبل از میلاد مسیح دانست (جمیتر و هو، 1990). از کناره‌های جنوبی دریای مازندران نیز به‏ ‌عنوان دومین کانون گسترش کشت مرکبات نام برده می‌شود (الهی‌نیا ،1383). ورود مرکبات به ایران به جز گونه‌ی بالنگ، سابقه‌ای 400 ساله دارد. به استناد مدارک تاریخی، ایران دروازه‌ی خروج مرکبات از آسیا به سایر مناطق جهان بوده است (الهی‏نیا، 1383).
سطح زیر کشت، میزان تولید و عملکرد درختان مرکبات در ایران و جهانبر اساس گزارش آمار مرکبات وزارت کشاورزی در سال 1392، سطح زیر کشت مرکبات کشور در قالب سه ناحیه‏ی مرکزی، شمالی و جنوبی به میزان 288108 هکتار و میزان تولید 4299247 تن بوده است که این آمار نشانگر تمایل جمعیت برای مصرف و در نتیجه لزوم اهمیت بیشتر به تحقیقات و کشت این محصول در راه تامین نیازهای غذایی جمعیت رو به‏ افزایش کشور است.
تولید مرکبات کشور حدود 4 میلیون تن برآورد شده و 3/86 درصد آن از اراضی آبی حاصل شده است. راندمان تولید مرکبات آبی در کشور 6/16931 کیلوگرم در هکتار است. بیشترین و کمترین عملکرد آبی به ترتیب با 2/21832 و 7/438 کیلوگرم به استان‌های مازندران و لرستان تعلق دارد.
بر اساس آمار فائو در سال 2008، سطح زیر کشت مرکبات در دنیا 7/8 میلیون هکتار بوده و میزان متوسط تولید محصول مرکبات جهان 122 میلیون تن گزارش شده است. بررسی کشورهای عمده‌ی تولیدکننده‌ی مرکبات نشان‌ می‌دهد که از نظر سطح زیر کشت به ترتیب چین، برزیل، نیجریه، مکزیک، آمریکا، هند، اسپانیا و ایران مقام اول تا هشتم را به خود اختصاص داده‌اند. این در حالی است که براساس میزان تولید مرکبات، کشورهای برزیل، آمریکا، چین، مکزیک، اسپانیا، هند، ایتالیا و ایران به‌ترتیب در رده‌های اول تا هشتم قرار گرفته‌اند (آمار نامه کشاورزی، 1388). از لحاظ عملکرد مرکبات نیز به ترتیب آمریکا، ترکیه، آفریقای جنوبی، ژاپن و آرژانتین مقام‌های اول تا پنجم را دارا هستند درحالیکه ایران از این حیث در جایگاه دهم قرار می‌گیرد.
علی‌رغم وجود پتانسیل‌های لازم جهت کشت و کار مرکبات در کشور، اما وجود عوامل محدودکننده و همچنین عدم مدیریت صحیح باعث شده کشور ایران تنها 4/0 درصد از سهم تجارت جهانی مرکبات را داشته باشد (آمارنامه محصولات باغی، 1387)، که این موضوع نشان‌دهنده‌ی نیاز به انجام مطالعات بیشتر پیرامون این عوامل محدودکننده‌ی زیستی و غیر زیستی و مدیریت این عوامل با بهره‌گیری از دانش و تکنولوژی‌های نوین در راستای کاهش اثرگذاری آنها بر کشت و کار، تولید و صادرات این محصول می‌باشد.
اهمیت و انواع بیماری‌های مرکباتاهمیت بیماری‌های گیاهی برای انسان به علت خساراتی است که در نتیجه‌ی بیماری به گیاهان و فرآورده‌های آنها وارد می‌شود. بیماری‌های گیاهی ممکن است عامل محدودکننده‌ی کاشت یک گیاه در یک منطقه و یا یک کشور بوده و تمام گیاهان یک گونه را که به بیماری بخصوصی، حساس هستند نابود کند (اشکان، 1385).
علی‌رغم تفاوت‌های موجود از نظر میزان و نوع خسارت‌های مالی ناشی از بیماری‌ها، زارع مطلع و آگاه می‌تواند با استفاده از بهترین رقم موجود، روش‌های مبارزه‌ی زراعی، بیولوژیکی، ژنتیکی و شیمیایی، نه‌تنها مدیریت مناسبی برای محصول خود داشته باشد، بلکه حتی در سال‌هایی که دیگر باغات ضررهای زیادی متحمل شده‌اند، سود بیشتری بدست آورد.
تریستیزای مرکبات، اگزوکورتیس مرکبات، کیسه‌ی صمغی، جاروی جادوگر، گرینینگ، استابورن و شانکر باکتریایی مرکبات از جمله‌ی بیماری‌های مهم مرکبات در ایران و جهان به‏شمار می‌روند (اشکان، 1385).
تاریخچه و اهمیت بیماری شانکر مرکباتدر بین انواع بیماری‌های مرکبات، از بیماری‏های مهم که توسط عوامل بیماری‌زای باکتریایی رخ می‌دهد بیماری شانکر مرکبات می‌باشد، که در سال‌های اخیر میزان خسارت آن در اغلب کشورهای مرکبات‌خیز جهان از جمله ایران قابل توجه بوده است (گتوالد و سوون، 2002). این بیماری دامنه‌ی میزبانی وسیعی درگونه‌های گیاهی خانواده‌ی روتاسه دارد که در بین آنها برخی از ارقام مهم تجاری نظیر پرتقال و لیموترش خسارت شدیدی می‌بینند. شدت آلودگی بسته به نوع گونه، رقم و شرایط آب و هوایی مختلف متفاوت است (روزتی، 1977 و سیورولو، 1981 و 1999). شانکر باکتریایی مرکبات به دلیل انتشار و گسترش سریع، ریزش برگ و میوه، خسارت کمی و کیفی میوه و سرخشکیدگی یکی از بیماری‌های آسیب‏رسان مرکبات محسوب می‌شود (داس، 2003).
اختلافاتی بین دانشمندان محقق در این حوزه بر سر منشأ جغرافیایی این بیماری وجود دارد (داس، 2003). بیماری شانکر مرکبات در سال 1899 برای اولین بار در ژاپن بر روی برگ‏های واشنگتن ناول مشاهده گردید ولی نامی برای آن مشخص نشد (سیورولو، 1981)، برگر و همکاران(1914) شانکر را به‏عنوان بیماری جدیدی معرفی کردند (کویزومی، 1985). اما قدیمی‌ترین آثار از این بیماری مربوط به نمونه‌هایی از بالنگ در هرباریومی در انگلستان است که بین سال‌های 1827 تا 1831 از هندوستان جمع‌آوری شده بودند (داس و همکاران، 2003). فاوست و جنکینز (1933) این بیماری را منشأ گرفته از هند و جاوا دانسته‌اند.
این یافته‌ها نشان می‌دهد که منشأ بیماری در مناطق استوایی آسیا مانند جنوب چین، هند و اندونزی می‌باشد و از آنجا به سایر مراکز کشت و کار مرکبات مانند کشورهای حوزه‌ی خلیج فارس و همچنین آمریکا منتقل شده است (دوپسون، 1940). این بیماری همچنین در آمریکا در اوایل قرن بیستم توسط روزتی (1977)، در آفریقای جنوبی توسط Doidge (1916) و در استرالیا توسط Garnsey و همکاران (1979) گزارش شد (داس و همکاران، 2003).
در ایران شانکر آسیایی مرکبات برای اولین بار توسط علیزاده و رحیمیان (1368) در منطقه‌ی کهنوج از توابع استان کرمان بر روی لیمو مکزیکی شناسایی شد (علیزاده و رحیمیان، 1990).
نوع آسیایی شانکر باکتریایی مرکبات (پاتوتیپ A) در سال 1910 از طریق پونسیروس‌هایی که از ژاپن به‏عنوان نهال بذری، به ایالت فلوریدای آمریکا وارد شد (واترین و همکاران، 2000). در سال 1915 دولت فدرال آمریکا برنامه‌ی خود را در زمینه‌ی ریشه‌کنی این بیماری ابلاغ کرد و برای جلوگیری از شیوع پاتوژن، ریشه‌کنی درختان آلوده، به صورت قانون فدرال درآمد (لو، 2010). این بیماری احتمالاً از جنوب شرق آسیا به دیگر مناطق تولید کننده‌ی مرکبات انتشار یافته است (شرافتی و همکاران، 1392). علاوه بر ایالات متحده‌ی آمریکا، ریشه‌کنی این بیماری درکشورهای استرالیا، نیوزلند و آفریقای جنوبی هم صورت گرفته است و برنامه‌ی ریشه‌کنی در برزیل و اروگوئه به صورت فعال ادامه دارد (اسچاد و همکاران، 2006). نوع B در آمریکای جنوبی در سال 1923 مورد شناسایی قرار گرفت. این پاتوتیپ در آرژانتین، اروگوئه و احتمالاً پاراگوئه وجود دارد و برای اولین بار از روی لیمو جدا گردیده است (واترین و همکاران، 1995). پاتوتیپ C از برزیل در سال 1963 و نوع D در سال 1981 از مکزیک از نمونه‏های آلوده جداسازی گردید (اسچاد و همکاران، 2006).
بیماری به صورت همه‌گیر پس از آن در آرژانتین، استرالیا، برزیل، عمان، عربستان سعودی، جزیره‌ی ریونیون، ایالات متحده‌ی آمریکا و اروگوئه رخ داده است (گراهام و همکاران، 2004). بیش از هر محصولی از مرکبات، این بیماری دارای اثرات مضر بر لیمو ترش می‌باشد (آنینیموس، 2000).
با وجود اعمال قوانین قرنطینه‌ای در برخی کشورها به منظور جلوگیری از انتشار این بیماری، همانطور که در کشور ما به‏عنوان یک بیماری قرنطینه‌ای داخلی عنوان می‌گردد، ولیکن این بیماری همچنان در حال انتشار می‌باشد (اسکولتیس، 1987 و گوتو، 2000). هم اکنون به لحاظ جغرافیایی بیش از 30 کشور جهان از مناطق مختلف آسیا، اقیانوس آرام، مجمع الجزایر هند، آمریکای جنوبی و جنوب شرقی آمریکا درگیر با خسارات مربوط به این بیماری می‌باشند.
این بیماری به لحاظ اقتصادی با اثرات مختلفی که بر میوه و شاخ و برگ درختان مرکبات دارد، مانع از محصول‌دهی مطلوب و مناسب آن با توجیه اقتصادی می‌شود (گوتو، 1992). در سراسر جهان، سالانه میلیون‌ها دلار صرف مبارزه با این بیماری می‌شود که طی آن میلیون‌ها درخت نیز نابود خواهند شد. به طور مثال در فلوریدا طی دو مرحله در حد فاصل سال‌های 1933-1915 و همچنین 1985-1984 بالغ بر 20 میلیون اصل درخت با هزینه‌ای بالغ بر 25 میلیون دلار در راستای مبارزه با این بیماری از بین برده شد (اسکولتیس و همکاران، 1987).
عامل بیماریXanthomonas citri pv. citri به‏عنوان عامل بیماری شانکر باکتریایی مرکبات دارای 3 پاتوار و مشتمل بر 5 تیپ می‌باشد (استال و سیمور، 1983). citri، aurantifolia و citromelo سه پاتوار مربوط به این باکتری در قالب تیپ‌های A، B، C، D و E می‌باشند (گابریل، 2001). پاتوار citri و تیپ A آن دارای بیشترین دامنه‌ی میزبانی و اثر تخریبی برروی مرکبات است (واترین و همکاران، 2000). در آخرین دسته‌بندی صورت‌گرفته، این سه پاتوار به سطح گونه ارتقا پیدا کرده و نام آنها به ترتیب Xanthomonus citri pv.citri، X. fuscans pv. aurentifolii و X. alfalfa pv.citromelo تغییر یافته است (اسچاد، 2004).
در میان این تنوع، سویه‌های جدیدی معروف به A* و AW نیز شناسایی شده‌اند (ورنیر و همکاران، 1998و گراهام، 2001 و برونینگ و گابریل، 2003). سویه‌های A* در جنوب غرب آسیا (ایران) شناسایی گردیده‏اند و از طرفی سویه‏ی Aw در ناحیه‏ای از آمریکا مشاهده شده است ولیکن این دو از نظر بیماریزایی رفتاری شبیه به هم را دارند (علیزاده و رحیمیان، 1369 و سون وهمکاران، 1989 و گابریل، 2000).
دامنه‌ی میزبانی سویه‌های A* و AW محدود به لیموترش است اما، دلیل این محدودیت میزبانی مشخص نیست. مطالعات نشان می‌دهد که پراکنش فرم A* محدود به هند، کشورهای جنوب شرق آسیا و حوزه‌ی خلیج فارس، از جمله ایران می‌گردد. تفاوت بین سویه‌ها در نوع میزبان و پراکنش جغرافیایی آنها می‌باشد. تمام کولتیوارهای مرکبات مستعد بیماری شانکر هستند ولی از بین آنها لیمومکزیکی، لیموشیرین و گریپ‌فروت از بقیه حساس‌ترهستند (گتوالد و همکاران، 2002 وآشا و همکاران، 2003).
اعضای خانواده‌ی زانتوموناس در ارتباط با گیاه و وابسته به میزبان اختصاصی خویش می‌باشند و دارای دامنه‌ی میزبانی بسیار وسیعی هستند به طوری‌ که قابلیت آلودگی 240 جنس گیاهی در قالب 68 خانواده را دارا می‏باشند (هاوارد، 1993). اختصاصیت در نوع میزبان در این خانواده‌ی باکتریایی بسیار بالا می‌باشد به گونه‌ای که در برخی موارد محدود به گونه‌ای در جنس خاصی از گیاهان می‌شود (آشا و همکاران، 2003)، که این مهم به واسطه‌ی 140 پاتوار مختلف از این باکتری امکان‌پذیر می‏شود (هاوارد، 1993).
باکتری جنس Xanthomonas گرم منفی، میله‌ای شکل، دارای تاژک قطبی، قادر به تولید رنگدانه‌ی انحصاری زانتومونادین، رشد هوازی، عدم احیای نیترات به نیتریت، اکسیداز منفی و فاقد گرانول‌های پلی‌هیدروکسی بوتارات در سلول است (آشا و همکاران، 2003). کلونی‌های این باکتری به رنگ زرد و لعابی بوده و اندازه‌ی سلول‌های آن در ابعاد 6/0-2/0 در 9/20-8/0 میکرومتر بوده و حداقل و حداکثر رشد آن بین ºC5 و ºC32-28 می‌باشد و برای رشد به فاکتورهای رشدی چون متیونین2، گلوتامیک اسید3 و نیکوتینیک اسید4 و یا ترکیب هرسه نیازمند است (حسن‌زاده، 1384).
جدول1-1- بیماریزایی فرم‏های مختلف شانکر روی چهار گونه از مرکبات(اقتباس از برونینگ و گابریل، 2003).C. aurantifoliiC. limonC. pa–isiC. sinensisCanker group++++++++++++++A++++—A*++++-HR-Aw+++++++++B++++HRHRHRC + شانکر ضعیف، +++ شانکر قوی، – بدون علایم، HR علائم فوق‏حساسیت
A : استرین آسیا
B-strain (X. axonopodis pv. Aurantifolii): آمریکای جنوبی (آرژانتین، پاراگوئه و برزیل)
C-strain (X. axonopodis pv. Aurantifolii): برزیل
AW: مناطق ولینگتون، فلوریدا
A*: مناطق جنوب غربی آسیا
علایم و چرخه‌ی بیماری
شناسایی و اتصال به میزبان، نفوذ، تکثیر، آلودگی و انتشار از جمله مراحلی است که باکتری در برهمکنش با میزبان جهت ایجاد بیماری طی می‏کند (دوان و همکاران، 1999). علایم این بیماری شامل زخم‌های برآمده و نکروتیک مشخص بر روی برگ‌ها، بدشکلی میوه‌ها، ریزش پیش از موعد میوه، خشکیدگی سرشاخه‌ها و ضعف عمومی درخت می‌شود. البته این بیماری سیستمیک نمی‌باشد و باعث زخم‌های موضعی می‌شود (اسکولتیس و همکاران، 1987).
اندازه‌ی تاول‌ها به رقم مرکبات و سن گیاه بستگی دارد و ممکن است به 6 میلی‌متر برسد. برگ‌ها تا 6 هفتگی حساس هستند و به‏دلیل دوره‌ی کوتاه حساسیت تاول‌های روی برگ متنوع نیستند. میوه تا 40 روز پس از تشکیل حساس است و به همین دلیل تاول‌های ناشی از بیماری شانکر از نظر اندازه یکسان نیستند (سیورلو، 1981). در صورت وجود رطوبت آزاد در سطح تاول‌های(شانکرهای) برگ، شاخه و میوه، ترشحات حاوی باکتری از این شانکرها خارج و می‌تواند بافت‌های تازه و جدید را آلوده کند (گابریل و برونینگ، 2003).
میزبان حساس، شرایط محیطی مناسب شامل گرمای توأم با بارندگی و باد (بویژه طوفان‌های همراه با شن)، سابقه‌ی یخ‌زدگی در سال قبل و فعالیت آفت مینوز و همچنین وجود منبع عامل بیماری از جمله شرایط مناسب برای تکثیر و انتشار عامل بیماری و همه‌گیر شدن بیماری می‌باشد (نیوان، 1961).
ابزارهای ایجاد بیماری، تحت اختیار باکتریباکتری‌های بیماری‌زای گیاهی نیز مثل سایر پاتوژن‌ها جهت فائق آمدن بر سیستم‌های دفاعی فعال و غیر فعال گیاه نیازمند ابزارهایی جهت غلبه بر این سیستم و ایجاد بیماری در گیاه می‌باشد که بدین منظور ابزارهای مختلفی جهت تحقق این هدف در طول تکامل بسته به نیاز باکتری در آن ایجاد شده است.
شانکر باکتریایی مرکبات نیز که به وسیله‌ی Xcc ایجاد می‌شود، از مکانیسم‌های مختلفی جهت تکثیر در میزبان بهره می‌برد که در امتداد آن شناسایی و اتصال به میزبان به کمک ترکیبات فنلیک مترشحه از جانب گیاه و همچنین پروتئین ادهیسین و اگزوپلی‌ساکارید زانتان و بدنبال آن با بهره‌گیری از ژن‌های hrp و سیستم‌های ترشحی، افکتورهای بیماری‌زایی خود را به داخل سلول میزبان فرستاده که موجب تعدیل سیستم میزبان به نفع خود می‌شود (گوتو، 1985).
جذب، اتصال و ورود باکتری به گیاهاولین مرحله در واکنش بین گیاه و باکتری تشخیص و جذب باکتری به طرف ترکیبات مترشحه از اندام‌های هوایی و زخم است (تاکاشی، 1984) که این مرحله توسط پدیده‌ی شیموتاکسی صورت می‌گیرد. سیگنال‌هال اختصاصی در گیاه و پروتئین‌های تشخیصی در باکتری باعث ایجاد ارتباط می‌گردند. در واکنش گیاه- بیمارگر، باکتری به صورت مداوم تغییرات فیزیولوژیکی گیاه را مورد سنجش قرار می‌دهد. ادهسین، اگزوپلی‏ساکارید و لیپوپلی‏ساکارید از جمله ابزارهای تحت اختیار باکتری عامل شانکر در این راستا می‌باشند (گوتو و همکاران، 1979 و کینگسلی و همکاران، 1993). بعد از مرحله‌ی جذب، مرحله‌ی اتصال سلول‌های باکتریایی به سطح بافت گیاهی جهت ایجاد واکنش ضروری است. چندین فاکتور گیاهی در این واکنش نقش دارند، از جمله لکتین‌های گیاهی که به‏عنوان ناحیه‌ی گیرنده یا دریافت کننده‌ی ترکیبات پلی‌ساکاریدی خارج سلولی (EPS) مانند زانتان عمل می‌کنند. همچنین یک پروتئین غشا خارجی وابسته به Ca2+ به نام ادهسین ساخته می‌شود که در اتصال باکتری به دیواره‌ی سلولی میزبان نیز نقش دارد (اسکرکر و برگ، 2001). علاوه بر این باکتری‌ها برای این هدف دارای ضمایم سطحی هستند که به آنها فیمبریا و پیلوس می‌گویند که باعث چسبیدن باکتری به سطح بافت گیاهی می‌شوند (هی، 1998). ورود باکتری به درون بافت گیاهی به صورت غیر فعال و از محل روزنه‌ها و زخم‌ها صورت می‌گیرد (رابرت و رایان، 2011).
سیستم‌های ترشحی باکتریباکتری برای اینکه بتواند فاکتورهای بیماری‌زایی را به داخل سلول وارد کند از سیستم‌های ترشحی استفاده می‌کند. سیستم‌های صدور پروتئین در تمام ارگانیسم‌های زنده شامل باکتری‌های گرم منفی و ارگانل‌های یوکاریوتی مشتق از آنها حضور دارند (رابرت و رایان، 2011). در مقایسه با موجودات دیگر، باکتری‌های گرم منفی سیستم‌های مستقل بسیاری را برای صدور پروتئین دارا می‌باشند که شامل 5 سیستم در باکتری زانتوموناس می‌باشد که در یک تقسیم‌بندی می‌توان، آنها را در قالب 2 گروه بررسی کرد، گروهی که طی یک مرحله وابسته به انرژی پروتئین را از عرض غشای داخلی و خارجی باکتری عبور داده و آنرا به فضای آپوپلاستی یا حتی درون سلول میزبان تزریق می‌کند که شامل سیستم‌های نوع I، III و IV هستند و همچنین گروهی دیگر که عمل انتقال را طی دو مرحله صورت می‌دهند که شامل سیستم‌های نوع II و V می‌باشند و وابسته به مسیرهای عمومی ترشح یعنیsec و tat می‌باشند (آشا و همکاران، 2003).
آزمایش‌های انجام شده نشان می‌دهد که سیستم‏های ترشحی باکتری‌ در بیماری‌زایی آن نقش مهمی را ایفا می‏کنند که از این نظر سیستم ترشحی نوع سوم از اهمیت بسزایی برخوردار می‏باشد (کانگ و همکاران، 2002) که در ادامه به معرفی این سیستم ترشحی و اجزا آن می‏پردازیم.
سیستم ترشحی نوع III (TTSS)
سیستم ترشحی نوع III ابزاری تحت اختیار باکتری جهت جابه‌جایی پروتئین‌های بیماری‌زا به درون سیتوسول سلول‌های میزبان می‏باشد (دانگر و همکاران، 2005). پروتئین‌های سیستم ترشحی تیپ III که توسط خانواده‌ی ژنی hrp در باکتری‌های گرم منفی از جمله باکتری زانتوموناس کد می‌شوند را به چهار گروه ساختاری، افکتور، چاپرون و تنظیمی می‏توان تقسیم کرد (زیمارو و همکاران، 2011).
مکانیسم صادر کننده‌ی TTSS معمولاً متشکل از 20 پروتئین مختلف و شامل پروتئین‌های محلول سیتوپلاسمی، پروتئین‌های غشای خارجی و پروتئین‌های غشای داخلی است (هووک، 1998 و بوخنر و بوناس، 2002).TTSS باکتری‌ها را قادر می‌سازند که یک تنوعی از افکتورها را مستقیماً به سیتوسول میزبان بفرستند و باعث دستکاری پروسه‌های سلولی میزبان شوند و به‏نفع باکتری آنها را از درون تخریب کنند (کلمنت، 1983). ژن‌های کد کننده‌ی سیستم ترشحی تیپ III روی عناصر ژنتیکی غیر پایدار، پلاسمیدها و جزایر پاتوژنیستی واقع شده‌اند که شامل خانواده‌ی ژنی hrp در Xanthomonas citri و سایر باکتری‌های گرم‏ منفی و بیماری‌زای گیاهی می‌باشند (آلفانو و کولمر، 1997 و بوخنر و بوناس، 2002).
در xcc مانند سایر پاتوژن‌های گیاهی ژن‌های کد کننده‌ی TTSS درون یک گروه بیماریزاییدسته‌بندی می‌شوند (هکر و کپر، 2000). تشریح ژنتیکی TTSS برای اولین بار در P.syringae با کشف موتانت hrp پاتوژن لوبیا pss آغاز شد که توانایی ایجاد پاسخ فوق‏حساسیت در گیاهان غیر میزبان مانند توتون و بیماری‌زایی را در لوبیا از دست داد (دانگر، 2005).
ژن‌های hrp و نقش دوگانه‌ی آنهاژن‌های hrp که تا کنون فقط در باکتری‌های گرم منفی دیده شده است، ژن‌هایی هستند که وجود آنها در این باکتری‌ها برای قابلیت ایجاد نشانه‌های مشهود بیماری برگیاه میزبان و همچنین القای فوق‏حساسیت بر روی برخی از گیاهان که به طور طبیعی به آن باکتری آلوده نمی‌شوند ضروری است. توانایی باکتری در تکثیر و رسیدن به جمعیت‌های بالا در گیاه حساس، تراوش سلولی و تولید پروتئین‌های هارپین از دیگر اعمالی است که در باکتری به کمک این گروه ژنی انجام می‏شود (لیندگرن، 1997 و هیث، 2000).
بیان ژن‌های hrp تحت تأثیر شرایط محیطی و در ارتباط با میزبان می‌باشد که باکتری با استفاده از مکانیسم Q.S از شرایط محیطی اطراف خود آگاه و باعث القا یا مهار بیان ژن‌های مذکور می‌شود (باسلر، 1999 و اسلتر و همکاران، 2000). ژن‌های مربوط به کلاستر hrp در باکتری عامل شانکر توسط پروتئین‌های HrpX و HrpG کنترل می‌شوند (بگدانف و همکاران، 1996).
اغلب گونه‌های باکتریایی دارای دو مجموعه‌ی متمایز ژن hrp هستند که در قالب دو گروه تنظیمی و کاربردی مطرح می‌شوند. بیان ژن‌های hrp در حضور بعضی مواد غذایی، به وسیله‌ی ژن‌های تنظیمی دیگر باکتری‌ها و توسط مولکول‌‌های علامت دهنده‌ی گیاهی کنترل می‌شوند (استال، 1989). این گروه ژنی دومنظوره تحت عنوان کلاستر ژنی hrp برای اولین بار در Pseudomonas syringae شناسایی و مورد مطالعه قرار گرفت (لیندگرن و همکاران، 1986). اولین گزارش مربوط به ژن‌های hrp در جنس Xanthomonas توسط Stall (1989) و در زیرگونه‌ی campestris مورد چاپ و نشر قرار گرفت (آرلات و همکاران، 1991).
همچنین این کلاستر ژنی در Xanthomonas campestris pv. visicatoria (بوخنر و بوناس، 2002) در X. oryzae pv. oryzae (زو و همکاران، 2000) و همچنین درX. a Pv. Glycines (کیم و همکاران، 2003) مورد مطالعه قرار گرفته است. مجموعه ‌ژن‌های کلاستر ژنی hrp دارای همولوژی بالایی نسبت به هم در گونه‌های مختلف زانتوموناس می‌باشند (کاناموری و همکاران، 1999). با انجام مطالعاتی مثل غیر فعال سازی ژن‌های مختلف hrp با جهش‌های هدفمند می‌توان به نقش آنها چه در بیماری‌زایی و چه در القایHR پی‌برد، در مطالعه‌ای با جهش بر روی hrpB، hrpD و hrpF که در سال 2005 توسط Dunger صورت گرفت به روشنی به این مهم اشاره می‌کند.
پروتئین HrpN به‏عنوان اولین السیتیور القا کننده‌ی واکنش فوق حساسیت در دهه‌ی 1990 معرفی شده است (مالونی و همکاران، 2005). همچنین ژن pthA به‏عنوان اولین السیتیور محرک بیماری در زانتوموناس می‌باشد که مورد مطالعه در این گونه قرار گرفته است (سواروپ، 1999). در کلاستر hrp، 9 ژن به صورت حفاظت شده در جنس‌های مختلف باکتری‌های گرم منفی و بیماری‌زای گونه‌های جانوری و گیاهی عمدتاً در شکل‌گیری ترانسلوکون در سیستم ترشحی نوع III فعال هستند که hrc نامیده می‌شوند (بوخنر و بوناس، 2002). این گروه ژنی عموماً در ناحیه‌ی کروموزومی و با اندازه‌ای حد فاصل بین kb 30-20 قرار دارند (لی، 2012).
نواحی مربوط به ژن‌های hrc-hrp در باکتری‌های پاتوژن ناحیه‏ی بیماری‌زایی نامیده می‌شوند (تاکور و سوهال، 2013). ژن‌های hrp حداقل دو عملکرد تنظیم بیان سایر ژن‌ها و سنتز پروتئین‏های هارپین، را عهده‏دار هستند و به طور کلی این ژن‌ها با همکاری سایر ژن‌ها مانند ژن‌های avr به‏صورت یک پازل در ایجاد واکنش فوق حساسیت و مقاومت به بیماری عمل می‌کنند (بوخنر و بوناس، 2002).
hpaG اولین هارپین جداسازی شده از گونه‌ی زانتوموناس می‌باشد که با موفقیت و با بهره‌گیری از علم مهندسی ژنتیک و DNA نوترکیب علیه ویروس موزاییک توتون و القای پاسخ فوق حساسیت با موفقیت بررسی شده است (لی و همکاران، 2005). قابلیت القای پاسخ HR در برابر ویروس موزاییک توتون در مورد هارپین‌های hrpG و hrpX نیز به اثبات رسیده است (آلفانو و کولمر، 1997).
هارپین حاصله از بیان ژن hrpN در پژوهشی توسط دکتر حبشی و همکاران وی (1387) در مرکز بیوتکنولوژی کشاورزی کرج برعلیه بیماری آتشک در دو گیاه سیب و گلابی تست شده که تأیید کننده‌ی اثر هارپین‌ها در القای پاسخ دفاعی فوق حساسیت برعلیه بیماری مزبور در دو گیاه مورد مطالعه می‏باشد.
هارپین‌ها و نقش آنها در القای پاسخHRفوق حساسیت نوعی پاسخ دفاعی یا به‏عبارتی فرآیند سریع مرگ سلولی در موضع عمل بیمارگر در گیاه می‌باشد که توسط استکمن (1915) در بیماری‏های قارچی و 50 سال بعد در بیماری‌های باکتریایی توسط گودمن (1965) کشف و مورد مطالعه قرار گرفت (محمدی، 1381). ویروس موزاییک توتون، پژمردگی فوزاریومی در پنبه و همچنین آتشک گلابی از جمله‌ بیماری‌های گیاهی می‌باشند که با استفاده از هارپین‌ها توانسته‌اند میزبان‌های آنها را برعلیه فیتوپاتوژن مربوطه متحمل نمایند (دونا و همکاران، 1999).
هارپین‌ها ممکن است با هم تشکیل دایمر دهند که این موضوع می‌تواند به برهمکنش بهتر پاتوژن با غشای گیاه کمک نماید و یا به عبارتی باعث تقویت هارپین در راستای عمل مربوطه در گیاه ‌باشد (هیث، 2000). این پروتئین‌های غنی از گلایسین، کوچک و مقاوم در برابر حرارت و شرایط اسیدی توسط باکتری و در پاسخ به شرایط محدود محیطی تولید می‌شوند، بنابراین تولید و خالص‌سازی آنها در محیط کشت و به کمک کشت بافت کار مشکلی می‌باشد (لیندگرن، 1997)، صفات مربوط به هارپین‌ها در گونه‌ی زانتوموناس با توجه به اینکه شناسایی و توالی‌یابی شده‌اند همچنان تا حد زیادی ناشناخته‏اند (دونگر و همکاران، 2005)، از طرفی بازدارنده‌های متابولیسم گیاهی می‌توانند مانع از عمل هارپین‌ها شوند، به‏عبارت دیگر می‌توان این‌چنین برداشت کرد که در هنگام آلوده شدن گیاه به بیماری و در پاسخ به حضور هارپین در داخل گیاه تولید مهارکننده‌های متابولیسم گیاهی به منظور ممانعت از عمل هارپین‌ها در گیاه و همچنین به‏عنوان سیگنالی در جهت فعال‌سازی مسیرهای دفاع عمومی گیاه برای القای پاسخ فوق حساسیت و در نتیجه بالا بردن آستانه‌ی تحمل گیاه در برابر بیمارگر القا می‌شوند (زیمارو و همکاران، 2011).
بهره‌گیری از مهندسی ژنتیک در مقاومت به بیماری‌هامقاومت در برابر بیمارگرها، آفات و همچنین عوامل غیر زنده‌ی محیطی که در تقابل با اهداف انسانی و در تعامل با گیاه می‌باشند همواره در راستای کاهش اثرات سوء آنها بر عملکرد و کیفیت محصولات گیاهی مورد توجه بوده است. راه‌های مبارزه‌ای بسیاری اعم از راهکارهای به‌زراعی، مبارزه‌ی شیمیایی و یا مکانیکی و همچنین روش‌های بیولوژیکی و روش‌های نوین وابسته به تکنیک‌های مهندسی ژنتیک وجود دارد که بسته به شرایط می‌توانند مورد استفاده قرار گیرند.
در میان راهکارهای متنوع برای بهبود مقاومت گیاهان به بیماری‌های باکتریایی به واسطه‌ی مهندسی ژنتیک، تولید پپتیدهای ضد باکتریایی با منشأ غیر گیاهی، مهار بیماری‌زایی باکتری یا فاکتورهای بیماری‌زایی، تقویت واکنش‌های دفاعی طبیعی گیاه و القای مرگ برنامه‌ریزی‌شده به طور مصنوعی در جایگاه آلودگی را می‌توان نام برد. مهندسی ژنتیک تظاهر


جداسازی و همسانه‏سازی ژن‏های93 hrpW و hrpG جهت انتقال به لیمو ترش در راستای ایجاد مقاومت به شانکر مرکبات پایان نامه ها
قیمت: 11200 تومان

این نوشته در پایان نامه ها ارسال شده است. افزودن پیوند یکتا به علاقه‌مندی‌ها.

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *