تغییرات بیان ژن های مرتبط با مقاومت در گیاه آرابیدوپسیس پس از مایه زنی با باکتری Pseudomonas syringae pv. syringae

دانشکده کشاورزی
پایاننامهی کارشناسیارشد در رشته مهندسی کشاورزی- بیماریشناسی گیاهی
تغییرات بیان ژن های مرتبط با مقاومت در گیاه آرابیدوپسیس پس از مایه زنی با باکتری Pseudomonas syringae pv. syringae
بهکوشش
سید حسین میرزابابایی
استادان راهنما
دکتر علی‌رضا افشاریفر
دکتر محمد جواهری
تابستان 1393

تقدیم به
سه وجود مقدس؛آنانکه ناتوان شدند تا ما به توانایی برسیم موهایشان سپید شد تا ما روسفید شویمو عاشقانه سوختند تا گرمابخش وجود ما و روشنگر راهمان باشند پدر عزیزم
مادر مهربانم
و اساتید بزرگوارم
ﺳﭙﺎﺳﮕﺰﺍﺭی
«من لم یشکر المخلوق لم یشکر الخالق»
خداوند بزرگ و منان را بسیار شاکر و سپاسگزارم که به من توفیق داد تا سرافراز و خشنود این پژوهش را به اتمام برسانم. قبل از هر چیز برخود لازم می‌دانم که مراتب سپاس، قدردانی و تشکر بی‌نهایت خود را از جناب آقایان دکتر علی‌رضا افشاریفر و دکتر محمد جواهری که راهنمایی بنده را در این پژوهش قبول نموده و در طول انجام این امر در نهایت تواضع، فروتنی و بردباری همواره پاسخگوی مسائل و مشکلات بنده بودند، ابراز دارم. از استاد مشاور گرامیم آقای دکتر سیدمحسن تقوی که در کمال گشاده‌رویی از هیچ کمک و راهنمایی نسبت به اینجانب دریغ نفرمودند، نهایت تشکر را دارم. ممنون و سپاسگزار محبت‌ها و همدلی‌های دوستان عزیزم آقایان و خانم‌ها، مقدم، صادقی، حسین زاده، ایراندوست، شرافتی، خنشا، میری، جلالی، مرادی، بی‌تعب، خالقی و پوی هستم. از کلیه کارکنان محترم بخش گیاهپزشکی، بخش ویروس شناسی گیاهی و بخش بیوتکنولوژی به ویژه خانم ها داوودی، دهشکار و آرام و آقای زارع که در طی انجام پایان‌نامه همکاری‌های لازم را نسبت به بنده مبذول داشتند کمال تشکر و قدردانی را دارم. در نهایت موفقیت خود را مرهون و مدیون زحمات بی‌شائبه پدر و مادر خوبم که همواره در تمام طول زندگی‌ام در کنارم بودند و مرا حمایت و پشتیبانی کردند، می‌دانم.

چکیده
تغییرات بیان ژن های مرتبط با مقاومت در گیاه آرابیدوپسیس پس از مایه زنی با باکتری Pseudomonas syringae pv. syringae
به کوشش
سید حسین میرزابابایی
باکتری Pseudomonas syringae pv. syringae (Pss) بیمارگر مخربی است که دارای دامنه میزبانی بسیار وسیعی میباشد بهطوریکه به بیش از 180 گونه گیاهی حمله میکند. مهمترین میزبانهای این بیمارگر درختان میوه هستهدار، درختان میوه دانهدار و گیاهان علفی میباشد. به علت هم-تکاملی با بیمارگرها، گیاهان چندین مکانیسم دفاعی را برای حفاظت از خودشان ایجاد نموده اند. تجمع پروتئین های مرتبط با بیماریزایی مانند PR1, LOX2, PDF1.2و VSP2 یکی از مکانیسم های مقاومت گیاه به بیمارگر است. ایجاد گیاهان مقاوم، یکی از مهمترین استراتژی ها در مدیریت بیماری در محصولات زراعی و درختان میوه مختلف است. تشخیص مکانیسم های درگیر در پاسخ های گیاهان علیه بیمارگرها، می تواند تولید ارقام مقاوم را تسهیل کند و در این راستا، تشخیص ژن های درگیر در مقاومت گیاه میزبان می تواند گام سودمندی در توسعه ارقام مقاوم باشد. هدف از تحقیق حاضر بررسی الگوی تغییر بیان ژن PR1 (دخیل در مسیرهای دفاعی وابسته به سالیسیلیک اسید و محدود کننده بیمارگرهای بیوتروف)، و ژن های LOX2, PDF1.2 و VSP2 (دخیل در مسیرهای دفاعی وابسته به جاسمونیک اسید محدود کننده بیمارگرهای نکروتروف و حشرات گیاهخوار)، در گیاه آرابیدوپسیس مایه زنی شده به Pss و در دو فاز مختلف رویشی و زایشی بود. نمونه های گیاه آرابیدوپسیس در زمان های 0، 24، 48 و 72 ساعت پس از مایه زنی جمع آوری شد و میزان جمعیت باکتری Pss در سطح گیاه نیز در این زمانها مورد بررسی قرار گرفت. سپس RNA کل استخراج شد و سنتز cDNA و تغییرات بیان چهار ژن با استفاده از روش Real time RT-PCR سنجیده شد. نتایج کلی نشان داد که گیاهان آرابیدوپسیس از مسیر دفاعی وابسته به سالیسیلیک اسید برای مقاومت به باکتری Pss استفاده نموده است و این که در فاز زایشی نسبت به فاز رویشی این مقاومت بیشتر می باشد. همچنین همکنش بین دو مسیر دفاعی وابسته به SA و JA نیز به اثبات رسید.
کلمات کلیدی: مقاومت سیستمیک اکتسابی، مقاومت سیستمیک القایی، بیان ژن، پروتئین های مرتبط با بیماریزایی

فهرست مطالبعنوان صفحه TOC \o “1-3” \h \z \u
فصل اول PAGEREF _Toc401955910 \h 11-1- مقدمه PAGEREF _Toc401955911 \h 21-2- اهداف PAGEREF _Toc401955912 \h 3فصل دوم: پیشینه پژوهش PAGEREF _Toc401955913 \h 52-1- خصوصیات کلی Pss PAGEREF _Toc401955914 \h 62-1-1- موقعیت تاکسونومیکی PAGEREF _Toc401955915 \h 62-1-2- تولید فایتوتوکسین توسط Pss PAGEREF _Toc401955916 \h 72-1-3- دامنه میزبانی PAGEREF _Toc401955917 \h 72-1-4- بیماریزایی P. syringae PAGEREF _Toc401955918 \h 82-2- آرابیدوپسیس PAGEREF _Toc401955919 \h 92-3- واکنش Real-time RT-PCR PAGEREF _Toc401955920 \h 102-3-1- بیان ژن (Gen Expression) PAGEREF _Toc401955921 \h 112-4- دفاع در گیاهان PAGEREF _Toc401955922 \h 112-4-1- مقاومت ساختاری و القایی PAGEREF _Toc401955923 \h 122-4-2- مقاومت سیستمیک اکتسابی Sys–ic Aquired Resistance (SAR) PAGEREF _Toc401955924 \h 142-4-3- مقاومت سیستمیک القایی Induced Sys–ic Resistance (ISR) PAGEREF _Toc401955925 \h 172-4-4- پاسخ دفاعی PAGEREF _Toc401955926 \h 182-4-5- سیگنال های موجود در مقاومت به بیماری های گیاهی PAGEREF _Toc401955927 \h 182-4-6- تشخیص الیسیتورهای باکتریایی توسط سلول های گیاهی PAGEREF _Toc401955928 \h 212-4-7- همکنش گیاه- Pseudomonas syringae PAGEREF _Toc401955929 \h 242-4-8- تغییرات در سطح سلول PAGEREF _Toc401955930 \h 262-5- نقش دفاعی هورمون ها در گیاهان PAGEREF _Toc401955931 \h 272-5-1- هورمون سالیسیلیک اسید PAGEREF _Toc401955932 \h 292-5-2- هورمون جاسمونیک اسید PAGEREF _Toc401955933 \h 292-5-3- هورمون اتیلن PAGEREF _Toc401955934 \h 292-5-4- هورمون آبسیزیک اسید PAGEREF _Toc401955935 \h 302-5-5- هورمون اکسین PAGEREF _Toc401955936 \h 312-6- همکنش مسیر های هورمونی (Cross-talk) PAGEREF _Toc401955937 \h 322-6-1- اثر آنتاگونیستی SA بر سیگنالینگ JA PAGEREF _Toc401955938 \h 362-7- القاگرهای شیمیایی دفاعی در گیاهان PAGEREF _Toc401955939 \h 372-8- بررسی تعدادی از ژن های مرتبط با دفاع در گیاهان PAGEREF _Toc401955940 \h 382-8-1- ژن PDF1.2 PAGEREF _Toc401955941 \h 382-8-2- ژن VSP2 PAGEREF _Toc401955942 \h 382-8-3- ژن LOX2 PAGEREF _Toc401955943 \h 392-8-4- ژن PR1 PAGEREF _Toc401955944 \h 402-9- ملاحظات PAGEREF _Toc401955945 \h 40فصل سوم: مواد و روش ها PAGEREF _Toc401955946 \h 423-1- تهیه باکتری Pss PAGEREF _Toc401955947 \h 433-1-1- خالص سازی باکتری PAGEREF _Toc401955948 \h 433-1-2- آزمون تولید لوان PAGEREF _Toc401955949 \h 433-1-3- آزمون تولید رنگ فلورسنت PAGEREF _Toc401955950 \h 443-1-4- آزمون اکسیداز PAGEREF _Toc401955951 \h 443-1-5- آزمون واکنش فوق حساسیت (HR) PAGEREF _Toc401955952 \h 443-1-6- اثبات بیماری زایی روی گیاه گوجه فرنگی PAGEREF _Toc401955953 \h 443-1-7- آزمون واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) PAGEREF _Toc401955954 \h 453-2- کاشت گیاه آرابیدوپسیس PAGEREF _Toc401955955 \h 473-2-1- محیط کشت آرابیدوپسیس PAGEREF _Toc401955956 \h 473-2-2- شرایط گلخانه PAGEREF _Toc401955957 \h 483-2-3- مایه زنی با Pss PAGEREF _Toc401955958 \h 493-2-4- نمونه برداری PAGEREF _Toc401955959 \h 493-3- بررسی میزان جمعیت باکتری Pss PAGEREF _Toc401955960 \h 503-4- استخراج DNA PAGEREF _Toc401955961 \h 513-4-1- طرز تهیه بافر CTAB PAGEREF _Toc401955962 \h 523-4-2- تهیه کلروفرم- ایزوآمیل الکل PAGEREF _Toc401955963 \h 523-5- استخراج RNA از بافت PAGEREF _Toc401955964 \h 523-5-1-تهیه آب تیمار شده با DEPC PAGEREF _Toc401955965 \h 533-5-2- تعیین کمیت و کیفیتRNA PAGEREF _Toc401955966 \h 543-5-3- تیمار DNase PAGEREF _Toc401955967 \h 543-5-4- توقف تیمار DNase PAGEREF _Toc401955968 \h 543-5-5- سنتز رشته اول cDNA با استفاده از RNA استخراج شده PAGEREF _Toc401955969 \h 553-5-6- تکثیر قطعه مورد نظر با استفاده از واکنش زنجیره‏ای پلیمراز PAGEREF _Toc401955988 \h 563-5-7- اسامی و توالی آغازگرهای مورد استفاده برای بررسی بیان ژن ها PAGEREF _Toc401955989 \h 573-6- واکنش Real-time RT-PCR (Relative) PAGEREF _Toc401955990 \h 573-6-1- واکنش Real-time RT-PCRژن های مقاومت و ژن کنترل داخلی PAGEREF _Toc401955991 \h 583-6-2- روش نرمال سازی نسبی بیان ژن ها PAGEREF _Toc401956004 \h 593-6-3-آنالیز آماری بیان ژن ها PAGEREF _Toc401956005 \h 59فصل چهارم: نتایج PAGEREF _Toc401956006 \h 604-1- آزمون های تشخیصی اولیه PAGEREF _Toc401956007 \h 614-1-1- استفاده از PCR جهت تشخیص Pss PAGEREF _Toc401956008 \h 624-2- بررسی جمعیت باکتری پس از مایه زنی PAGEREF _Toc401956009 \h 624-3- استخراج Total RNA از بافت گیاه PAGEREF _Toc401956010 \h 644-3-1- تعیین کیفیت Total RNA PAGEREF _Toc401956011 \h 644-3-2- تعیین غلظت Total RNA با استفاده از نانودراپ PAGEREF _Toc401956012 \h 644-3-3- تیمار DNase PAGEREF _Toc401956013 \h 654-3-4- بررسی صحت سنتز cDNA PAGEREF _Toc401956014 \h 664-5- بررسی بیان ژن ها PAGEREF _Toc401956015 \h 664-5-1- ژن PR1 PAGEREF _Toc401956016 \h 674-5-2- ژن VSP2 PAGEREF _Toc401956017 \h 684-5-3- ژن PDF1.2 PAGEREF _Toc401956018 \h 704-5-4- ژن LOX2 PAGEREF _Toc401956019 \h 714-5-5- الگوی بیان ژن ها در دو فاز مختلف رویشی و زایشی گیاهان آرابیدوپسیس PAGEREF _Toc401956020 \h 73فصل پنجم: بحث PAGEREF _Toc401956021 \h 755-1- بحث PAGEREF _Toc401956022 \h 765-2- بررسی دفاع ذاتی وابسته به هورمون های سالیسیلیک اسید و جاسمونیک اسید PAGEREF _Toc401956023 \h 775-3- آنالیز مقایسه ای تغییرات بیان ژن ها PAGEREF _Toc401956024 \h 793-۵-1- بررسی پاسخ ژن PR1 علیه Pss PAGEREF _Toc401956025 \h 793-۵-2- بررسی پاسخ ژن PDF1.2 علیه Pss PAGEREF _Toc401956026 \h 815-3-3- بررسی پاسخ ژن LOX2 علیه Pss PAGEREF _Toc401956027 \h 823-۵-4- بررسی پاسخ ژنVSP2 علیه Pss PAGEREF _Toc401956028 \h 835-4- تعیین جمعیت باکتری PAGEREF _Toc401956029 \h 845-5- نتیجه گیری نهایی PAGEREF _Toc401956030 \h 855-5-1- دو فرضیه احتمالی برای بیان مسیر وابسته به JA بلافاصله بعد از مسیر وابسته به SA PAGEREF _Toc401956031 \h 86پیشنهادات PAGEREF _Toc401956032 \h 90منابع PAGEREF _Toc401956033 \h 91
فهرست شکل هاعنوان صفحه
TOC \h \z \t “Chart,2,Normal + (Complex) B Nazanin,1” شکل 3-1- کاشت گیاهان آرابیدوپسیس در سیستم هیدروپونیک PAGEREF _Toc401956935 \h 49شکل 4-1- انجام واکنش HR در گیاه توتون و شمعدانی وآزمایش بیماریزایی در گیاه گوجه فرنگی PAGEREF _Toc401956936 \h 61شکل 4-2- الکتروفورز محصول PCRتشخیصی با استفاده از جفت آغازگرهای B2 و B1 PAGEREF _Toc401956937 \h 62شکل 4-3- بررسی جمعیت باکتری در زمان های نمونه برداری پس از مایه زنی در دو فاز مختلف رویشی و زایشی PAGEREF _Toc401956938 \h 63شکل 4-4- الکتروفورز Total RNA استخراج شده از بافت ها PAGEREF _Toc401956939 \h 64شکل 4-5- طیف جذب نوری Total RNA استخراج شده با استفاده از نانودراپ PAGEREF _Toc401956940 \h 65شکل 4-6- الکتروفورز محصول PCR بعد از تیمار DNase PAGEREF _Toc401956941 \h 65شکل 4-7- الکتروفورز محصول PCR پس از سنتز cDNA PAGEREF _Toc401956942 \h 66شکل 4-8-تغییرات بیان ژن PR1 در دو فاز رویشی و زایشی و تیمار های زمانی 24، 48 و 72 ساعت پس از مایه زنی PAGEREF _Toc401956943 \h 68شکل 4-9- تغییرات بیان ژن VSP2 در دو فاز رویشی و زایشی و تیمار های زمانی 24، 48 و 72 ساعت پس از مایه زنی PAGEREF _Toc401956944 \h 69شکل 4-10-تغییرات بیان ژن PDF1.2 در دو فاز رویشی و زایشی و تیمار های زمانی 24، 48 و 72 ساعت پس از مایه زنی PAGEREF _Toc401956945 \h 71شکل 4-11-تغییرات بیان ژن LOX2 در دو فاز رویشی و زایشی و تیمار های زمانی 24، 48 و 72 ساعت پس از مایه زنی PAGEREF _Toc401956946 \h 72شکل 4-12- الگوی تغییرات بیان ژن ها در فاز رویشی گیاهان PAGEREF _Toc401956947 \h 74شکل 4-13- الگوی تغییرات بیان ژن ها در فاز زایشی گیاهان PAGEREF _Toc401956948 \h 74فهرست جداولعنوان صفحه TOC \h \z \t “Table,2,Normal + (Complex) B Nazanin,1” جدول 3-1- نوع و مقدار مواد لازم برای انجام واکنش 25 میکرولیتری PCR جهت تشخیص Pss PAGEREF _Toc401957093 \h 45جدول 3-2- سیکل دمایی PCR با آغازگرهای B1-B2 برای تشخیص Pss PAGEREF _Toc401957094 \h 46جدول3-3- نوع و مقدار عناصر غذایی محیط کشت هوگلند PAGEREF _Toc401957095 \h 48جدول 3-4- مقادیر و نوع مواد مورد نیاز برای تهیه 100 میلی لیتر بافر CTAB PAGEREF _Toc401957096 \h 52جدول 3-5- نوع و مقدار مواد مورد نیاز برای تیمار DNase PAGEREF _Toc401957097 \h 54جدول 3-6- نوع و مقدار مواد مورد استفاده در سنتز رشته اول cDNA در مرحله اول PAGEREF _Toc401957098 \h 55جدول 3-7- نوع و مقدار مواد مورد استفاده در سنتز رشته اول cDNA در مرحله دوم PAGEREF _Toc401957099 \h 55جدول 3-8- نوع و مقدار مواد لازم برای انجام یک واکنش 20 میکرولیتری PCR PAGEREF _Toc401957100 \h 56جدول 3- 9- سیکل دمایی PCR با آغازگر ef1-α PAGEREF _Toc401957101 \h 56جدول 3-10- اسامی و توالی آغازگرهای مورد استفاده برای بررسی بیان ژن ها PAGEREF _Toc401957102 \h 57جدول 3-11- سیکل دمایی مورد استفاده در واکنش Real-time RT-PCR PAGEREF _Toc401957103 \h 58جدول3-12- نوع و مقدار مواد مورد استفاده در واکنش 20 میکرولیتری Real-time RT-PCR برای ژن های اصلی و کنترلی داخلی PAGEREF _Toc401957104 \h 58جدول 4-1- مقایسه میانگین جمعیت باکتری Pss در دو فاز مختلف زایشی و رویشی PAGEREF _Toc401957105 \h 63جدول 4-2- مقایسه میانگین بیان ژن PR1 PAGEREF _Toc401957106 \h 67جدول 4-3- مقایسه میانگین بیان ژن VSP2 PAGEREF _Toc401957107 \h 68جدول 4-4- مقایسه میانگین بیان ژن PDF1.2 PAGEREF _Toc401957108 \h 70جدول 4-5- مقایسه میانگین بیان ژن LOX2 PAGEREF _Toc401957109 \h 71
فصل اول1-1- مقدمهیکی از مهمترین عوامل بیماریزا در گیاهان باکتری های وابسته به جنس Pseudomonas هستند. این گروه از باکتری ها جزو مهمترین بیمارگرهای گیاهی بوده که نقش عمده ای در پایین آوردن کمیت و کیفیت محصولات کشاورزی داشته و دارای گسترش جهانی نیز می باشند، و بیماری هایی از قبیل لکه برگی، بلایت، پژمردگی آوندی، پوسیدگی نرم، شانکر و گال در گیاهان مختلف ایجاد می کنند.
یکی از بیماری های مهمی که توسط باکتری های این گروه ایجاد می شود شانکر باکتریایی درختان میوه هسته دار می باشد که توسط Pseudomonas syringae pv. syringae (Pss) ایجاد می شود و یکی از معضلات کشاورزان در سراسر جهان به شمار می رود .(Vicente et al., 2004) این بیماری خسارت زیادی وارد می سازد و سبب خشک شدن نهال ها و درختان جوان، کاهش محصول در درختان مسن و گاهی خشکیدگی جوانه ها و گل های درختان بیمار می شود و معمولاً در باغ های جوان موجب نابودی درختان به میزان 10 تا 75 درصد می شود (Agrios, 2005). باکتری عامل بیماری شانکر اولین بار از یاس جداسازی و در سال 1902 به این نام نامگذاری شد (Hirano and Upper, 2000). در ایران اولین بار بیماری شانکر باکتریایی از درختان زردآلو در اصفهان گزارش و میزان خسارت ناشی از آن 22 تا 50 درصد ذکر گردید (بهار و همکاران، 1361).
باکتری Pss علاوه بر بیماری شانکر باکتریایی درختان میوه هسته دار، عامل بیماری های مهمی همچون لکه قهوه ای لوبیا، بلاست مرکبات، لکه باکتریایی سورگوم و نوار قرمز نیشکر می باشد (Gross and Devay, 1977; Hirano, 1995; Rahimian, 1995). این باکتری بعنوان بیمارگر از گندم، ذرت، ارزن، سیب، گلابی، چغندر قند، کیوی و شمار دیگری از گیاهان زراعی و علف های هرز نیز جداسازی شده است(Balestra and Varvaro, 1997; Garden et al., 1991; Lindow, 1982).
در ایران باکتری مذکور تاکنون از گیاهان مختلفی مانند نیشکر (Rahimian, 1995)، درختان میوه هسته دار (بهار و همکاران، 1361؛ مزارعی و قاسمی، 1372) و گندم (افیونیان و صحراگرد، 1375) جداسازی شده است. این باکتری همچنین روی گیاه گوجه فرنگی نیز ایجاد بیماری می کند، اگرچه این بیماری به ندرت عملکرد را کاهش می دهد ولی باعث کاهش کیفیت می شود (Gleason and Edmunds, 2006).
جمعیت این باکتری با مراحل رشدی گیاه ارتباط دارد. به طوریکه در زمان متورم شدن جوانه ها و ظهور شکوفه ها که میزان تراوه های گیاه زیاد است، جمعیت این باکتری نیز بسیار بالاست. در این موقع میزان ترشحات و مواد قندی گیاه فراوان است و باکتری از آنها برای تغذیه خود استفاده نموده و جمعیت خود را افزایش می دهد.
به نظر می رسد سویه هایPss در میزبان های مختلف، دارای نوعی ویژگی تخصص میزبانی نیز هستند. به طور مثال سویه های Pss جدا شده از لوبیا باعث ایجاد واکنش بیماریزایی روی لوبیا می شوند در حالیکه سویه های این باکتری که از سایر میزبان ها جدا شده اند، تولید واکنش های غیر بیماریزایی در لوبیا می نمایند (Little et al., 1998).
نام این باکتری اغلب با سه اصطلاح اپی فیت، بیمارگر و هسته یخ همراه بوده است که نشان دهنده اهمیت حضور Pss روی گیاهان میزبان است (Hirano et al., 1995).
1-2- اهدافبه دلیل اهمیت این باکتری از نظر ویژگی های گستردگی دامنه میزبانی، اپی فیتی، ایجاد هسته یخ و بیماریزایی تحقیقات زیادی روی Pss صورت گرفته است. به طور مثال سیستم های بیماریزایی این باکتری مانند سیستم ترشحی پروتئینی نوع سه، زهرابه های دخیل در بیماریزایی آن مانند سیرینگومایسین و سیرینگوپپتین، ژن های مرتبط با بیماریزایی مانند syr B, syrD, hrp، افکتورهای پرآزاری و ناپرآزاری و … مورد بررسی قرار گرفته اند. با وجود این تحقیقات گسترده و همچنین روش های مدیریتی گوناگون برای کنترل بیماری های ایجاد شده توسط Pss، متاسفانه هنوز روش موثر و کارآمدی وجود ندارد. بنابراین تحقیقات بیشتر جهت دستیابی به روش های موثر و جدید برای کنترل بیماری های ایجاد شده توسط Pss مورد نیاز است. یکی از این زمینه های تحقیقاتی درک مکانیسم مقاومت گیاه به بیمارگر می باشد. از این رو هدف غایی این پژوهش بررسی همکنش بین آرابیدوپسیس- Pss و باز خوانی مسیرهای دفاعی گیاه آرابیدوپسیس به بیمارگر Pss می باشد. اهداف مد نظر این پژوهش در زیر آورده شده است:
بررسی تغییرات بیان چهار ژن PR1, PDF1.2, LOX2 و VSP2 مرتبط با مقاومت در گیاه آرابیدوپسیس آلوده به Pss
بررسی همکنش دو مسیر دفاعی وابسته به سالسیلیک اسید و جاسمونیک اسید در گیاهان آرابیدوپسیس آلوده به Pss
مقایسه پاسخ های دفاعی گیاهان آرابیدوپسیس آلوده به Pss در دو فاز مختلف رویشی و زایشی
بررسی میزان جمعیت باکتریPss در دو فاز رویشی و زایشی گیاه آرابیدوپسیس پس از مایه زنی
فصل دوم: پیشینه پژوهش2-1- خصوصیات کلی Pssاین باکتری میله ای شکل، دارای تاژک قطبی، گرم منفی، هوازی اجباری و همی بیوتروف می باشد. در حضور آرژنین این باکتری می تواند به صورت غیر هوازی نیز رشد کند (Martin-Sanz et al., 2012). در اغلب موارد پرگنه های این باکتری روی محیط کشت NA (Nutrient Agar) به رنگ کرم قابل مشاهده اند. سویه های این باکتری قادر به تجمع بتا هیدروکسی بوترات (PHB) به عنوان منبع کربن نمی باشند. میزان G+C در DNA این باکتری 61-59 درصد می باشد (Stead et al., 2003). اکثر سویه های این باکتری در محیط های دارای کمبود عنصر آهن و نیز روی محیط کشت King’s B تولید رنگدانه ای می کنند که در برابر نور UV (ماوراء بنفش) به صورت فلورسنت در می آید (Warren and Wolber, 1991). بسیاری از سویه ها نیز در دمای 5 درجه سانتیگراد زیر صفر تا دمای 5 درجه سانتیگراد بالای صفر تشکیل هسته یخ می دهند.
از مهمترین گیاهان میزبان این باکتری می توان به درختان میوه هسته دار، درختان میوه دانه دار، گندم، مرکبات و ذرت اشاره کرد. از مهمترین بیماری های ایجاد شده توسطPss نیز می توان به شانکر باکتریایی درختان میوه هسته دار، بلاست درختان میوه دار و سوختگی برگ گیاهان علفی اشاره نمود (Ashoorpour et al., 2008; Hirano et al., 2000; Rahimian, 1995).
2-1-1- موقعیت تاکسونومیکیجنس Pseudomonas در قلمرو Bacteria، زیر رده گاما از رده‌ی Proteobacteria، خانواده Pseudomonadaceae قرار گرفته است (Boon et al., 2001). گونه P. syringae مهمترین گونه جنس سودوموناس می باشد. این گونه دارای بیش از 60 پاتووار مختلف می باشد که در گیاهان مختلف ایجاد بیماری می کند (Kennlly et al., 2007). اولین بار در سال 1902 این باکتری توسط Van Hall از گیاه یاس خوشه‌ای جداسازی شد (Gross and De Vay, 1977). انجام آزمون های بیماریزایی، خصوصیات فنوتیپی، دامنه میزبانی، توانایی تشکیل هسته یخ و تولید زهرابه برای متمایز کردن پاتووارهای مختلف گونه P. syringae لازم می باشد (Hinrichs-Berger, 2004).
2-1-2- تولید فایتوتوکسین توسط Pss
بسیاری از سویه های Pss در گیاه تولید لیپودپسی پپتیدهای حلقوی به عنوان متابولیت های ثانویه می کنند. این متابولیت ها شامل زهرابه های با وزن مولکولی پایین مانند سیرینگومایسین و زهرابه های با وزن مولکولی بالا مانند سیرینگوپپتین می باشند. این زهرابه ها به طور قابل ملاحظه ای در بیماریزایی باکتری Pss نقش دارند (Fiel et al., 2005). اکثر سویه های این باکتری تولید سیرینگومایسین می کنند. این زهرابه باعث ایجاد منافذی در غشای پلاسمایی سلول های گیاهی می شود. اثر این زهرابه روی عمل تراوایی غشا می باشد که در نهایت باعث نشت بسیار زیاد یون های کلسیم که در سیگنال دهی سلول ها نقش دارند می شود (Mo and Gross,1991). بنابراین این زهرابه در بیماریزایی نقش مهمی دارد و همچنین مشخص شده است که این زهرابه ها به کلونیزاسیون باکتری در میزبان و رشد باکتری در فضای بین سلولی کمک می کنند (Giorgio et al., 1996). این زهرابه ها بوسیله سیگنال های گیاهی فعال می شود. سیگنال های اولیه شامل گلیکوزیدهای فنولی ویژه‌ای هستند که در برگ ها، شاخه ها و گل های بسیاری از میزبان های باکتری یافت می شوند (Fiel et al., 2005).
2-1-3- دامنه میزبانیدامنه میزبانی یک سویه خاص بیمارگر ممکن است بر اساس تعاملات مختلف اختصاصی به یک پاتوار و یا یک نژاد در میان گونه های گیاهی مختلف محدود شده باشد که در این میان، افکتورهای بیماریزایی باکتری و محصولات ژن های مقاومت در گیاه میزبان نقش اساسی در تعیین دامنه میزبانی دارند.
گونه P. syringae شامل سویه هایی است که در مجموع صدها گونه گیاهی را آلوده کرده و سبب ایجاد بیماری هایی با علائم مختلف از لکه برگی ها تا شانکرهای ساقه می شوند. سویه های مختلف P. syringae که شناخته شده اند متنوع بوده و تعامل اختصاصی با رقم ها و گونه های گیاهان مختلف دارند. یک سویه خاص از P. syringae ممکن است برای یکی از حدود 50 پاتوار بر اساس دامنه میزبانی در سطح گونه گیاهی اختصاصی شده باشد و سپس بیشتر با یک نژاد بر اساس همکنش های مختلف با رقم های یک گونه گیاهی اختصاصی شده باشد.
2-1-4- بیماریزایی P. syringaeباکتری P. syringae در فضای آپوپلاستیک بین سلولی تکثیر شده و خارج از سلول باقی می ماند. همزمان سلول های گیاه حضور میکروب را درک نموده و پاسخ های دفاعی را برای محدود کردن رشد باکتری فعال می کنند. برای غلبه بر چنین پاسخ ایمنی، بیمارگرهای باکتریایی سازگار یافته دارای سیستم های بیماریزایی مخصوصی اند که با غلبه بر پاسخ های دفاعی گیاه به بیماریزایی کمک می کنند (Gimenez-Ibanez and Rathjen., 2010).
دو سیستم بیماریزایی که نقش کلیدی در ایجاد بیماری توسط P. syringae دارند عبارتند از: سیستم ترشح پروتئینی نوع سه (TTSS)) (Type III secretion sys– که منبعی از پروتئین های بیماریزا و غیربیماریزای باکتریایی را به آپوپلاست و همچنین داخل سلول های میزبان آزاد می کند ( افکتورهای نوع 3) (Alfano and Collmer, 1997; Lindgren, 1997; He, 1998; Preston, 2000) و زهرابه ها، مانند زهرابه کروناتین که تا حدودی شبیه هورمون گیاهی متیل جاسمونات (MeJA) می باشد (Bender et al., 1999; Preston, 2000). بعضی از این مولکول ها مانع پاسخ های ایمنی گیاه به سودوموناس بوسیله تنظیم سیگنالینگ JA/ET، که متعاقبا سرکوب سیگنالینگ SA را به دنبال دارد و در نتیجه افزایش حساسیت به سودوموناس می شود (Ferguson and Mitchell, 1985; Melotto et al., 2008). هر دو این سیستم های بیماریزایی در معرض بافت های گیاهی تحریک می شوند، احتمالا به دلیل اینکه آنها قبل از مواجهه باکتری با سلول های گیاه مورد نیاز نیستند.
زمانیکه P. syringae پروتئین های عملگر نوع سه، که شامل پروتئین های Avr می باشد را از طریق سیستم ترشح پروتئین نوع سه به داخل سلول های گیاه تزریق می کند، بسته به ژنوتیپ P. syringae آلوده کننده و گیاه دو پیامد در پی خواهد داشت. این پیامدها خیلی ظریفانه بوسیله فرضیه ژن برای ژن توضیح داده می شوند. به طور مثال اگر گیاه آلوده شده دارای ژن مقاومت R باشد که عملگرهای نوع سه P. syringae (مثلا پروتئین Avr) را تشخیص دهد، سبب ایجاد یک مکانیسم دفاعی سریع در گیاه می شود. متناوبا اگر گیاه آلوده شده ژن R متناظر را نداشته باشد و یا سویه P. syringae ژن avr نداشته باشد، پاسخ های دفاعی به آهستگی فعال شده، آلودگی ادامه خواهد یافت و گیاه در برابر P. syringae تسلیم شده و بیمار می شود. به دلیل ضعف در تعریف دقیق مفهوم ژن برای ژن در مورد شناسایی افکتورهای باکتریایی توسط گیرنده های پروتئینی مقاومت در گیاه میزبان، اخیرا فرضیه گارد مطرح شده است که محبوبیت بیشتری در مورد نحوه شناسایی افکتورهای باکتریایی دارد.
2-2- آرابیدوپسیسآرابیدوپسیس یک جنس از گیاهان خانواده شب بوئیان (Brassicasceae) می باشد که در سال های اخیر توجهات بسیاری را به خود جلب کرده است (Beets et al., 2012). این گیاه عموما به عنوان مدل در تحقیقات تعامل گیاه و بیمارگر استفاده می‏شود. وجود مجموعه‌ای از موتانت ها و آسانی آنالیز مولکولی و ژنتیکی این گیاه، آن را برای بررسی مکانیسم ایجاد مقاومت مناسب می سازد ((Park et al., 2009. اطلاعات زیادی در مورد پاسخ دفاعی گیاه با انجام تحقیقات روی گیاه مدل Arabidopsis thaliana ممکن شده است. در دسترس بودن تمام توالی ژنوم، همسانه سازی ژن ها را مبتنی بر نقشه آسان تر و اطلاعات را برای محصولات ریز آرایه ها فراهم کرده است. اخیرا به طور گسترده از آرابیدوپسیس برای بررسی همزمان بیان ژن ها طی حمله بیمارگر و تیمارهای غیر زنده استفاده شده است(Maleck et al., 2000; Chen et al., 2002; Mahalingham et al., 2003; Tao et al., 2003; Glawischnig et al., 2004).
2-3- واکنش Real-time RT-PCR
واکنش Real-time RT-PCR از روش های کارآمد برای تکثیر قطعات DNA است. در این روش با استفاده از آغازگرهای الیگونوکلئوتیدی ترادف خاصی از DNA تکثیر شده و کاربردهای وسیعی در تشخیص بالینی و تحقیقات زیست مولکولی دارد (Jan et al., 2006). علاوه بر این با استفاده از Real-time RT-PCR می توان مقدار دقیق بیان یک ژن را در نمونه های مورد مطالعه اندازه گیری نمود. در این تکنیک نیز اصول کلی PCR حاکم است ولی نکته حائز اهمیت این است که پس از تکثیر DNA در هر سیکل غلظت دقیق آن اندازه گیری می شود.
در بررسی سطح بیان ژن به وسیله PCR، مقدار و حجم محصول PCR به مقدار اولیه الگو بکار رفته در آزمون واکنش زنجیره ای پلیمراز وابسته است (Pfaffl, 2004). روش Real-time RT-PCR یک روش بسیار دقیق جهت تعیین مقدار الگوی اولیه است. حتی نتایج Real-time RT-PCR بسیار دقیق تر از روش سادرن بلات است (Jan et al., 2006). در این روش مقدار الگوی اولیه به وسیله میزان محصول تولیدی در هر سیکل تعیین می شود (Pfaffl, 2004). به طور معمول از کاوشگرهای فلورسنس جهت تعیین مقدار افزایش محصول PCR در هر سیکل، استفاده می شود (Jan et al., 2006). سیستم Real-time RT-PCR بر اساس بررسی کمی میزان ماده فلورسنس عمل می کند. این پیام فلورسنس به نسبت میزان محصول PCR در واکنش افزایش می یابد. با ثبت میزان تابش در هر سیکل می توان واکنش را در طول فاز نمایی ثبت کرد و آن را با مقدار نمونه الگوی اولیه مطابقت داد. هر چقدر مقدار کپی های اولیه نوکلئیک اسید بیشتر باشد افزایش میزان فلورسنس و ورود به فاز نمایی زودتر اتفاق می افتد (Pfaffl, 2004).
2-3-1- بیان ژن (Gen Expression)بیان ژن مرحله ای است که طی آن اطلاعات ژنتیکی DNA به یک محصول عملکردی تبدیل می شود. این محصول در بیشتر مواقع به صورت پروتئین بوده ولی در مورد ژن هایی که محصول پروتئینی ندارند مانند ژن های کد کننده rRNA و یا tRNA این محصول به صورت RNA می باشد. بیان ژن به صورت کلی شامل مراحل مختلف رونویسی، RNA Splicing، ترجمه و تغییرات پس از ترجمه است. با وجود این اغلب موارد منظور از Gen Expression بیان ژن در سطح RNA است. بررسی بیان ژن در سطوح مختلفی با توجه به هدف محقق می تواند انجام شود که شامل آنالیز DNA, mRNA و پروتئین است.
اولین مرحله در بیان ژن انتقال اطلاعات ژنتیکی از DNA به رونوشت RNA است. هدف از بررسی بیان ژن در این سطح بررسی وجود رونوشت مربوط به ژن در نمونه و تعیین مقدار این رونوشت است. مطالعه بیان ژن در سطح RNA می تواند به صورت مستقیم بر RNA و یا به صورت غیر مستقیم از طریق تبدیل RNA به cDNA و تکثیر آن با استفاده از PCR انجام شود.
2-4- دفاع در گیاهانباکتری Pseudomonas syringae در فضای آپوپلاستیک بین سلولی تکثیر شده و خارج از سلول باقی می ماند. همزمان سلول های گیاه حضور میکروب را درک نموده و پاسخ های دفاعی را برای محدود کردن رشد باکتری را فعال می کنند. برای غلبه بر چنین پاسخ ایمنی، باکتری های بیمارگر سازگار یافته، افکتورهای مولکولی بیماریزایی را از طریق دستگاه مخصوص ترشحی نوع سه به داخل سلول گیاه ترشح می کند که با غلبه بر پاسخ های دفاعی گیاه به بیماریزایی کمک می کند. با این وجود افکتورها نیز توسط گیرنده های درون سلولی میزبان تشخیص داده شده و پاسخ ایمنی را فعال می کنند .(Gimenez-Ibanez and Rathjen, 2010)
گیاهان دارای هر دو نوع دفاع فعال و غیر فعال علیه تهاجم بیمارگرها می باشند. موانع از پیش ساخته فیزیکی و شیمیایی مانند کوتیکول برگ، موانع ایجاد شده توسط دیواره های سلولی گیاه، و وجود چندین ترکیب ضد میکروبی آپوپلاستیکی، موانع اولیه برای آلودگی است. ورود بیمارگر به بافت میزبان اولین مرحله حیاتی برای آلودگی است، زیرا مواد روی سطوح برگ بسیار محدود هستند. باکتری سودوموناس دارای تاژک و قدرت حرکت می باشد ولی به این معنی نیست که می تواند به طور مستقیم به اپیدرم برگ نفوذ کند، این باکتری توسط منافذ سطحی طبیعی مانند استوماتا و یا زخم ها وارد می شود. به این دلیل که بیمارگرها می توانند دفاع غیرفعال را بشکافند، گیاهان به ایمنی فعال برای محدود کردن تکثیر بیمارگر متکی هستند (Gimenez- Ibanez and Rathjen, 2010).
گیاهان به طور طبیعى در مقابله با بیمارگرهاى مختلف از جمله باکتری ها با بکارگیرى مکانیسم هاى مقاومت، همانند پاسخ فوق حساسیت پاسخ هاى دفاعى از خود نشان می دهند. مقاومت مستلزم تشخیص باکتری توسط گیاه و سیگنال دهى بعد از تشخیص باکتری می باشد. در این زمینه مى توان به پروتئین هاى مقاومت R در گیاه اشاره نمود که محصول ژن Avr بیمارگرها را به طور مستقیم یا غیر مستقیم تشخیص مى دهند. پس از تشخیص بیمارگر توسط میزبان، عملکرد کمپلکس پروتئین R باید از حالت تشخیص به انتقال سیگنال تغییر یابد. سپس مسیرهاى سیگنال دهى در گیاه بکار مى افتند که مولکول ها و ترکیبات متنوعى در این مسیرهاى سیگنال دهى ایفاى نقش مى کنند که از جمله آن ها مى توان به انواع اکسیژن آزاد، نیتریک اکسید، سالیسیلیک اسید، جاسمونیک اسید، اتیلن، پلى آمین ها و آبشارهاى MAP کیناز اشاره کرد. به نظر مى رسد که گیاهان با توسعه ارتباط بین این مسیرها، در صدد محدود نمودن آلودگى ها می باشند.
2-4-1- مقاومت ساختاری و القاییگیاهان با مکانیسم های دفاع ساختاری و القایی به حمله بیمارگرها پاسخ می دهند که شامل مقاومت ذاتی یا مقاومت اختصاصی است (Jones and Dangl, 2006). در مقاومت ذاتی گیاهان حضور بیمارگر را از طریق مکانیسم هایی مانند ایمنی مربوط به الگوهای مولکولی وابسته به بیمارگر تشخیص می دهند. الگوهای مولکولی وابسته به بیمارگر (PAMPs) شامل پلی ساکاریدها و فلاژلین باکتری ها می باشند (Jones and Dangl, 2006; Zipfel, 2009). بیمارگرها برای فرار از مقاومت ذاتی یکسری افکتورهای پروتئینی Avr-proteins تولید می کنند و گیاهان مقاوم، علیه این افکتورها مجهز به سیستم های دفاعی اختصاصی اند. ژن های مقاومت در گیاه مقاوم گیرنده های افکتور یا R-proteins را تولید می کنند. شناسایی Avr proteins توسط R-proteins سبب ایجاد مقاومت اختصاصی می شود. این نوع مقاومت به ایمنی وابسته به افکتور یا ژن برای ژن معروف است. هورمون های SA, JA و اتیلن به عنوان سیگنال های ثانویه در شبکه انتقال سیگنال ایمنی مربوط به الگوهای مولکولی وابسته به بیمارگر نقش بازی می کنند(Jones and Dangl, 2006; Van loon et al., 2006; Zipfel, 2009) که بعد از حمله بیمارگر میزان این هورمون ها در گیاه تغییر می کند.
2-4-1-1- مقاومت القایی
گیاهان در طول زمان زندگی تحت تاثیر تعداد بیشماری حشرات گیاهخوار و بیمارگرهای میکروبی با روش گوناگون حمله قرار دارند. گیاهان برای بقا مجبورند حمله را بوسیله این ارگانیسم های مضر درک کنند و با فعال کردن پاسخ های دفاعی مناسب پاسخ دهند. پاسخ های ایمنی اولیه برای تشخیص خصوصیات رایج و عمومی ارگانیسم هایی که با گیاه همکنش می کنند و تفسیر این تشخیص به یک پاسخ دفاعی که به طور اختصاصی هدایت شده علیه حملات مهاجم تکامل یافته اند (Jones and Dangl, 2006). علاوه بر این برای این پاسخ دفاعی اولیه اختصاصی مهاجم گیاهان می توانند خط دیگری از دفاع که اشاره شده است بعنوان مقاومت القایی را فعال کنند. این نوع مقاومت اغلب به طور سیستمیک در تمام گیاه عمل می کند و علیه طیف وسیعی از مهاجم ها موثر است (Walters et al., 2007). گیاهان قادرند انواع گوناگونی از مقاومت های القا شده بسته به ارگانیسمی که با گیاه همکنش می کند را فعال کنند. از نمونه های مقاومت القایی خوب مطالعه شده، مقاومت سیستمیک اکتسابی (SAR) است که به بیمارگرهای ایجاد کننده آلودگی محدود مانند نکروز فوق حساسیت وابسته است (Durrant and Dong, 2004). همچنین مقاومت سیستمیک القایی (ISR) که به محض کلنیزه شدن ریشه های گیاهان توسط سویه های غیر بیماریزای رایزوباکتری ها(Van Loon et al., 1998) و نیز زخم که به محض خسارت به بافت مانند تغذیه حشرات ایجاد می شود، فعال می شود (Kessler and Baldwin, 2002; Howe, 2004).
2-4-2- مقاومت سیستمیک اکتسابی Sys–ic Aquired Resistance (SAR)مقاومت سیستمیک اکتسابی به طور گسترده توسط راس مشخص شده است، به این صورت که لکه های ایجاد شده توسط آلودگی ثانویه توتون با ویروس موزائیک توتون TMV به طور قابل توجهی کوچکتر از آنهایی بود که توسط آلودگی اولیه ایجاد شده اند. مقاومت سیستمیک اکتسابی (SAR) از آن زمان به بعد در طیف وسیعی از گونه های گیاهان در پاسخ به آلودگی با بیمارگرهای باکتریایی، قارچی و … نشان داده شده است. در حالیکه مقاومت سیستمیک اکتسابی معمولا با یک پاسخ مقاومت فعال در ارتباط است، همچنین معلوم شده است که همکنش های گیاه- بیمارگر (که گیاه به بیمارگر حساس است) می تواند منجر به SAR شود. به این ترتیب در حال حاضر معلوم نیست کدام نوع از همکنش گیاه -بیمارگر برای القائ مقاومت سیستمیک اکتسابی لازم هستند.
یکی از بیشترین مطالعات انجام شده در خصوص پاسخ های دفاع القایی در گیاهان، در زمینه مقاومت سیستمیک اکتسابی است. این نوع از مقاومت مرتبط با آلودگی موضعی بیمارگر است که منجر به نکروز یا واکنش فوق حساسیت می شود و علیه طیف وسیعی از بیمارگرهای گیاهی ایجاد می شود (Ryals et al., 1996). سالیسیلیک اسید (SA) هورمونی کلیدی در ایجاد SAR می باشد که آغاز آن با افزایش موضعی و سیستمیک SA در داخل گیاه (Malamy et al., 1990; Métraux et al., 1990) و افزایش بیان تعداد زیادی از ژن ها(Ward et al., 1991) از جمله ژن هایی که پروتئین های مرتبط با بیماریزایی (PR proteins) را کد می کنند (Van Loon and Van Strien, 1999) همراه است. چندین پروتئین PR فعالیت ضد میکروبی دارند و به دستیابی به مقاومت کمک می کنند.
تجمع سالیسیلیک اسید یکی از اجزای اصلی مقاومت گیاهان به بیماری و انتقال سیگنال وابسته به آن می باشد. این تجمع برای بیان کامل مقاومت به بعضی اما نه تمام بیمارگرهای گیاهی لازم است Delaney et al., 1994; Van der Biezen et al., 2002)) و منجر به تغییراتی در عملکرد میتوکندری و بیان ژن ها می شود Maleck et al., 2000)). تجمع سالیسیلیک اسید همچنین می تواند در پاسخ های ایمنی مانند مقاومت سیستمیک اکتسابی و مقاومت وابسته به سن و بیان ژن های مرتبط کمک کند (Gaffney et al., 1993; Kus et al., 2002).
2-4-2-1- مراحل ایجاد مقاومت سیستمیک اکتسابی (SAR)
مقاومت سیستمیک اکتسابی یک پاسخ دفاعی القایی است که منجر به مقاومت سیستمیک وسیع الطیف بعد از مصونیت آلودگی اولیه می شود SAR .(Kuc, 1982; Chester, 1933) بعنوان یک مکانیسم دفاعی پیشرفته در گیاه میزبان برای واکنش سریع پاسخ های دفاعی بعد از آلودگی ثانویه توصیف شده است(Sequeira, 1983; Hammerschmidt, 1993; Kuc, 1983). شواهدی از توتون، کدوییان و اخیرا از آرابیدوپسیس نشان می دهد که سه مرحله در پاسخ SAR وجود دارد. اولین مرحله مصونیت یا ایمنی است، که در آن یک بیمارگر نکروزکننده پس از آلوده کردن برگ منجر می شود به: 1- تشکیل زخم های نکروتیک موضعی و مقاومت موضعی HR 2- ایجاد علائم نکروتیک (Kuc, 1982). لکه های نکروتیک سبب بیان مجموعه ای از پروتئین های وابسته به بیمارگر PR در توتون، خیار و آرابیدوپسیس می شوند (Kuc, 1982; Ward et al., 1991; Uknes et al., 1992; Uknes et al., 1993). تجمع سالیسیلیک اسید تا چندین برابر سطح پایه افزایش می یابد(Malamy et al., 1990; Metraux et al., 1990; Yalpani et al., 1991; Uknes et al., 1992; Delaney et al., 1995; Lawton et al., 1995) یک سیگنال متحرک نیز در آبکش ها تولید شده و برای تثبیت SAR از برگ مصون شده به بقیه قسمت های گیاه حرکت می کند (Jennes and Kuc, 1979; Guedes et al., 1980; Tuzun and Kuc, 1985).
مرحله تثبیت SAR مستلزم درک سیگنال متحرک در برگ های مایه زنی نشده می باشد و منجر به بروز میزان پایینی از HR می شود، که باعث القائ بیان همان مجموعه ژن های PR در اطراف مکان اولیه آلودگی القا می شود، همچنین تجمع SA تا 2 برابر در آرابدوپسیس (Yalpani et al., 1991; Delaney et al., 1995; Lawton et al., 1995) و در توتون تا 10 برابر افزایش می یابد.
فاز آخر مرحله SAR است، هنگامی که گیاه با بیمارگر دوم مایه زنی می شود، بیمارگر معمولی همان پاسخی را در گیاه ایجاد می کند که یک بیمارگر پرآزار ایجاد می کند(Kuc, 1982).
2-4-2-2- پروتئین‌‌‌‌های مرتبط با بیماریزایی (PRs) Pathogenesis related proteins
تلاش برای درک اساس بیوشیمیایی مقاومت از جمله SAR، منجر به شناسایی انواعی از پروتئین ها شده است و معمولا به پروتئین های مربوط به بیماریزایی (PR) ارجاع داده شده اند که بعد از حمله بیمارگر تولید می شوند. در توتون، تولید هماهنگ 5 خانواده یا بیشتر از پروتئین های PR با توسعه واکنش فوق حساسیت (HR) بعد از آلودگی با TMV در ارتباط است. یک زیر مجموعه ای از ژن ها، پروتئین های PR را پشتیبانی می کنند که به عنوان ژن های ایجاد کننده SAR تعیین شده اند. همچنین هنگام توسعه SAR در برگ های غیر آلوده القایشان افزایش می یابد. از زمانیکه پروتئین های PR شناسایی شدند، ژن هایشان از تعداد زیادی گونه های گیاهی جداسازی شده اند. به طور کلی این ژن ها در فرایند مقاومت سیستمیک و موضعی علیه بیمارگرهای قارچی، باکتریایی و ویروسی القا می شوند.
شواهد اخیر نشان داده است که پروتئین های PR نه تنها نشانگر مناسبی برای SAR هستند بلکه عوامل ضد میکروبی موثری نیز می باشند. بعضی پروتئین های PR-3 نقش آنزیم های لیزوزومی دارند و همچنین کیتینازها، عملکرد ضد باکتریایی را نشان می دهند. بعلاوه، PRs 2,3,4 و 5 در شرایط آزمایشگاهی فعالیت های ضد قارچی ابراز می کنند. همچنین بیان PRs 1,2,3 و5 مقاومت را در گیاهان تراریخت نسبت به چندین بیمارگر قارچی افزایش می دهند. بنابراین، تولید پروتئین های PR ممکن است به طور مستقیم به توسعه SAR و ابقا آن و همچنین کاهش رشد و گسترش بیمارگر طی آلودگی اولیه کمک کنند. با این حال، از آنجایی که بیان پروتئین های PR در گیاهان تراریخت همیشه سبب افزایش مقاومت در برابر بیماری نمی شوند و هیچ فعالیت ضد ویروسی مربوط به SAR شناسایی نشده است، واضح است که تعدادی از اجزای درگیر در SAR هنوز کشف نشده اند.
2-4-3- مقاومت سیستمیک القایی Induced Sys–ic Resistance (ISR)مقاومت سیستمیک القایی اغلب توسط باکتری های غیر بیمارگر افزایش دهنده رشد گیاهان (PGPR) یا قارچ های غیر بیمارگر افزایش دهنده رشد (PGPF) به وجود می آید. در پی القای مقاومت توسط این میکروارگانیسم ها سیگنالی در گیاه ایجاد و پراکنده می شود که منجر به ظهور ISR در سراسر گیاه می شود. مقاومت سیستمیک القایی علیه طیف وسیعی از بیمارگرها خصوصا نکروتروف ها و همی بیوتروف ها موثر است. موتانت های غیر حساس آرابیدوپسیس در مقاومت سیستمیک القایی علیه بیمارگرهای نکروتروف مقاومتی نشان نمی دهند (Thomma et al., 2000). سیگنال های اصلی در مقاومت سیستمیک القایی، هورمون های اتیلن (ET) و جاسمونیک اسید (JA) می باشند ولی تحقیقات اخیر نشان داده است که سالیسیلیک اسید (SA) نیز در ایجاد این نوع مقاومت نقش دارد(Van Wees et al., 1997; Van loon et al., 1998; Pieterse and Van loon, 1999; Martinez et al., 2001; Pieterse et al., 2002; Ryu et al., 2003; Glazebrook, 2005).
هورمون JA باعث القای پروتئین



قیمت: 11200 تومان

Leave a Reply

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *