تغییرات بیان ژن های مرتبط با مقاومت در گیاه آرابیدوپسیس پس از مایه زنی با باکتری Pseudomonas syringae pv. syringae

دانشکده کشاورزی
پایاننامهی کارشناسیارشد در رشته مهندسی کشاورزی- بیماریشناسی گیاهی
تغییرات بیان ژن های مرتبط با مقاومت در گیاه آرابیدوپسیس پس از مایه زنی با باکتری Pseudomonas syringae pv. syringae
بهکوشش
سید حسین میرزابابایی
استادان راهنما
دکتر علی‌رضا افشاریفر
دکتر محمد جواهری
تابستان 1393

تقدیم به
سه وجود مقدس؛آنانکه ناتوان شدند تا ما به توانایی برسیم موهایشان سپید شد تا ما روسفید شویمو عاشقانه سوختند تا گرمابخش وجود ما و روشنگر راهمان باشند پدر عزیزم
مادر مهربانم
و اساتید بزرگوارم
ﺳﭙﺎﺳﮕﺰﺍﺭی
«من لم یشکر المخلوق لم یشکر الخالق»
خداوند بزرگ و منان را بسیار شاکر و سپاسگزارم که به من توفیق داد تا سرافراز و خشنود این پژوهش را به اتمام برسانم. قبل از هر چیز برخود لازم می‌دانم که مراتب سپاس، قدردانی و تشکر بی‌نهایت خود را از جناب آقایان دکتر علی‌رضا افشاریفر و دکتر محمد جواهری که راهنمایی بنده را در این پژوهش قبول نموده و در طول انجام این امر در نهایت تواضع، فروتنی و بردباری همواره پاسخگوی مسائل و مشکلات بنده بودند، ابراز دارم. از استاد مشاور گرامیم آقای دکتر سیدمحسن تقوی که در کمال گشاده‌رویی از هیچ کمک و راهنمایی نسبت به اینجانب دریغ نفرمودند، نهایت تشکر را دارم. ممنون و سپاسگزار محبت‌ها و همدلی‌های دوستان عزیزم آقایان و خانم‌ها، مقدم، صادقی، حسین زاده، ایراندوست، شرافتی، خنشا، میری، جلالی، مرادی، بی‌تعب، خالقی و پوی هستم. از کلیه کارکنان محترم بخش گیاهپزشکی، بخش ویروس شناسی گیاهی و بخش بیوتکنولوژی به ویژه خانم ها داوودی، دهشکار و آرام و آقای زارع که در طی انجام پایان‌نامه همکاری‌های لازم را نسبت به بنده مبذول داشتند کمال تشکر و قدردانی را دارم. در نهایت موفقیت خود را مرهون و مدیون زحمات بی‌شائبه پدر و مادر خوبم که همواره در تمام طول زندگی‌ام در کنارم بودند و مرا حمایت و پشتیبانی کردند، می‌دانم.

چکیده
تغییرات بیان ژن های مرتبط با مقاومت در گیاه آرابیدوپسیس پس از مایه زنی با باکتری Pseudomonas syringae pv. syringae
به کوشش
سید حسین میرزابابایی
باکتری Pseudomonas syringae pv. syringae (Pss) بیمارگر مخربی است که دارای دامنه میزبانی بسیار وسیعی میباشد بهطوریکه به بیش از 180 گونه گیاهی حمله میکند. مهمترین میزبانهای این بیمارگر درختان میوه هستهدار، درختان میوه دانهدار و گیاهان علفی میباشد. به علت هم-تکاملی با بیمارگرها، گیاهان چندین مکانیسم دفاعی را برای حفاظت از خودشان ایجاد نموده اند. تجمع پروتئین های مرتبط با بیماریزایی مانند PR1, LOX2, PDF1.2و VSP2 یکی از مکانیسم های مقاومت گیاه به بیمارگر است. ایجاد گیاهان مقاوم، یکی از مهمترین استراتژی ها در مدیریت بیماری در محصولات زراعی و درختان میوه مختلف است. تشخیص مکانیسم های درگیر در پاسخ های گیاهان علیه بیمارگرها، می تواند تولید ارقام مقاوم را تسهیل کند و در این راستا، تشخیص ژن های درگیر در مقاومت گیاه میزبان می تواند گام سودمندی در توسعه ارقام مقاوم باشد. هدف از تحقیق حاضر بررسی الگوی تغییر بیان ژن PR1 (دخیل در مسیرهای دفاعی وابسته به سالیسیلیک اسید و محدود کننده بیمارگرهای بیوتروف)، و ژن های LOX2, PDF1.2 و VSP2 (دخیل در مسیرهای دفاعی وابسته به جاسمونیک اسید محدود کننده بیمارگرهای نکروتروف و حشرات گیاهخوار)، در گیاه آرابیدوپسیس مایه زنی شده به Pss و در دو فاز مختلف رویشی و زایشی بود. نمونه های گیاه آرابیدوپسیس در زمان های 0، 24، 48 و 72 ساعت پس از مایه زنی جمع آوری شد و میزان جمعیت باکتری Pss در سطح گیاه نیز در این زمانها مورد بررسی قرار گرفت. سپس RNA کل استخراج شد و سنتز cDNA و تغییرات بیان چهار ژن با استفاده از روش Real time RT-PCR سنجیده شد. نتایج کلی نشان داد که گیاهان آرابیدوپسیس از مسیر دفاعی وابسته به سالیسیلیک اسید برای مقاومت به باکتری Pss استفاده نموده است و این که در فاز زایشی نسبت به فاز رویشی این مقاومت بیشتر می باشد. همچنین همکنش بین دو مسیر دفاعی وابسته به SA و JA نیز به اثبات رسید.
کلمات کلیدی: مقاومت سیستمیک اکتسابی، مقاومت سیستمیک القایی، بیان ژن، پروتئین های مرتبط با بیماریزایی

فهرست مطالبعنوان صفحه TOC o “1-3” h z u
فصل اول PAGEREF _Toc401955910 h 11-1- مقدمه PAGEREF _Toc401955911 h 21-2- اهداف PAGEREF _Toc401955912 h 3فصل دوم: پیشینه پژوهش PAGEREF _Toc401955913 h 52-1- خصوصیات کلی Pss PAGEREF _Toc401955914 h 62-1-1- موقعیت تاکسونومیکی PAGEREF _Toc401955915 h 62-1-2- تولید فایتوتوکسین توسط Pss PAGEREF _Toc401955916 h 72-1-3- دامنه میزبانی PAGEREF _Toc401955917 h 72-1-4- بیماریزایی P. syringae PAGEREF _Toc401955918 h 82-2- آرابیدوپسیس PAGEREF _Toc401955919 h 92-3- واکنش Real-time RT-PCR PAGEREF _Toc401955920 h 102-3-1- بیان ژن (Gen Expression) PAGEREF _Toc401955921 h 112-4- دفاع در گیاهان PAGEREF _Toc401955922 h 112-4-1- مقاومت ساختاری و القایی PAGEREF _Toc401955923 h 122-4-2- مقاومت سیستمیک اکتسابی Sys–ic Aquired Resistance (SAR) PAGEREF _Toc401955924 h 142-4-3- مقاومت سیستمیک القایی Induced Sys–ic Resistance (ISR) PAGEREF _Toc401955925 h 172-4-4- پاسخ دفاعی PAGEREF _Toc401955926 h 182-4-5- سیگنال های موجود در مقاومت به بیماری های گیاهی PAGEREF _Toc401955927 h 182-4-6- تشخیص الیسیتورهای باکتریایی توسط سلول های گیاهی PAGEREF _Toc401955928 h 212-4-7- همکنش گیاه- Pseudomonas syringae PAGEREF _Toc401955929 h 242-4-8- تغییرات در سطح سلول PAGEREF _Toc401955930 h 262-5- نقش دفاعی هورمون ها در گیاهان PAGEREF _Toc401955931 h 272-5-1- هورمون سالیسیلیک اسید PAGEREF _Toc401955932 h 292-5-2- هورمون جاسمونیک اسید PAGEREF _Toc401955933 h 292-5-3- هورمون اتیلن PAGEREF _Toc401955934 h 292-5-4- هورمون آبسیزیک اسید PAGEREF _Toc401955935 h 302-5-5- هورمون اکسین PAGEREF _Toc401955936 h 312-6- همکنش مسیر های هورمونی (Cross-talk) PAGEREF _Toc401955937 h 322-6-1- اثر آنتاگونیستی SA بر سیگنالینگ JA PAGEREF _Toc401955938 h 362-7- القاگرهای شیمیایی دفاعی در گیاهان PAGEREF _Toc401955939 h 372-8- بررسی تعدادی از ژن های مرتبط با دفاع در گیاهان PAGEREF _Toc401955940 h 382-8-1- ژن PDF1.2 PAGEREF _Toc401955941 h 382-8-2- ژن VSP2 PAGEREF _Toc401955942 h 382-8-3- ژن LOX2 PAGEREF _Toc401955943 h 392-8-4- ژن PR1 PAGEREF _Toc401955944 h 402-9- ملاحظات PAGEREF _Toc401955945 h 40فصل سوم: مواد و روش ها PAGEREF _Toc401955946 h 423-1- تهیه باکتری Pss PAGEREF _Toc401955947 h 433-1-1- خالص سازی باکتری PAGEREF _Toc401955948 h 433-1-2- آزمون تولید لوان PAGEREF _Toc401955949 h 433-1-3- آزمون تولید رنگ فلورسنت PAGEREF _Toc401955950 h 443-1-4- آزمون اکسیداز PAGEREF _Toc401955951 h 443-1-5- آزمون واکنش فوق حساسیت (HR) PAGEREF _Toc401955952 h 443-1-6- اثبات بیماری زایی روی گیاه گوجه فرنگی PAGEREF _Toc401955953 h 443-1-7- آزمون واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) PAGEREF _Toc401955954 h 453-2- کاشت گیاه آرابیدوپسیس PAGEREF _Toc401955955 h 473-2-1- محیط کشت آرابیدوپسیس PAGEREF _Toc401955956 h 473-2-2- شرایط گلخانه PAGEREF _Toc401955957 h 483-2-3- مایه زنی با Pss PAGEREF _Toc401955958 h 493-2-4- نمونه برداری PAGEREF _Toc401955959 h 493-3- بررسی میزان جمعیت باکتری Pss PAGEREF _Toc401955960 h 503-4- استخراج DNA PAGEREF _Toc401955961 h 513-4-1- طرز تهیه بافر CTAB PAGEREF _Toc401955962 h 523-4-2- تهیه کلروفرم- ایزوآمیل الکل PAGEREF _Toc401955963 h 523-5- استخراج RNA از بافت PAGEREF _Toc401955964 h 523-5-1-تهیه آب تیمار شده با DEPC PAGEREF _Toc401955965 h 533-5-2- تعیین کمیت و کیفیتRNA PAGEREF _Toc401955966 h 543-5-3- تیمار DNase PAGEREF _Toc401955967 h 543-5-4- توقف تیمار DNase PAGEREF _Toc401955968 h 543-5-5- سنتز رشته اول cDNA با استفاده از RNA استخراج شده PAGEREF _Toc401955969 h 553-5-6- تکثیر قطعه مورد نظر با استفاده از واکنش زنجیره‏ای پلیمراز PAGEREF _Toc401955988 h 563-5-7- اسامی و توالی آغازگرهای مورد استفاده برای بررسی بیان ژن ها PAGEREF _Toc401955989 h 573-6- واکنش Real-time RT-PCR (Relative) PAGEREF _Toc401955990 h 573-6-1- واکنش Real-time RT-PCRژن های مقاومت و ژن کنترل داخلی PAGEREF _Toc401955991 h 583-6-2- روش نرمال سازی نسبی بیان ژن ها PAGEREF _Toc401956004 h 593-6-3-آنالیز آماری بیان ژن ها PAGEREF _Toc401956005 h 59فصل چهارم: نتایج PAGEREF _Toc401956006 h 604-1- آزمون های تشخیصی اولیه PAGEREF _Toc401956007 h 614-1-1- استفاده از PCR جهت تشخیص Pss PAGEREF _Toc401956008 h 624-2- بررسی جمعیت باکتری پس از مایه زنی PAGEREF _Toc401956009 h 624-3- استخراج Total RNA از بافت گیاه PAGEREF _Toc401956010 h 644-3-1- تعیین کیفیت Total RNA PAGEREF _Toc401956011 h 644-3-2- تعیین غلظت Total RNA با استفاده از نانودراپ PAGEREF _Toc401956012 h 644-3-3- تیمار DNase PAGEREF _Toc401956013 h 654-3-4- بررسی صحت سنتز cDNA PAGEREF _Toc401956014 h 664-5- بررسی بیان ژن ها PAGEREF _Toc401956015 h 664-5-1- ژن PR1 PAGEREF _Toc401956016 h 674-5-2- ژن VSP2 PAGEREF _Toc401956017 h 684-5-3- ژن PDF1.2 PAGEREF _Toc401956018 h 704-5-4- ژن LOX2 PAGEREF _Toc401956019 h 714-5-5- الگوی بیان ژن ها در دو فاز مختلف رویشی و زایشی گیاهان آرابیدوپسیس PAGEREF _Toc401956020 h 73فصل پنجم: بحث PAGEREF _Toc401956021 h 755-1- بحث PAGEREF _Toc401956022 h 765-2- بررسی دفاع ذاتی وابسته به هورمون های سالیسیلیک اسید و جاسمونیک اسید PAGEREF _Toc401956023 h 775-3- آنالیز مقایسه ای تغییرات بیان ژن ها PAGEREF _Toc401956024 h 793-۵-1- بررسی پاسخ ژن PR1 علیه Pss PAGEREF _Toc401956025 h 793-۵-2- بررسی پاسخ ژن PDF1.2 علیه Pss PAGEREF _Toc401956026 h 815-3-3- بررسی پاسخ ژن LOX2 علیه Pss PAGEREF _Toc401956027 h 823-۵-4- بررسی پاسخ ژنVSP2 علیه Pss PAGEREF _Toc401956028 h 835-4- تعیین جمعیت باکتری PAGEREF _Toc401956029 h 845-5- نتیجه گیری نهایی PAGEREF _Toc401956030 h 855-5-1- دو فرضیه احتمالی برای بیان مسیر وابسته به JA بلافاصله بعد از مسیر وابسته به SA PAGEREF _Toc401956031 h 86پیشنهادات PAGEREF _Toc401956032 h 90منابع PAGEREF _Toc401956033 h 91
فهرست شکل هاعنوان صفحه
TOC h z t “Chart,2,Normal + (Complex) B Nazanin,1” شکل 3-1- کاشت گیاهان آرابیدوپسیس در سیستم هیدروپونیک PAGEREF _Toc401956935 h 49شکل 4-1- انجام واکنش HR در گیاه توتون و شمعدانی وآزمایش بیماریزایی در گیاه گوجه فرنگی PAGEREF _Toc401956936 h 61شکل 4-2- الکتروفورز محصول PCRتشخیصی با استفاده از جفت آغازگرهای B2 و B1 PAGEREF _Toc401956937 h 62شکل 4-3- بررسی جمعیت باکتری در زمان های نمونه برداری پس از مایه زنی در دو فاز مختلف رویشی و زایشی PAGEREF _Toc401956938 h 63شکل 4-4- الکتروفورز Total RNA استخراج شده از بافت ها PAGEREF _Toc401956939 h 64شکل 4-5- طیف جذب نوری Total RNA استخراج شده با استفاده از نانودراپ PAGEREF _Toc401956940 h 65شکل 4-6- الکتروفورز محصول PCR بعد از تیمار DNase PAGEREF _Toc401956941 h 65شکل 4-7- الکتروفورز محصول PCR پس از سنتز cDNA PAGEREF _Toc401956942 h 66شکل 4-8-تغییرات بیان ژن PR1 در دو فاز رویشی و زایشی و تیمار های زمانی 24، 48 و 72 ساعت پس از مایه زنی PAGEREF _Toc401956943 h 68شکل 4-9- تغییرات بیان ژن VSP2 در دو فاز رویشی و زایشی و تیمار های زمانی 24، 48 و 72 ساعت پس از مایه زنی PAGEREF _Toc401956944 h 69شکل 4-10-تغییرات بیان ژن PDF1.2 در دو فاز رویشی و زایشی و تیمار های زمانی 24، 48 و 72 ساعت پس از مایه زنی PAGEREF _Toc401956945 h 71شکل 4-11-تغییرات بیان ژن LOX2 در دو فاز رویشی و زایشی و تیمار های زمانی 24، 48 و 72 ساعت پس از مایه زنی PAGEREF _Toc401956946 h 72شکل 4-12- الگوی تغییرات بیان ژن ها در فاز رویشی گیاهان PAGEREF _Toc401956947 h 74شکل 4-13- الگوی تغییرات بیان ژن ها در فاز زایشی گیاهان PAGEREF _Toc401956948 h 74فهرست جداولعنوان صفحه TOC h z t “Table,2,Normal + (Complex) B Nazanin,1” جدول 3-1- نوع و مقدار مواد لازم برای انجام واکنش 25 میکرولیتری PCR جهت تشخیص Pss PAGEREF _Toc401957093 h 45جدول 3-2- سیکل دمایی PCR با آغازگرهای B1-B2 برای تشخیص Pss PAGEREF _Toc401957094 h 46جدول3-3- نوع و مقدار عناصر غذایی محیط کشت هوگلند PAGEREF _Toc401957095 h 48جدول 3-4- مقادیر و نوع مواد مورد نیاز برای تهیه 100 میلی لیتر بافر CTAB PAGEREF _Toc401957096 h 52جدول 3-5- نوع و مقدار مواد مورد نیاز برای تیمار DNase PAGEREF _Toc401957097 h 54جدول 3-6- نوع و مقدار مواد مورد استفاده در سنتز رشته اول cDNA در مرحله اول PAGEREF _Toc401957098 h 55جدول 3-7- نوع و مقدار مواد مورد استفاده در سنتز رشته اول cDNA در مرحله دوم PAGEREF _Toc401957099 h 55جدول 3-8- نوع و مقدار مواد لازم برای انجام یک واکنش 20 میکرولیتری PCR

این نوشته در پایان نامه ها ارسال شده است. افزودن پیوند یکتا به علاقه‌مندی‌ها.

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *