تجزیه پروتئوم ریشه گندم تحت تنش کلرید سدیم92

پردیس بین المللی ارس دانشگاه تبریز
گروه بهنژادی و بیوتکنولوژی گیاهی
پایاننامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد در رشته بیوتکنولوژی کشاورزی
عنوان
تجزیه پروتئوم ریشه گندم تحت تنش کلرید سدیم
استاد راهنما
دکتر محمود تورچی
استاد مشاور
دکتر محمدرضا شکیبا
پژوهشگر
مهدی اکبری
تابستان 1392

نام خانوادگی: اکبری نام: مهدی
عنوان پایان نامه: تجزیه پروتئوم ریشه گندم تحت تنش کلرید سدیم
استاد راهنما: دکتر محمود تورچی
استاد مشاور: دکتر محمدرضا شکیبا
مقطع تحصیلی: کارشناسی ارشد رشته: مهندسی کشاورزی گرایش: بیوتکنولوژی
دانشگاه: پردیس بینالمللی ارس، دانشگاه تبریز تاریخ فارغالتحصیلی: 17/06/1392 تعداد صفحه: 110
کلید واژهها: الکتروفورز دو بعدی، تنش کلرید سدیم، گندم
چکیده:
گندم (Triticum aestivum L.) یکی از قدیمیترین و اولین گیاهان زراعی ‌است که به عنوان ماده اولیه تهیه نان در تغذیه بشر نقش اساسی ایفا کرده است. با توجه به رشد جمعیت و نیاز روز افزون به محصولات کشاورزی به ویژه گندم میبایست تولید گندم را در کشور افزایش داد. به علت محدود بودن سطح زمینهای قابل کشت، افزایش تولید گندم مستلزم افزایش عملکرد در واحد سطح است. تنشهای محیطی از قبیل خشکی، شوری و سرما نقش مهمی بر روی عملکرد گیاهان زراعی و بقای آنها دارند. تنش شوری یکی از مهمترین تنشهای غیرزیستی است که اثر نامطلوبی بر روی کمیت و کیفیت محصولات زراعی دارد، به طوری که 20 درصد از زمینهای زراعی آبی در جهان متاثر از تنش شوری هستند. بنابراین ارزیابی و بررسی سازوکار مولکولی مقاومت و حساسیت به تنش کلرید سدیم در ارقام مختلف گندم از اهمیت ویژهای در این راستا برخوردار است. به این منظور آزمایشی بصورت تکرار دار در سال 1391 درون اتاقک رشد تحت شرایط کنترل شده در دانشکده کشاورزی دانشگاه تبریز اجرا گردید. در این آزمایش از دو رقم آرتا (حساس) و بم (مقاوم) در دو سطح تنش 250 میلیمولار و فاقد تنش بر پایه طرح کاملا تصادفی در سه تکرار استفاده گردید. زمان اعمال تنش، مرحله دو برگی گیاهان بود. پس از ظهور علائم تنش، اقدام به نمونه برداری و بررسی صفات مورفولوژیک از قبیل طول ریشه، حجم ریشه، وزن تر، وزن خشک، تعداد ریشه و میزان پرولین ریشه گردید. تیمار ارقام گندم با نمک کلرید سدیم به مدت یک هفته تغییر معنی داری از نظر آماری در صفات مرتبط با ریشه شامل طول، وزنتر و تعداد ریشه ایجاد ننمود. به نظر میرسد مدت زمان کوتاه مجاورت گیاهان با تنش و بالا بودن ضریب تغییرات از دلایل عمده چنین پاسخی باشند. صفات وزن خشک و تعداد ریشه به ترتیب در سطح احتمال پنج و یک درصد معنیدار شدند. تنش کلرید سدیم موجب افزایش میزان پرولین در هر دو رقم حساس و متحمل گردید؛ اگرچه میزان افزایش پرولین در رقم حساس به مراتب بیشتر از رقم متحمل بود. بررسی پروتئوم ریشه گندم در رقم حساس با روش الکتروفورز دو بعدی منجر به شناسایی تعداد 21 لکه پروتئینی با تغییرات بیان معنی دار شد که شش لکه پروتئینی افزایش بیان و 15 لکه پروتئینی کاهش بیان نشان دادند. در رقم متحمل تغییرات بیان 49 لکه پروتئینی معنی دار گردید که از بین آنها 14 لکه پروتئینی افزایش بیان و 35 لکه پروتئینی کاهش بیان نشان دادند. پروتئینهای یافت شده بر اساس عملکرد بیولوژیکی در گروههای مهمی مانند پروتئینهای دخیل در متابولیسم انرژی، مهار کنندههای ROSها و سم زدایی، ترجمه پروتئین، پردازش و تخریب، پروتئینهای مرتبط با دیواره سلولی، پروتئینهای مرتبط با متابولیسم اسیدهای آمینه و هورمونها، شبکه انتقال سیگنال درگیر در پاسخ به تنش کلرید سدیم، اسکلت سلولی، پروتئینهای مرتبط با رونویسی، پروتئینهای مرتبط با همبستگی سطح mRNA و پروتئین تقسیم شدند.
فهرست مطالب
عنوان صفحه
TOC \h \z \t “B Lotus16;1″ مقدمه PAGEREF _Toc363203790 \h 1فصل اول: بررسی منابع
1-1- اهمیت گیاه‌شناسی و سطح زیرکشت گندم PAGEREF _Toc363203791 \h 31-1-1- تکامل و ژنتیک گندم PAGEREF _Toc363203792 \h 31-2- تنش شوری PAGEREF _Toc363203793 \h 41-2-1- درک تنش شوری PAGEREF _Toc363203794 \h 61-2-2- واکنش‌های عمومی گیاهان نسبت به تنش شوری PAGEREF _Toc363203795 \h 81-2-2-1- تاثیر شوری بر رشد گیاه PAGEREF _Toc363203796 \h 91-2-2-2- تاثیر شوری بر رشد ریشه گیاه PAGEREF _Toc363203797 \h 101-2-2-3- اثر تنش شوری بر مواد آلی محصول و اسیدهای آمینه گیاه PAGEREF _Toc363203798 \h 111-2-2-4- اثر شوری بر تشکیل رادیکال‌های آزاد در گیاه PAGEREF _Toc363203799 \h 151-2-3- نشانگرهای پروتئینی و پروتئومیک PAGEREF _Toc363203800 \h 151-2-4- پروتئومیک و تنش PAGEREF _Toc363203801 \h 271-2-5- پروتئومیک و تنش شوری PAGEREF _Toc363203802 \h 28فصل دوم: مواد و روش‌ها
2-1- مواد و روش انجام آزمایش PAGEREF _Toc363203803 \h 352-1-1- مشخصات محل اجرای آزمایش PAGEREF _Toc363203804 \h 352-1-2- مواد گیاهی مورد استفاده PAGEREF _Toc363203805 \h 352-1-3- روش انجام آزمایش PAGEREF _Toc363203806 \h 362-1-4- برداشت ریشه ها PAGEREF _Toc363203807 \h 372-2- صفات مورد اندازه‌گیری PAGEREF _Toc363203808 \h 382-3- تجزیه‌های آماری PAGEREF _Toc363203809 \h 402-4- آزمایشات الکتروفورز دو بعدی PAGEREF _Toc363203810 \h 402-4-1- تهیه ژل بعد اول (IEF) PAGEREF _Toc363203811 \h 412-4-2- استخراج پروتئین PAGEREF _Toc363203812 \h 422-4-3- حل کردن پروتئین PAGEREF _Toc363203813 \h 432-4-4- تهیه ژل بعد دوم (SDS-PAGE) PAGEREF _Toc363203814 \h 452-4-5- رنگ‌آمیزی PAGEREF _Toc363203815 \h 482-4-6- تصویر برداری و تجزیه کمی لکه‌های پروتئینی PAGEREF _Toc363203816 \h 51فصل سوم: نتایج و بحث
3-1- تجزیه واریانس صفات PAGEREF _Toc363203817 \h 533-2- اثر کلرید سدیم بر خصوصیات ریشه PAGEREF _Toc363203818 \h 533-3- اثر کلرید سدیم بر میزان پرولین PAGEREF _Toc363203819 \h 573-4- تجزیه و تحلیل پروتئوم بافت ریشه PAGEREF _Toc363203820 \h 583-5- نقش پروتئین‌های شناسایی شده PAGEREF _Toc363203821 \h 683-5-1- متابولیسم انرژی PAGEREF _Toc363203822 \h 693-5-2- مهار ROS و سم زدایی PAGEREF _Toc363203823 \h 733-5-3- ترجمه پروتئین، پردازش و تخریب PAGEREF _Toc363203824 \h 763-5-4- پروتئین‌های مرتبط با دیواره سلولی PAGEREF _Toc363203825 \h 783-5-5- پروتئین‌های مرتبط با متابولیسم اسیدهای آمینه و هورمون‌ها PAGEREF _Toc363203826 \h 803-5-6- شبکه انتقال سیگنال درگیر در پاسخ به تنش کلرید سدیم PAGEREF _Toc363203827 \h 833-5-7- اسکلت سلولی PAGEREF _Toc363203828 \h 843-5-8- پروتئین‌های مرتبط با رونویسی PAGEREF _Toc363203829 \h 853-5-9- پروتئین‌های مرتبط با همبستگی سطح mRNA و پروتئینهای مربوطه PAGEREF _Toc363203830 \h 86منابع
منابع PAGEREF _Toc363203831 \h 89

مقدمهگندم (Triticum aestivum L.) یکی از گیاهان زراعی مهم است که از سالیان بسیار دور، قبل از آن که بشر به موارد مصرف سایر گیاهان پی ببرد، از آن به عنوان مهمترین منبع غذایی استفاده میکرد. این گیاه از نظر تولید و سطح زیر کشت مهمترین محصول کشاورزی ایران است (خدابنده، 1382). با توجه به رشد جمعیت و نیاز روز افزون به محصولات کشاورزی به ویژه گندم میبایست تولید گندم را در کشور افزایش داد. . به علت محدود بودن سطح زمینهای قابل کشت، افزایش تولید گندم مستلزم افزایش عملکرد در واحد سطح است. افزایش عملکرد در واحد سطح به دو روش، یکی اعمال روشهای زراعی پیشرفته و دیگری تولید ارقام مناسب از نظر کیفیت و کمیت عملکرد، مقاومت به بیماریها و تحمل تنشهای محیطی قابل حصول است (اهدایی، 1388).
تنش در گیاه به مفهوم انحراف در فیزیولوژی، نمو و عملکرد طبیعی آن است که اغلب مضر بوده و آسیبهای برگشت ناپذیری به سیستم گیاهی وارد مینماید. بسیاری از موجودات زنده مثل ویروسهای بیماریزای گیاهی، باکتریها، قارچها، نماتدها، حشرات و برخی گیاهان گلدار، انگل گیاهان هستند؛ که از آنها به عنوان ” تنشهای زیستی” یاد میشود. در مقابل، “تنشهای غیرزیستی” توسط اشیا یا مواد و یا شرایط غیرزنده به گیاهان تحمیل میشوند. شوری، دمای محیط، رطوبت نسبی، تابش خورشید، مواد مغذی خاک و سایر ویژگیهای فیزیکوشیمیایی خاک موجب تنشهای غیرزیستی در گیاه میشوند (ناگاراجان، 2010). تنشهای محیطی از قبیل خشکی، شوری و سرما نقش مهمی بر روی عملکرد گیاهان زراعی و بقای آنها دارند (لاتینی و همکاران، 2007). تنش شوری یکی از مهمترین تنشهای غیرزیستی میباشد که اثر نامطلوبی بر روی کمیت و کیفیت محصولات زراعی دارد، به طوری که 20 درصد از زمینهای زراعی آبی در جهان متاثر از تنش شوری هستند (ژائو و همکاران، 2007). به دلیل قرارگیری ایران در منطقه آب و هوایی خشک و نیمه خشک، نزدیک به 50 درصد سطح زیر کشت محصولات کشاورزی، به درجات مختلف با مشکل شوری و قلیایی بودن مواجه میباشد (میر محمدی میبدی و قره یاضی، 1381).
با پیشرفت سریع در تکنیکهای استخراج ، تفکیک و شناسایی پروتئین، تکنولوژی پروتئومیک یک نقش کلیدی را در توسعهی مجموعه پروتئینهای مرتبط با فعالیت زیستی بازی میکند (وانگ و همکاران، 2011). پروتئومیک یک روش مبتنی بر تکنیک الکتروفورز دوبعدی است. هر پروتئین یک نقطۀ ایزوالکتریک دارد که در آن بار مثبت و منفی پروتیئن با هم برابر میشود. در الکتروفورز بعد اول از این خاصیت بهره میگیرند. ژل بعد اول را به بعد دوم که همان الکتروفورز SDS-PAGE معمولی است منتقل میکنند. در الکتروفورز بعد دوم حرکت پروتئینها در میدان الکتریکی بر اساس وزن مولکولی صورت میگیرد (لیبلر، 2002). پروتئومیک میتواند ابزاری قوی برای شناسایی ژنهای کاندیدای مقاومت به تنش باشد (چن و هارمون، 2006). تحقیقات متعددی از پروتئومیک جهت شناسایی پروتئینهای پاسخگو به شوری استفاده نمودهاند. پروتئینهای زیادی یافت شدهاند که بیان آنها هماهنگ با غلظت نمک تنظیم میشود. این پروتئینها در فرآیند متابولیسم انرژی، مهار کنندههای ROS و زدودن سموم از آنزیمها، ترجمه پروتئین، پردازش و تخریب، پروتئینهای مرتبط با دیواره سلولی، پروتئینهای مرتبط با متابولیسم اسیدهای آمینه و هورمونها، شبکه انتقال سیگنال درگیر در پاسخ به تنش کلرید سدیم، اسکلت سلولی، پروتئینهای مرتبط با رونویسی و پروتئینهای مرتبط با همبستگی سطح mRNA و پروتئین دخیل هستند (جیانگ و همکاران، 2007).

1-1- اهمیت گیاهشناسی و سطح زیرکشت گندم
گندم (Triticum aestivum L.) یکی از قدیمی ترین و اولین گیاهان زراعی ‌است که به عنوان ماده اولیه تهیه نان در تغذیه بشر نقش اساسی ایفا کرده است (رضوانی مقدم و کوچکی، 2001).
گندم نان گیاهی یکساله، تکلپه و علفی از خانواده گندمیان (گرامینه) و جنس تریتیکوم میباشد که دارای گونههای زراعی و خودرو است (بهنیا، 1376). از لحاظ واکنش به دوره نوری از دسته گیاهان روزبلند است. ریشه گندم افشان و سطحی است. ساقه آن راست استوانهای و بندبند است و دارای گل آذین سنبله میباشد (خدابنده، 1382). این گیاه کاملا خودبارور نبوده و یک تا چهار درصد دگرباروری دارد (خدابنده، 1382). گندم گیاهی است که در مساحت وسیعی از زمینهای کشاورزی دنیا کشت می شود. این گیاه از نظر تولید و سطح زیر کشت مهمترین محصول کشاورزی ایران است (خدابنده، 1382). بر اساس آمارهای اعلام شده سطح زیر کشت گندم در سال 2011، برابر با 220 میلیون هکتار و میزان تولید آن 08/704 میلیون تن و در ایران سطح زیر کشت آن برابر با 085/7 میلیون هکتار با میزان تولید 36/14 میلیون تن بوده است (فائو، 2013).
1-1-1- تکامل و ژنتیک گندم
منشا ژنتیکی گندم مثال بارزی از ترکیب گونههای خویشاوند در طبیعت برای تشکیل یک سری پلیپلوئید است (ارزانی، 1380). گندم یک آلوپلوئید قطعهای است که شامل سه ژنوم A، B و D است که از لحاظ ژنتیکی هومیولوگ هستند. DNA هاپلوئید گندم شامل 1010×7/1 جفت باز است. دلیل بزرگ بودن ژنوم گندم، پلیپلوئیدی و مضاعف شدنهای زیاد است. بیش از 80 درصد ژنوم گندم را توالیهای تکراری تشکیل میدهد (یزدی صمدی و عبدمیشانی، 1383). طبقه بندی ژنتیکی گندم توسط فلکس برگر (نقل از بهنیا، 1376) بر اساس تعداد کروموزوم آنها انجام گرفته و شامل سه گروه دیپلوئید، تتراپلوئید و هگزاپلوئید میباشد. گندم نان از گروه گندمهای هگزاپلوئید با 42 کروموزوم است و به گندمهای نرم یا معمولی یا نان معروف هستند (خدابنده، 1382).
1-2- تنش شوریتنشها ، پاسخهای مشترکی را در گیاهان القا میکنند ولی در شروع سیگنال با هم تفاوت داشته و همچنین گیرندههای آنها متفاوت میباشند. این تنشها با بیان یک سری از ژنها، گیاه را قادر به ترمیم آسیب ناشی از تنش کرده یا گیاه را در برابر تنشهای محیطی که در آینده پیش خواهد آمد حمایت میکنند. یعنی در واقع گیاه را با محیط سازگار کرده و بقای آن را بیشتر تأمین و تضمین میکنند و از این طریق به نوعی با محیط خود سازش یافته یا تطابق مییابند (باجوز و حیات، 2008). تخمین زده شده است که تنها کمتر از 10 درصد زمینهای زراعی فاقد تنشهای عمده محیطی هستند (همدیا و شداد، 2010). تنشهای محیطی از قبیل خشکی، شوری و سرما نقش مهمی بر روی عملکرد گیاهان زراعی و بقای آنها دارند (لاتینی و همکاران، 2007).
تنش شوری یکی از مهمترین تنشهای غیرزیستی میباشد که اثر نامطلوبی بر روی کمیت و کیفیت محصولات زراعی دارد، به طوری که 20 درصد از زمینهای زراعی آبی در جهان متاثر از تنش شوری هستند (ژائو و همکاران، 2007). به دلیل قرارگیری ایران در منطقه آب و هوایی خشک و نیمه خشک، نزدیک به 50 درصد سطح زیر کشت محصولات کشاورزی، به درجات مختلف با مشکل شوری و قلیایی بودن مواجه میباشد (میر محمدی میبدی و قرهیاضی، 1381). هرگاه بارندگی محدود باشد، نمک موجود در خاک شسته نشده و بدلیل افزایش املاح مقدار محصول کاهش می‌یابد (حکمت شعار، 1372). از نمکهای محلولی که سهم زیادی در شور شدن دارند می‌توان به کاتیون‌های سدیم، منیزیم، کلسیم و آنیون‌های کلر، سولفات، بی‌کربنات و گاهی کربنات‌ها اشاره نمود. در این میان غلظت‌های بالای سدیم رایج‌ترین نوع شوری مناطق مختلف دنیا است (رحمانی، 1377). همچنین آبی که برای آبیاری مورد استفاده قرار می‌گیرد نیز دارای املاح محلول است که به هنگام تبخیر در طول زمان این املاح در خاک تجمع یافته و باعث شوری خاک می‌شوند (حکمت شعار، 1372).
مشکلات کشاورزی خاک‌های شور و بویژه سدیمی را می‌توان به دو گروه عمده، یعنی اشکالات مربوط به جذب آب و عناصر بوسیله گیاهان و اثرات ناشی از خواص نامطلوب فیزیکی خاک تقسیم نمود (کریمیان، 1371). انسان به طرق مختلف موجب افزایش نمک در خاک می‌شود، که این پدیده به نام شوری ثانویه معروف شده است (کریمی و شکاری، 1375). با توجه به نقش شوری در کاهش عملکرد گیاهان از یک طرف و محدودیت منابع تولید و رشد بی‌رویه جمعیت از طرف دیگر مقابله با مشکل شوری یکی از اولویت‌های تحقیقات کشاورزی به شمار می‌آید. در بررسی‌های گسترده‌ای که جهت حل معضل شوری به عمل آمده است دو رهیافت عمده توصیه شده است (اپستین، 1985):
1- تغییر محیط و اصلاح شرایط تولید گیاهان که به عنوان یک رهیافت غیرزیستی شناخته شده است و دو مبحث عمده را در برمی‌گیرد:
الف) پیدا کردن راه‌های مؤثر و کم هزینه در امر شیرین کردن آب دریاها برای اهداف آبیاری.
ب) اصلاح اراضی شور و نیمه شور از طریق ایجاد زهکشی و آبشویی که این عمل خود نیاز به آب غیر شور دارد.
2- ایجاد و بهره‌گیری از گیاهان زراعی متحمل به شوری، که از آن تحت عنوان رهیافت زیستی یاد می‌شود. به هر حال با مدنظر قرار دادن محدودیت‌های فراوان در توسعه سطح زیر کشت گیاهان زراعی از یکسو و ترمیم و اصلاح اراضی شور از سوی دیگر به نظر می‌رسد که در حال حاضر تلاش برای شناسایی و اصلاح گیاهانی که بتوانند در مقابل شوری محیط مقاومت کرده و محصول قابل قبول را تولید کنند به عنوان راه‌حلی کوتاه مدت ولی مؤثر در برابر تنش شوری می‌باشد، به طوری که در چند دهه اخیر نیز محققان بیشتر بر روی رهیافت دوم تحت عنوان «رهیافت زیستی» تأکید بیشتری دارند (رحمانی، 1377).
1-2-1- درک تنش شوریتنش شوری مانند بسیاری دیگر از تنشهای زیستی و غیرزیستی، پیش از اینکه هرگونه تغییری در غلظت کلسیم و pH سیتوپلاسمی سلولها رخ دهد، میبایست به نوعی توسط گیاه درک شود. تنش شوری در گیاهان توسط تنش اسمزی و سمیت یونی (سدیم و یا کلر) درک میشود و این تنشها میتوانند در هر دو سطح داخلی و خارجی غشاء پلاسمایی توسط پروتئینهای تراغشایی و یا درون سیتوسول توسط آنزیمها درک شوند. بسیاری از حسگرهای اسمزی مطرح در درک تنش اسمزی توسط شوری شدید فعال میشوند (عبدالقادر و لیندبرگ، 2010). هیپراسمزی و سیگنالهای مختص یونی هردو توسط سلولهای گیاهی درک میشوند. اگرچه سیگنالهای مختص یونی در تنظیم نقل و انتقالات یون سدیم، بسیار مهمتر از هیپراسمزی هستند ولی تنش اسمزی نیز در این میان دخیل است. تنش اسمزی سنتز آبسیزیک اسید را فعال نموده، بدین ترتیب میتواند رونویسی AtNHX1 را (که ژن کد کننده مبادلهگر Na+H+ واکوئلی میباشد) افزایش دهد. تنش اسمزی میتواند تا حدودی توسط کانالهای فعال شونده با اتساع و پروتئین کینازهای تراغشایی، مثل هیستیدین کینازهای دوجزئی و کینازهای متصل به دیواره درک شود.
از این که یون سدیم چگونه توسط سیستمهای سلولی مختلف درک میشود اطلاعات اندکی در دسترس است. به طور نظری یون سدیم چه قبل و چه بعد از ورود به سلول و یا در هر دو حالت میتواند درک شود. یون سدیم خارج سلولی میتواند توسط یک پذیرنده غشایی درک شود، در حالی که یون سدیم درون سلولی میتواند توسط پروتئینهای غشایی یا هر یک از آنزیمهای فراوان حساس به یون سدیم در سیتوپلاسم درک شود. آنتیپورتر (ناهمسو ناقل) Na+H+ غشایی SOS1 حسگر یون سدیم میباشد. انتهای سیتوپلاسمی بلند و غیر عادی SOS1 نشان میدهد که این پروتئین نه تنها یون سدیم را منتقل میکند، بلکه احتمالا در درک آن نیز نقش دارد. گزارش شده است که بسیاری از ناقلین با دنبالهها یا حلقههای سیتوپلاسمی بلند، از نقش حسگری نیز برخوردار میباشند (ژو، 2003).
ژن RPK1 القا شده توسط خشکی، شوری شدید و سرما در آرابیدوپسیس شناسایی شده است. تجزیه توالی این ژن مشخص نموده است که کد کننده یک پروتئین کیناز سرین/ترئونین میباشد. این پروتئین در قسمت خارج سلولی خود دارای توالی غنی از تکرار لوسین (LRR) است که گمان میرود در درک سیگنالهای رشدی و محیطی با وساطت برهمکنشهای پروتئین-پروتئین دخیل میباشد. سطوح mRNA این پروتئین به طور چشمگیری یک ساعت پس از اعمال شوری شدید (250 میلی مولار NaCl) یا خشکی افزایش مییابد؛ در شش ساعت به بیشترین مقدار می رسد و تا 18 ساعت در این سطح باقی میماند (لیو و همکاران، 2000).

1-2-2- واکنش‌های عمومی گیاهان نسبت به تنش شوریاثرات تنش شوری در گیاهان را به طور عمده به دو گروه کوتاه مدت و درازمدت تقسیم‌بندی می‌کنند. از اثرات کوتاه مدت تنش شوری می‌توان به کاهش رشد ساقه و احتمالاً بروز واکنش ریشه به کمبود آب اشاره نمود. از اثرات درازمدت تنش شوری نیز می‌توان به کاهش فعالیت فتوسنتزی در اثر انتقال مقدار زیادی نمک به برگهای کاملاً توسعه یافته اشاره کرد (میر محمدی میبدی و قرهیاضی، 1381).
تاثیرات زیانبار تنش شوری در گیاه بدین شرح میباشند (توتجا، 2007):
شوری با رشد و نمو گیاه تداخل نموده و می تواند منجر به شرایط خشکی فیزیولوژیک و سمیت یونی شود. بدین ترتیب تنشهای شوری و خشکی اغلب جنبههای فیزیولوژیکی و متابولیسمی گیاه را متاثر نموده، با ایجاد هر دو تنش هیپریونی و هیپراسموزی، در نهایت موجب مرگ گیاه میشوند.
اساس فیزیولوژی تنشهای شوری و خشکی با یکدیگر همپوشانی دارد زیرا وجود شوری زیاد در خاک منجر به کاهش پتانسیل آب در آن میشود و بدین ترتیب جذب آب، همانند دریافت مواد غذایی، برای گیاه دشوارتر میشود.
شوری باعث تنشهای اختصاصی یونی شده، نسبت یون پتاسیم به یون سدیم را تغییر میدهد. یون سدیم بیرونی میتواند اثر منفی بر جذب یون کلسیم داشته باشد.
شوری منجر به افزایش تدریجی غلظت یونهای سدیم و کلر در سیتوسول شده، سرانجام میتواند برای سلول زیانآور شود. یون سدیم میتوان پتانسیلهای غشایی را از بین برده و بنابراین جذب یون کلر را تسهیل نماید.
غلظت بالای یون سدیم (بالای 100 میلی مولار) برای متابولیسم سلول سمی بوده و میتواند فعالیت بسیاری از آنزیمهای ضروری، تقسیم و توسعه سلولی را متوقف کند؛ موجب تخریب غشاء و عدم تعادل اسمزی شود و در نتیجه باعث توقف رشد شود.
غلظت بالای یون سدیم میتواند منجر به تولید گونههای فعال اکسیژن و کاهش فتوسنتز شود.
پتاسیم از عناصر ضروری مورد نیاز برای رشد است. تغییرات غلظت یون پتاسیم (به علت اثر تنش شوری شدید) اختلال در تعادل اسمزی، عملکرد روزنه ای و کنش برخی آنزیمها را باعث میشود.
شوری به سلولها در برگهای تعرق کننده آسیب میرساند، که منجر به جلوگیری از رشد میشود. این اثر مختص شوری یا مازاد یونی، باعث سمیت درون سلول میشود. نمک می تواند در برگهای مسن تجمع یابد و باعث مرگ آنها شود.
1-2-2-1- تاثیر شوری بر رشد گیاهمطالعات متعددی در مورد اثر شوری بر روی رشد گیاهان نشان میدهد که حساسیت رشد گیاهان به تنش شوری، وابسته به ژنوتیپ، سن و میزان مقاومت گونه گیاهی به شوری است (پاریدا و همکاران، 2004). آوالبایف و همکاران (2009) رشد گیاهچههای گندم را تحت شرایط شوری در گلخانه بررسی کردند و اظهار داشتند که با افزایش سطوح شوری رشد گیاهچهها با کاهش معنی داری روبرو میشود. همچنین تنش شوری باعث کاهش سرعت تقسیم سلولهای مریستم ریشه و کوتولگی گیاهچهها شد. گزارش شده کلرید سدیم با کاهش تقسیم سلول از رشد گندمهای چهار روزه میکاهد. همچنین اگر برای مدت هفت ساعت دانههای گندم را در کلرید سدیم قرار دهیم تقسیم سلولی را در ریشه گیاه کاهش میدهد؛ به هر حال شاخص میتوزی رشد، در سلولهای مریستم اولیه ریشه بیشتر بوده و شوری شاخص میتوزی سلولها را کاهش میدهد (شاکیروا و همکاران، 2003).
نصیر (2001) اثر زیان آوری شوری را بر تمام مراحل رشد بوتههای جو گزارش کرد اما این اثر در مراحل رویشی بیشتر از شروع گلدهی و پر شدن دانه بود. وی همچنین بیان نمود که کاهش معنی دار سطح برگ و ارتفاع ساقه بوتههای جو با افزایش شوری به علت اثرات سمی یونهای سدیم و کلر در متابولیسم گیاهی و عدم توازن عناصر یا کاهش دسترسی به آب برای رشد متعادل (به علت اثر اسمتیک شوری) است. در طول دوره رشد، گیاهان حداکثر فتوسنتز، تنفس و جذب مواد معدنی را دارند. گزارش شده در یکی از کولتیوارهای مقاوم گیاه برنج که تحت تنش شوری قرار گرفته است طول گیاه کاهش یافت ودر کولتیوار دیگر که به شوری حساس بود کاهش طول گیاه بیشتر شد (دمیرال و تورکان، 2005). ازطرفی شوری فعالیت متابولیسمی سلولهای گیاه را کاهش داده در نتیجه به طور واضح جلوی رشد گیاهان را میگیرد (تاکمورا و همکاران، 2000).
1-2-2-2- تاثیر شوری بر رشد ریشه گیاهبا توجه به سختی مطالعه ریشه در شرایط مزرعه‌ای گزارشات بسیار کمی در رابطه با تاثیر تنش‌های محیطی بر رشد و عملکرد ریشه در مقایسه با بخش هوایی در دسترس می‌باشد. رشد ریشه در مقایسه با بخش هوایی کمتر تحت تاثیر شوری قرار می‌گیرد ولی موجب ایجاد تغییرات مورفولوژیکی و آناتومی ریشه‌ها در برخی از گونه‌ها میشود (میر محمدی میبدی و قرهیاضی، 1381). گزارشهای فراوانی وجود رابطه منفی بین تنش شوری و رشد ریشههای اولیه و ثانویه، حجم ریشه، وزنتر و خشک ریشه و ساقه، ضخامت ساقه و ارتفاع بوته را تاکید میکنند (اشرف و احمد، 2000). سکیب و همکاران (2004) نیز تأثیر تنش شوری بر رشد ریشه را منفی گزارش کرده‌اند. البته برخی از غلظت‌های نمک می‌توانند رشد ریشه‌ها را تحریک کنند، در صورتیکه از رشد ساقه جلوگیری می‌کنند. در گیاه نخود طول ریشه در تیمار 120 میلی‌مول کلرید سدیم، 40 تا 50 روز بعد از اعمال شوری نسبت به شاهد افزایش پیدا کرد، اما بعد از یک دوره کاهش یافت. در درازمدت شوری مانع رشد ریشه و توزیع مواد غذایی معدنی در گیاهان می‌شود (میر محمدی میبدی و قرهیاضی، 1381). افزایش سطح ریشه، از طریق افزایش سطح جذب، در افزایش کارایی آب و مواد غذایی مهم است .بنابراین، ریشههای طویلتر و دارای سطح بیشتر میتوانند امکان تحمل به شوری را فراهم آورند. سطح ریشه نشان دهنده سطح تماس گیاه با خاک و دسترسی بیشتر به آب است (کانت و کافکافی ، 2005). سینگ و همکاران (2000) بیان داشتند گیاهانی که ریشه اصلی طویلتر و تعداد ریشههای جانبی بیشتری دارند نسبت به گیاهانی که این خصوصیت را کمتر دارند ، تحمل بیشتری به تنش شوری دارند. مین و همکاران (1993) با انجام آزمایشی روی گندم زمستانه گزارش کردند که تنش شوری وزنتر ریشه را کاهش داد.
1-2-2-3- اثر تنش شوری بر مواد آلی محصول و اسیدهای آمینه گیاه
شوری میتواند به دلیل افزایش پروتئولیز و کاهش سنتز پروتئین مقدار پروتئین بافت گیاهی را کاهش دهد. پیوند بین کلروفیل و پروتئینهای کلروپلاستی، بستگی به مقدار یونهای سلول دارد. اگر شوری زیاد شود پیوندها سست شده و کلروفیل تخریب میشود. شوری اثر بازدارنده بر فعالیت ترانس آمیناسیون داشته باعث تجمع آمونیوم میگردد و بدین ترتیب موجب کاهش سنتز پروتئینها و اسیدهای آمینه میگردد. از طرف دیگر تجزیه و هیدرولیز پروتئینها موجب انباشتگی اسیدهای آمینه میشود. برخی از این اسیدهای آمینه، خود به عنوان یک متابولیت سمی عمل میکنند. هنگام تنش اسمزی بیان ژنهای بیوسنتزی پروتئینهای وابسته به یوبیکوئیتینو پروتئینازهای مختلف القا میشود. اتصال یک پروتئین به یک یاچند یوبیکوئیتین موجب فعال شدن پروتئازهای وابسته به ATP میگردد. در این حالت درحالیکه پروتئین به اجزای آمینواسیدی خود تجزیه شده، یوبیکوئیتین دست نخورده رها میشود (لویت، 1972 ). در مورد اثر شوری در توت فرنگی گزارش شده است که پروتئین محلول این گیاه در شوری پایین افزایش و در شوری بالا کاهش مییابد. گزارش دیگری در مورد اثر شوری بر پروتئینهای گیاه Arachis hypogaea، نشان میدهد که ساخت پروتئینهای جدید دراین گیاه تحت تنش شوری القا شده است (پاریدا و همکاران، 2004). از آزمایشات اثر شوری بر روی گیاهان و عکس‌العمل گیاهان نسبت به این تنش چنین استنباط می‌شود که اسیدهای آمینه آزاد از بین محلولهای تنظیم کننده اسمزی آلی، نقش حیاتی‌تری را برعهده دارند (اشرف و مک نیلی، 2004)، که از مهمترین آنها می‌توان سرین، گلایسین، آرژینین، والین، لوسین و پرولین را نام برد. از اسیدهای آمینه غیرپروتئینی می‌توان به سیترولین و ارنیتین اشاره نمود. بطور کلی اسیدهای آمینه آزاد با افزایش سطح شوری افزایش می‌یابند (پاریدا و داس، 2005). در مورد تجمع اسیدآمینه پرولین در گونههای گیاهی مختلف در اثر انواع تنشهای محیطی مختلف گزارشهای فراوانی وجود دارد (کاوی کیشور و همکاران، 2005). پرولین در پاسخ به بسیاری از تنشهای محیطی از جمله خشکی، شوری (دلونی و ورما، 1993)، دمای بالا (کیوو و همکاران، 1986)، سرما (نایدو و همکاران، 1991)، مسمومیت با فلزات سنگین (باسی و شارما، 1993)، کمبود مواد غذایی (وایوچرت و همکاران، 1992)، آلودگی اتمسفری (آنبازهاگان و همکاران، 1988) و تشعشعات UV (پاردها و همکاران، 1995) در گیاهان تجمع مییابد.
در درون سلولهای گیاهی، پرولین به عنوان ماده تنظیم کننده تعادل اسمزی بین سیتوپلاسم و واکوئل عمل میکند (فلاورز و همکاران، 1977). علاوه بر نقش اسمولیتی پرولین، این ترکیب به عنوان مخزن کربن و نیتروژن نیز میباشد. همچنین پرولین حفاظت گیاه را در برابر صدمات رادیکالهای آزاد انجام میدهد (ماتیسیک و همکاران، 2002). کاهش مصرف پرولین برای سنتز پروتئین در طی تنش ممکن است دلیل احتمالی تجمع پرولین باشد (ستوارت، 1972).
یافتهها نشان میدهد که نقش اولیه پرولین در تحمل تنش اسمزی منحصرا به عنوان یک تنظیم کننده پتانسیل اسمزی نیست، بلکه این مولکول به سلول کمک میکند تا بر تنش اکسیداتیو نیز غلبه کند. از دیگر خواص پرولین، حفاظت آنزیمها از تجزیه شدن (راجنداراکومار و همکاران، 1994). تنظیم اسید سیتوسیلیک (ونکمپ، 1989)، حذف رادیکالهای آزاد (اشرف و فولاند، 2007)، پایداری ساختار دیواره سلولی و پروتئین‌ها (سرینیواز و بالاسوبرامانیان، 1995)، برقراری تعادل در نسبت NADHNAD+ (آلیا و سارادهی، 1991) و فعال سازی منبع انرژی (کوهل و همکاران، 1998) است.
مورانت-مانسیو و همکاران (2004) اظهار داشتند در سه گیاه چاودار، تریتیکاله هگزاپلوئید و Triticum dicoccum farrum با افزایش میزان شوری، محتوای پرولین آزاد در برگ و ریشه اختلاف معنی داری با شاهد نشان دادند. آهنگ صعودی میزان پرولین با افزایش شوری در ریشه شبیه به برگ بود ولی از نظر کمیت میزان تجمع این ماده در برگ چندین برابر ریشه بود. با این وجود، با توجه به مقدار کم این ماده در بافتهای گیاهی، سهم پرولین در تنظیم پتانسیل اسمزی نسبت به سایر اسمولیتهای آلی کمتر بود. پوستینی و همکاران (2007) نیز افزایش پرولین بر اثر شوری را در گندم گزارش کردند، اما این افزایش در رقم حساس به مراتب بیشتر از رقم مقاوم به شوری بود و نتیجه گرفتند که پرولین نمی تواند نقش حفاظتی در مقابل تنش شوری داشته باشد. سیلوریا و همکاران (2003) گزارش کردند تغییرات افزایش غلظت پرولین در ارقام گندم حساس به شوری بیشتر است و این تغییرات در مراحل مختلف رشد و در اندامهای هوایی و ریشه متفاوت از یکدیگر میباشد. افزایش غلظت پرولین برگها با افزایش فعالیت آنزیم پروتئاز، تجمع اسید آمینهها و آمونیوم و کاهش میزان کلروفیل برگ و پروتئین همراه است. میقانی و ابراهیم زاده (1381) گزارش نمودهاند در گیاه گندم، رقم قدس (حساس به شوری) تحت تنش شوری غلظت پرولین نسبت به گیاهان بدون تنش به 9/2 برابر رسیده. همچنین افزایش غلظت پرولین و کاهش فعالیت آنزیم پرولین دهیدروژناز در برگ گندم قدس (حساس به شوری) بیشتر از گندم بولانی (مقاوم به شوری) بود. توانایی تولید آنتی اکسیدان سلول گیاهی تحریک شده است. تولید پرولین و سایر سازگار کنندهها با مصرف مقدار زیادی از کربن حاصل از فرآیند فتوسنتز همراه بوده و بدین دلیل کاهش رشد گیاه را در پی خواهد داشت .علی و همکاران (2008) گزارش نمودند که مقدار پرولین در گیاهان متحمل بیشتر از گیاهان حساس تجمع مییابد. آنها علت رشد بهتر گیاهانی که پرولین بیشتری تجمع میدهند را تعدیل پتانسیل اسمزی میدانند که در نتیجه آن فشار تورگر سلول و پتانسیل آب برگ افزایش مییابد. همچنین گزارشهای فراوانی به این نتیجه رسیدهاند که کاربرد پرولین به صورت محلول پاشی برگی بر روی گیاهان تحت تنش شوری باعث افزایش تحمل آنها میشود (کلوسن، 2005؛ علی و همکاران، 2007).
بعضی از گزارشها نیز از وجود یک رابطه همبستگی بالا بین تجمع پرولین با افزایش تحمل به شوری حکایت میکنند (احمد و همکاران، 2010). تجمع پرولین تحت تنش شوری در گیاهان فراوانی (از هر دو گروه هالوفیت ها و گلوفیت ها) مانند ذرت (سیسک و کاکرلر، 2002)، سورگوم (دلاسردا و همکاران، 2005)، توت (هاریناسوت و همکاران، 2003) و آفتابگردان (شهباز و همکاران، 2010) مشاهده شده است. با این وجود همیشه رابطه مثبتی بین افزایش شوری و مقدار پرولین وجود ندارد. در گیاهانی مانند گوجه فرنگی (عزیز و همکاران، 1998)، سویا (موفتاه و میشل، 1987)، لوبیا (اشرف، 1989)، برنج (لوتس و همکاران، 1999) و نخود فرنگی (سانچز و همکاران، 1998) نتایج کاملا متفاوتی از نظر میزان تجمع پرولین تحت تنش شوری گزارش شده است. در این گیاهان با افزایش میزان شوری نه تنها مقدار پرولین بیشتر نمیشود بلکه کاهش نیز مییابد.
1-2-2-4- اثر شوری بر تشکیل رادیکالهای آزاد در گیاهتنش شوری، کم آبی را بر گیاه تحمیل میکند زیرا اسمز بر پهنه وسیعی از فعالیتهای متابولیکی موثر است (مونس، 2002). این کمبود آب منجر به تشکیل گونههای فعال اکسیژن (ROS) مثل سوپراکسید، هیدروژن پراکسید، رادیکال هیدروکسیل (هالیول و گوتریج، 1985) و اکسیژن منفرد (الستنر، 1987) میشود. این گونههای فعال اکسیژن از طریق آسیب اکسیداتیو به لیپیدها (وایز و نیلور،1987)، پروتئینها و اسیدهای نوکلئیک (ایملای و لین، 1988) متابولیسم طبیعی سلول را تخریب میکنند.
اولین اثر تنش شوری نتیجه عدم تعادل یونی و تنش هیپراسموتیک میباشد که به دنبال آن تنش اکسیداتیو اتفاق افتاده، تثبیت Co2 محدود میشود. در نتیجه احیای کربن در سیکل کلوین کاهش پیدا کرده اکسیده شدن NADP+ (گیرنده الکترون فتوسنتزی) کم میشود. وقتی که فردوکسین در طول انتقال الکترون فتوسنتزی از فتوسیستم یک به اکسیژن، به شکل رادیکال سوپر اکسید کاهش مییابد، واکنشی به نام واکنشMehler انجام میشود که هدف واکنش رادیکالهای اکسیژن میباشد (کائو و همکاران، 2003).
1-2-3- نشانگرهای پروتئینی و پروتئومیکاستفاده از نشانگرهای پروتئینی در اواسط قرن بیستم متداول گردید. مبنای کار این نشانگرها تنوع در پروتئینها میباشد. از جمله نشانگرهای پروتئینی میتوان به پروتئینهای ذخیرهای مثل زئین، گلیادین و گلوتنین اشاره کرد. یکی دیگر از انواع نشانگرهای پروتئینی ایزوزیمها هستند که فرمهای مختلف الکتروفورزی یک آنزیم را نشان میدهند. این نوع از نشانگرهای پروتئینی تغییرات در سطح فرآوردههای ژنی را به صورت هم بارز نشان میدهند. از مزایای این نشانگرها میتوان به کم هزینه بودن، تجزیه سریع دادههای حاصل از آن و چند شکلی بالای آنها در مقایسه با اکثر نشانگرهای مورفولوژیکی اشاره نمود. اگرچه این نشانگرها برخی از معایب نشانگرهای مورفولوژیکی را برطرف کردند ولی آنها نیز دارای معایبی مانند محدودیت تعداد و چند شکلی کم در بین ارقام اهلی در مقایسه با نشانگرهای DNA، پوشش ژنومی ضعیف و توزیع غیرتصادفی در ژنوم میباشند. علاوه بر این برخی از ایزوزیمها وابسته به اندام، بافت و یا مرحله رشدی گیاه بوده و تحت تأثیر تغییرات پس از ترجمه نیز قرار میگیرند. یکی از روشهای بررسی الگوهای پروتئینی مبتنی بر الکتروفورز SDS-PAGE میباشد که یک روش کم هزینه، سریع و تکرارپذیر در مطالعه پروتئینها است. در این روش سدیم دو دسیل سولفات (SDS) که یک شوینده آنیونی است با اتصال به پروتئینها بار طبیعی آنها را میپوشاند و بار منفی تقریباً مشابهی در این مولکولها ظاهر میسازد. بنابراین حرکت نمونهها بر اساس وزن مولکولی آن‌ها صورت میگیرد. بیشترین مورد استفاده از این سیستم تعیین وزن مولکولی پپتیدها است که با استفاده از پروتئینهای استاندارد با وزن مولکولی مشخصی میتوان وزن مولکولی پلیپپتید مجهول را تخمین زد (نقوی و همکاران، 1384). پیشرفتهایی که در زمینۀ الکتروفورز دو بعدی با قدرت تفکیک زیاد پدید آمده و تجزیه و تحلیل هم زمان هزاران پروتئین را میسر ساخته، موجب شده که نشانگرهای پروتئین جایگاه از دست رفته خود را دوباره بازیابند و به عنوان فناوری پیشتاز در عرصۀ نشانگرهای مولکولی مطرح شوند (نقوی و همکاران، 1384). پروتئومیک با فراهم ساختن دید گستردهای از پروتئینهای بیان شده در بخشهای مختلف گیاهی و شرایط محیطی مختلف، جایگاه خاصی را در مطالعات مختلف به خصوص تحقیقات مربوط به تنشهای محیطی برای خود باز کرده است (ویلکینز و همکاران، 1996). تأثیرپذیری نشانگرها از محیط که به طور معمول به عنوان یکی از محدودیتها و نمات منفی نشانگرهای مولکولی یاد میشود در مورد این نشانگرها تبدیل به برتری شده است (نقوی و همکاران، 1384).
پروتئومیک یک روش مبتنی بر تکنیک الکتروفورز دوبعدی است. هر پروتئین یک نقطۀ ایزوالکتریک دارد که در آن بار مثبت و منفی پروتیئن با هم برابر میشود. در الکتروفورز بعد اول از این خاصیت بهره میگیرند. ژل بعد اول را به بعد دوم که همان الکتروفورز SDS-PAGE معمولی است منتقل میکنند. در الکتروفورز بعد دوم حرکت پروتئینها در میدان الکتریکی بر اساس وزن مولکولی صورت میگیرد. با بهبود سیستمهای الکتروفورز دوبعدی، تشخیص و تعیین تعداد پروتئینها با استفاده از نرم افزارهای قوی کامپیوتری، طیف سنجی جرمی و بیوانفورماتیک، استفاده از این نشانگرهای پروتئینی چشمانداز روشنی را در پیش روی خود دارد (لیبلر، 2002).
پروتئومیک رهیافت قدرتمندی برای مطالعه تغییرات بیان پروتئینهای مختلف در پاسخ به تنشهای زیستی و غیرزیستی است (زینگ و همکاران، 2002). امروزه با توجه به پیشرفت روز افزون زیست فناوری علاوه بر ژنومیک و پروتئومیک علوم دیگری نظیر ترانسکریپتومیک و متابولومیک نیز بوجود آمده است (رابیلود و چوالت، 2002). با تکمیل پروژه ژنوم انسان مشخص شد که مکانیسم مولکولی رفتار سلولها در شرایط مختلف را نمیتوان از روی توالی ژنها پیشگویی کرد. رفتار سلولی و تمام فعالیتهایی که در سلول انجام می شود بر عهده پروتئینهاست. در واقع برای ارتباط ژنوم با رفتار سلولها باید پروتئینهای سلولی را شناسایی کرد. به کلیه پروتئینهایی که در یک سلول در یک زمان مشخص بیان میشوند، پروتئوم آن سلول گفته میشود و این پروتئوم است که فاصله بین ژنوم و مکانیسم مولکولی رفتار سلول را پر میکند. برخلاف ژنوم برای هر موجود زنده نمیتوان یک پروتئوم واحد تعریف کرد. پروتئوم سلولهای مختلف با یکدیگر متفاوتاند یعنی سلولها علاوه بر پروتئینهای ضروری که در همه انواع سلولها بیان میشوند، دارای یک سری پروتئینهای اختصاصی نیز هستند. از این رو بهتر است پروتئوم را برای هر یک از انواع سلولها تعریف نمود. با این حال پروتئوم یک نوع سلول نیز همیشه ثابت نیست. سلول در برابر شرایط مختلف محیطی و پیامهایی که از سلولهای اطراف دریافت میکند، پروتئینهای مختلفی را بیان میکند. به عبارت دیگر هر سلول تحت شرایط مختلف پروتئومهای متفاوتی دارد. بنابراین برای شناسایی سازوکارهای مولکولی رفتار سلولی و واکنشهای زیستی، لازم است پروتئینهایی که در یک سلول بیان میشود، تغییرات آنها در شرایط مختلف، عملکرد آنها و همچنین برهمکنشهای بین پروتئینهای مختلف در یک سلول، بررسی شوند. به مجموعه این بررسیها، نقشهبرداری پروتئوم یا پروتئومیک اطلاق میشود. نقشهبرداری پروتئوم یا مطالعه پروتئوم به سادگی مطالعه ژنوم نیست، زیرا پروتئینها را نمیتوان همانند DNA به روشی مشابه PCR تکثیر نمود. همچنین توالیهای پلی پپتیدی نمیتوانند به توالیهای اسید آمینهای مکمل خود متصل شوند. بنابراین برای مطالعهی پروتئوم باید از ابزار و روشهای ویژهای استفاده نمود. در پروتئومیک نه تنها کلیه پروتئینهایی که در یک سلول در یک شرایط مشخص بیان میشوند، بلکه عملکرد و رفتار آنها، برهمکنش بین پروتئینهای مختلف، آرایشهایی که پس از ترجمه بر روی پروتئینها ایجاد میشود و نیمه عمر آنها در سلول نیز مورد بررسی قرار میگیرد (رابیلود و چوالت، 2002). در واقع پروتئومیک از سه بخش تشکیل شده است:
مشخص کردن کلیه پروتئینهایی که در سلول بیان میشوند:
در این بخش، کلیه پروتئینهای سلول تحت یک شرایط معین (مانند حالت استراحت، رشد، تمایز، بیماری، تاثیر دارو و …) مشخص میشود. به این ترتیب میتوان پروتئینهایی که در شرایط مختلف بیان میشوند یا میزان بیان آنها تغییر می کند را شناسایی کرد و به عملکرد آنها پیبرد.
نقشهبرداری برهمکنشهای بین پروتئینی:
پروتئینها در سلول به صورت منفرد عمل نمیکنند و اغلب تاثیر خود را با همکاری پروتئینهای دیگر و برهمکنش با آنها اعمال میکنند. نمونه بارز برهمکنشهای پروتئینی در مسیر انتقال پیام و مسیرهای بیوسنتزی مشاهده میشود. با شناسایی این برهمکنشها، به طور کارآمدتری میتوان عمل کرد و رفتار پروتئینها را مشخص کرد.
نقشهبرداری آرایشهای پروتئینی:
اغلب پروتئینها پس از ترجمه متحمل آرایشهای مختلفی مانند گلیکوزیله شدن، متیله شدن، استیله شدن، فسفریله شدن و … میشوند. این آرایشها بر فعالیت و عملکرد پروتئینها، همچنین ساختار فضایی، پایداری و نیمه عمر آنها تاثیر میگذارد. شناسایی این آرایشها، تاثیر آنها بر عملکرد پروتئینها و شرایطی که منجر به این آرایشها میشود، به شناخت رفتار و عملکرد پروتئینها کمک میکند. برای مشخص کردن پروتئینهایی که در سلول بیان میشود از کتابخانههای cDNA برای انواع مختلف سلولهای بدن استفاده شده است. اما برای مطالعه پروتئوم سلولها نمیتوان از کتابخانههای cDNA استفاده کرد. کتابخانههای cDNA فقط بیانگر کلیه mRNAهای بیان شده در یک سلول (ترانسکریپتوم) میباشد. ولی ترانسکریپتوم یک سلول مساوی با پروتئوم سلول نیست، زیرا بیان ژنها در سطح ترجمه نیز تنظیم میشود و ممکن است از روی یک ژن یک نوع mRNA ساخته شود ولی بدلیل تنظیم در سطح ترجمه، هرگز یک نوع پروتئین بیان نشود. همچنین میزان پروتئینهای مختلف در سلول تحت کنترل سیستم پروتئولیز نیز میباشد که با بررسی ترانسکریپتوم نمیتوان آن را مشخص کرد (تلن، 2007).
برای مشخص کردن پروتئینهایی که در سلول بیان میشوند از روشهای زیر استفاده میشود:
الف) الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید (PAGE) و یا SDS-PAGE
این روش در سال 1970 توسط لاملی ابداع شد. در آن دوران با این روش مطالعات علوم زیستی انجام شد و به طور وسیع از SDS-PAGE برای تفکیک پروتیئنها بر اساس اندازه استفاده گردید که دلیل آن می تواند سهولت کاربرد، تکرار پذیری، هزینه و مصرف مواد تقریبا کم آن باشد. گرچه کاربرد این روش آسان است ولی قدرت تفکیک آن تا حدی کم است. تجزیه با طیف سنجی جرمی MS نشان داده است که هر نوار پروتئینی SDS-PAGE از چند پروتئین به هم پیچیده و حتی در برخی موارد بیش از 10 پروتئین تشکیل شده است. بنابراین بایستی از روشی که بتواند قدرت تفکیک بالاتری داشته باشد استفاده نمود (گرابسی و بورگس، 2001).
ب) بکارگیری ژل الکتروفورز دوبعدی و طیف سنجی
نخستین نیاز در تجزیه پروتئوم جداسازی و آشکار سازی پروتئینهای موجود در کمپلکسهای پروتئینی (تا چند صد هزار پروتئین) میباشد. با اینکه امروزه روشهای جدا سازی متعددی برای این منظور به کار گرفته شده است (مانند روشهای تراشه پروتئین، مطالعه مستقیم مجموعه پروتئینی بوسیله طیف سنجی و برچسبهای تمایلی نشاندار شده با ایزوتوپ)، ولی الکتروفورز دوبعدی روی ژل پلیآکریلآمید کماکان به عنوان یکی از بهترین گزینهها برای این قبیل مطالعات مطرح است. این امر به خاطر ویژگی استثنایی الکتروفورز دوبعدی در جداسازی همزمان چندین هزار پروتئین و بدنبال آن امکان آشکار سازی و مقایسه هر یک از اینها با حساسیت بالاست. در ضمن میتوان با روشهای موجود مانند طیف سنجی جرمی پروتئینهای جدا شده بوسیله ژل را شناسایی کرد (رابیلود، 2002). نخستین بار پولیک و اسمیتز در سال 1956 جداسازی پروتئینهای سرم را بوسیله یک روش دوبعدی گزارش کردند. آنها در بعد اول از الکتروفورز کاغذی و در بعد



قیمت: 11200 تومان

Leave a Reply

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *