تاثیر ارتفاع روی خصوصیات مورفولوژیکی و برخی مواد ثانویه گیاه گزنه(Urtica dioica) در استان‌های مازندران و گلستان

دانشکده تولید گیاهی
پایان نامه جهت اخذ درجه کارشناسی ارشد در رشته
علوم باغبانی- گرایش گیاهان دارویی، ادویهای و نوشابهای
تاثیر ارتفاع روی خصوصیات مورفولوژیکی و برخی مواد ثانویه گیاه گزنه
(Urtica dioica) در استان‌های مازندران و گلستان
پژوهش و نگارش:
مصطفی نجار فیروزجایی
استاد راهنما:
دکتر خدایار همتی
اساتید مشاور:
دکتر سارا خراسانینژاد
مهندس امیر دارایی گرمهخانی
تابستان 1392

تعهدنامه پژوهشی
نظر به اینکه چاپ و انتشار پایان نامه‌های تحصیلی دانشجویان دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان مبین بخشی از فعالیت‌های علمی- پژوهشی بوده و همچنین با استفاده از اعتبارات دانشگاه انجام می‌شود؛ بنابراین به منظور آگاهی و رعایت حقوق دانشگاه دانش آموختگان این دانشگاه نسبت به رعایت موارد ذیل متعهد می‌شوند:
قبل از چاپ پایان ‌نامه خود، مراتب را قبلا به طور کتبی به مدیریت تحصیلات تکمیلی دانشگاه اطلاع داده و کسب اجازه نمایند.
قبل از چاپ پایان نامه در قالب مقاله، همایش، اختراع و اکتشاف و سایر موارد، ذکر نام دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان الزامی است.
انتشار نتایج پایان نامه باید با اطلاع و کسب اجازه از استاد راهنما صورت گیرد.
اینجانب مصطفی نجار فیروزجایی دانشجوی رشته علوم باغبانی- گرایش گیاهان دارویی، ادویهای و نوشابهای مقطع کارشناسی‌ارشد تعهدات فوق و ضمانت اجرایی آن را قبول کرده و به آن ملتزم می‌شوم.
نام و نام خانوادگی و امضاء

تقدیم به:
پدر و مادر عزیزم که از وجودشان به خود میبالم
تقدیم به همسر گرامیم
و تقدیم به آنانی که برای ساختن زندگی تلاش میکنند.

تشکر و قدردانی
سپاس بی‌‌کران پروردگار یکتا را که هستی‌‌مان بخشید و به طریق علم و دانش رهنمونمان شد و به همنشینی رهروان علم و دانش مفتخرمان نمود و خوشه‌‌چینی از علم و معرفت را روزیمان ساخت.
مراتب سپاس و قدر دانی خود را تقدیم کسانی می‌‌کنم که صبورانه همراهیم کردند:
خانواده عزیز و مهربانم.
همسر گرامیم.
استاد راهنمای ارجمندم جناب آقای دکتر خدایار همتی که همواره حامی و راهنمای بنده بوده‌اند.
اساتید مشاور سرکار خانم دکتر سارا خراسانی نژاد و و جناب آقای مهندس امیر دارایی گرمه خانی که همواره از مشاورت آن‌ها بهره مند بوده‌ام.
استاد محترم جناب آقای دکتر عظیم قاسم نژاد که زحمت داوری پایان نامه را تقبل نمودند.
و در پایان از دوست خوبم، آقای دکتر کیوان مهدوی که در مراحل عملی و تدوین پایان نامه مرا یاری نمودند، صمیمانه تشکر می‌کنم.
مصطفی نجار فیروزجایی
تابستان 1392

چکیده
گزنه (Urtica dioica) از خانواده Urticaceae می‌باشد که دارای خواص دارویی فراوانی است. رشد و عملکرد گیاهان در اکوسیستمها و رویشگاههای طبیعی مختلف تحت تاثیر عوامل مختلفی از جمله ارتفاع از سطح دریا قرار دارد. در این تحقیق اثر ارتفاع در دو استان مازندران و گلستان روی خصوصیات مورفولوژیکی و بیوشیمیایی گزنه مورد بررسی قرار گرفت. نمونه‌برداری از مناطق مختلف در زمان گلدهی گیاه صورت پذیرفت. استخراج و شناسایی مواد موثره با دستگاه اسپکتروفتومتر و دستگاه کروماتوگرافی مایع (HPLC) انجام شد. اطلاعات هواشناسی و خاکشناسی مربوط به رویشگاه‌‌ها نیز مورد بررسی قرار گرفت. داده‌‌ها در قالب طرح کاملاً تصادفی، بصورت آشیانهای با استفاده از نرم‌افزار آماری SAS تجزیه و تحلیل شدند. نتایج تجزیه واریانس نشان داد که اثر ارتفاع و اکوتیپ بصورت معنی‌داری خصوصیات مورفولوژیک و بیوشیمیایی گزنه را تحت تاثیر قرار داد. نتایج نشان داد که با افزایش ارتفاع، طول و عرض برگ‌‌ها کمتر، ارتفاع گیاه کوچک‌‌تر و میزان کلروفیل بیشتر شد، بطوریکه کمترین میزان طول برگ (9/6 سانتی‌متر)، کمترین میزان عرض برگ (8/5 سانتی‌متر) کمترین ارتفاع گیاه (2/77 سانتی‌متر) و بیشترین میزان کلروفیل (3/50 درصد) در منطقه له کوه مازندران با ارتفاع 2250 متر بدست آمد، همچنین میزان فنل کل، فلاونوئیدکل، اسید کلروژنیک، اسید کافئیک و روتین در اندام‌‌های مختلف گزنه با افزایش ارتفاع بیشتر شد بطوریکه بیشترین میزان فنل کل (16/8 میلیگرم بر گرم)، فلاونوئید کل (15/12 میلیگرم بر گرم)، اسید کلروژنیک (72/0 میلیگرم بر گرم)، اسید کافئیک (140/0 میلیگرم بر گرم) و روتین (71/0 میلیگرم بر گرم) در کل گیاه در ارتفاع 2250 متری منطقه له کوه مازندران مشاهده شد. همچنین میزان این ترکیبات در برگ بیشتر از سایر اندام‌های گزنه بود. بررسی‌‌های آماری نشان داد که بین میزان فنل و فلاونوئید و ارتفاع از سطح دریا، یک رابطه مثبت و معنیداری وجود داشت.
واژه‌‌گان کلیدی: گزنه، ارتفاع، خصوصیات مورفولوژی، فنل و فلاونوئید، HPLC.

فهرست مطالب
عنوان صفحه
فصل اول- مقدمه
1-1- مقدمه2
1-2- بیان سوالات اصلی تحقیق3
1-3- فرضیهها3
1-4- اهداف3
فصل دوم- بررسی منابع
2-1- گیاهشناسی گزنه6
2-2- دامنه انتشار7
2-3- اندام‌های دارویی8
2-4- مواد متشکله و آثار فارماکولوژیکی8
2-5- محیط و مواد موثره گیاهان دارویی9
2-6- فنل و فلاونوئید10
2-7- بررسی تاثیر اکوتیپ و ارتفاع بر روی خصوصیات مورفولوژیکی و میزان عملکرد13
2-8- بررسی تاثیر اکوتیپ و ارتفاع بر میزان متابولیت‌های ثانویه14
فصل سوم- مواد و روشها
3-1- مواد گیاهی20
3-2- وسایل و دستگاه‌های مورد استفاده20
3-3- مواد شیمیایی20
3-4- آماده‌سازی گیاه گزنه20
3-5- صفات مورفولوژیکی مورد مطالعه گیاه گزنه22
3-6- صفات بیوشیمیایی مورد مطالعه گیاه گزنه22
3-7- استخراج عصاره متانولی24
فهرست مطالب
عنوان صفحه
3-7-1- اندازه‌گیری فنل کل24
3-7-2- اندازه‌‌گیری محتوی فلاونوئیدی25
3-8- اندازه‌‌گیری اسید کلروژنیک و اسید کافئیک با استفاده از دستگاه HPLC26
3-8-1- آماده سازی نمونه26
3-8-2- تهیه نمودار کالیبراسیون اسید کلروژنیک و اسید کافئیک27
3-8-3- تزریق نمونه گیاهی27
3-9- اندازه‌‌گیری روتین با استفاده از دستگاه HPLC29
3-9-1- آماده سازی نمونه29
3-9-2- تهیه نمودار کالیبراسیون روتین29
3-9-3- تزریق نمونه گیاهی30
3-10- مشخصات طرح31
3-11- تجزیه و تحلیل آماری31
فصل چهارم- نتایج و بحث
4-1- صفات مورفولوژیک34
4-1-1- طول، عرض و نسبت طول به عرض برگ34
4-1-2- تعداد برگ در بوته36
4-1-3- تعداد و فاصله گره‌ها36
4-1-4- قطر ساقه37
4-1-5- قطر و طول ریشه37
4-1-6- اندازه و تعداد گل آذین در بوته.37
4-1-7-ارتفاع گیاه38
4-1-8- میزان کلروفیل38
4-2- صفات بیوشیمیایی39
فهرست مطالب
عنوان صفحه
4-2-1- فنل کل برگ، ریشه، ساقه و گل39
4-2-2- فلاونوئید کل برگ، ریشه، ساقه و گل42
4-2-3- کلروژنیک برگ، ریشه، ساقه و گل44
4-2-4- کافئیک برگ، ریشه، ساقه و گل46
4-2-5- روتین برگ، ریشه، ساقه و گل48
4-3- رابطه رگرسیونی ارتفاع از سطح دریا با مقدار فنل و فلاونوئید50
4-4- نتیجه گیری کلی56
4-5- پیشنهادات56
منابع58
فهرست جدول‌ها
عنوان صفحه
جدول 2-1- طبقه بندی ترکیبات فنلی12
جدول 3-1- مشخصات جغرافیایی و هواشناسی رویشگاههای مورد مطالعه گیاه گزنه23
جدول 3-2- مشخصات خاک رویشگاههای مورد مطالعه گیاه گزنه23
جدول 4-1- تجزیه واریانس صفات مورفولوژیک35
جدول 4-2- مقایسه میانگین صفات مورفولوژیک به روش آزمون دانکن35
جدول 4-3- ضرایب همبستگی بین صفات مورفولوژیک گیاه گزنه36
جدول4-4- تجزیه واریانس صفات بیوشیمیایی مورد بررسی با دستگاه اسپکتروفتومتر40
جدول 4-5- تجزیه واریانس صفات بیوشیمایی مورد بررسی با دستگاه HPLC40
فهرست شکل‌ها
عنوان صفحه
شکل 2-1- اندام‌های مختلف گیاه گزنه7
شکل 3-1- الف- رویشگاه گزنه در منطقه چهارباغ، ب- فیروزجاه، پ- خشک کردن گزنه21
شکل 3-2- نمودار استاندارد گالیک اسید25
شکل 3-3- نمودار استاندارد کوئرستین26
شکل 3-4- نمودار استاندارد اسید کافئیک28
شکل 3-5- نمودار استاندارد اسید کلروژنیک28
شکل 3-6- نمودار استاندارد روتین30
شکل 3-7- کروماتوگرام استاندارد روتین31
شکل 4-1- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان فنل برگ41
شکل 4-2- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان فنل ساقه و گل41
شکل 4-3- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان فنل ریشه42
شکل 4-4- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان فلاونوئید برگ43
شکل 4-5- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان فلاونوئید ساقه و گل43
شکل 4-6- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان فلاونوئید ریشه44
شکل 4-7- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان اسید کلروژنیک برگ45
شکل 4-8- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان اسید کلروژنیک ساقه و گل45
شکل 4-9- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان اسید کلروژنیک ریشه46
شکل 4-10- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان اسید کافئیک برگ47
شکل 4-11- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان اسید کافئیک ساقه و گل47
شکل 4-12- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان اسید کافئیک ریشه48
شکل 4-13- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان روتین برگ49
شکل 4-14- مقایسه میانگین اثر ارتفاع در استان بر میزان روتین ساقه و گل49
شکل 4-15- ارتباط بین ارتفاع از سطح دریا با فنل و فلاونوئید کل در برگ51
شکل 4-16- ارتباط بین ارتفاع از سطح دریا با فنل و فلاونوئید کل در ساقه و گل51
شکل 4-17- ارتباط بین ارتفاع از سطح دریا با فنل و فلاونوئید کل در ریشه52
شکل 4-18- ارتباط بین ارتفاع از سطح دریا با ترکیبات فنل و فلاونوئیدی52

1-1- مقدمه
گیاهان دارویی یکی از منابع غنی کشور است که امکان صادرات آن نیز وجود دارد. ایران از نظر آب و هوا در زمینه رشد گیاهان دارویی یکی از بهترین مناطق جهان محسوب می‌‌شود، به همین دلیل صادرات آن می‌‌تواند منبع بزرگی از درآمد برای کشور باشد (صمصام شریعت، 1382). بنابراین ضروریست تا با توجه به توان بالقوه بسیار خوب کشور در زمینه تنوع گیاهان دارویی، با شناخت گونه‌‌های گیاهی و دستیابی به اطلاعات لازم در مورد محل‌‌های رویش و خصوصیات بوم‌‌شناختی آن‌ها، گام‌‌های اساسی برای استفاده از اسانس‌‌های گیاهی و ترویج شیوه‌‌های اصولی بهره‌‌برداری از این گیاهان برداشته شود (حسنی، 1383).
گیاه دارویی به گیاهان و مشتقات آن‌ها گفته می‌‌شود که دارای مواد موثر مشخص است، در درمان بیماری یا پیشگیری از بروز آن مورد استفاده قرار می‌‌گیرد و نام آن گیاه در یکی از فارماکوپه‌‌های معتبر بین‌‌المللی ذکر شده باشد (دوازده امامی و مجنون‌‌حسینی، 1387).
فارماکوپه یک کتاب رسمی است که توسط دولت هر کشور و یا انجمن‌‌های پزشکی و داروسازی زیر نظر دولت به چاپ می‌‌رسد و حاوی حقایق علمی و اصول استاندارد‌‌سازی مواد دارویی از قبیل روش‌‌های جمع‌‌آوری مواد دارویی از منابع مختلف، آماده سازی، نگهداری، ترکیب و اختلاط داروهای مختلف و روش‌‌های اثبات آن‌ها می‌‌باشد. به علاوه این کتاب شامل دارو‌‌هایی با استعمال خارجی، نحوه نسخه‌‌نویسی، نحوه و مقدار تجویز دارو‌‌ها و اطلاعات کامل تهیه، ساخت و کاربرد داروهاست (دوازده امامی، 1382).
استفاده از گیاهان دارویی و فرآورده‌‌های حاصل از آن‌ها نقش این گیاهان را در چرخه اقتصادی پر اهمیت کرده است. به طوری که مصرف رو به ازدیاد آن‌ها تنها به کشور‌‌های در حال توسعه محدود نشده است، بلکه اخیراً در کشور‌‌های توسعه یافته نیز جایگاه ویژه‌‌ای به خود اختصاص داده است. در اواخر قرن بیستم حجم مبادلات جهانی گیاهان دارویی به 200 میلیارد دلار بالغ گردیده است. بر اساس گزارش سازمان خوار و بار جهانی (FAO) ارزش صادرات گیاهان دارویی در سال 1995 بالغ بر 880 میلیون دلار بوده است. بر اساس گزارش بانک جهانی، حجم تجارت گیاهان دارویی تا سال 2050 بالغ بر 5 تریلیون دلار خواهد بود (امیدبیگی، 1384). در حالی که طی گزارشی میزان ارزش فروش گیاهان دارویی در ایران در سال 2000 میلادی تنها در حدود 37 میلیارد ریال برآورد شده است و این در حالی است که ایران جزء 8 کشور مهم دارای فلور متنوع گیاهان دارویی در دنیاست (قاسمی، 1389).
گزنه از مهمترین گیاهان دارویی است که از دوران ماقبل تاریخ نیز وجود داشته و مردم آن زمان از آن برای تغذیه استفاده می‌کردند و از خواص درمانی آن اطلاع داشته‌اند. از کاربرد‌‌های دارویی آن می‌توان به کاهش قند خون، کاهش التهاب آرتریت روماتید، درمان عفونت مثانه و مجاری ادراری، درمان پروستات و اکنه اشاره کرد (جولیا و همکاران، 2007).
1-2- بیان سوالات اصلی تحقیق
تاثیر ارتفاع بر برخی خصوصیات مورفولوژیکی (ریخت‌‌شناسی) گیاه گزنه چگونه است؟
تاثیر ارتفاع بر میزان کل ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی اندام‌‌های گیاه گزنه چگونه است؟
تاثیر ارتفاع بر میزان ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی نظیر اسید کلروژنیک، اسید کافئیک و روتین در اندام‌‌های مختلف گیاه گزنه چگونه است؟
1-3- فرضیهها
عوامل محیطی روی میزان ترکیبات ثانویه گیاه گزنه موثر است.
شرایط محیطی متنوع در زیستگاه‌های مختلف بر خصوصیات مورفولوژیکی گیاه تاثیر می‌گذارند.
میزان ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی تحت تاثیر ارتفاع قرار دارد.
1-4- اهداف
ارزیابی تاثیر اقلیم‌‌های مختلف بر صفات ریختی و عملکرد برخی مواد موثره گزنه.
معرفی بهترین ارتفاع و اندام دارویی گزنه از نظر میزان ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی.
مقایسه برخی ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی موجود درگزنه در ارتفاعات مختلف.
-76508-504458

2- بررسی منابع
2-1- گیاه‌شناسی گزنه
گزنه با نام علمی Urtica dioica از خانواده Urticaceae می‌باشد. گزنه، گیاهی است علفی، چند‌‌ساله، پایا، دوپایه و بندرت تکپایه، ریزوم‌‌دار، به ارتفاع 150-50 سانتیمتر، دارای کرک‌‌های گزنده، ساقه آن علفی، کمی زاویه‌‌دار و چهار پهلو، تقریباً ضخیم، ساده و یا خیلی کمانشعاب و پوشیده از کرک‌‌های گزنده، برگ‌‌ها نیزه‌‌ای، نیزه‌‌ای باریک، تخممرغی، تخممرغی پهن تا تقریبا دایره‌‌ای، نوک تیز یا نوک باریک، قاعده قلبی، باریک یا گوه‌‌ای، اندازه برگ 5/2-12×5/4-15 سانتیمتر، رنگ برگ‌‌ها سبز روشن است. برگ‌‌ها عموما گوشواره‌‌دار و گاه بدون گوشواره، متقابل و پوشیده از کرک‌‌های گزنده است. گل‌‌های آن، تک جنسی، بسیار ریز، سبز فام، مجتمع در توده‌‌های کوچک کروی، و واقع در طول محورهای خوشه‌‌ای شکل، گل‌‌های نر دارای 4 کاسبرگ هم اندازه و 4 پرچم با بساک‌‌های پهن دراز و قلوه‌‌ای شکل، ماده‌‌ها دارای 4 کاسبرگ متقابل صلیبی، دو کاسبرگ خارجی بسیار کوچک و گاهی گل فاقد آن و رنگ آن‌ها سبز مایل به زرد می‌‌باشد. گلآذین سنبله یا خوشهای مرکب، کرکی متراکم، گل‌آذین نر 4-11 سانتیمتر و ماده 5/1-9 سانتیمتر میباشد میوه آن فندقه تخم‌مرغی تا بیضوی و محتوی آلبومین روغن‌‌دار است. فندقه به طول 5/1 میلی‌‌متر و محصور در کاسه پایای گل می‌‌باشد (شکل 2-1)، (فارماکوپه گیاهی ایران، 1381؛ قهرمان، 1372).
تکثیر آن از طریق کاشت بذر در بهار یا تابستان و کاشت قطعات ریشه‌‌دار در پاییز صورت می‌‌گیرد (زرگری، 1383).

شکل 2-1- اندام‌های مختلف گیاه گزنه (ویلر، 1981)
2-2- دامنه انتشار
این گیاه غالبا در اماکن مخروبه، باغ‌‌ها، و نقاط مرطوب خارج شهر و نواحی سایه‌‌دار و جاهایی که چهار‌‌پایان در آنجا به سر می‌‌برند، به حالت خودرو می‌‌روید. از ریشه‌‌‌‌های خزنده آن پاجوش‌‌هایی در کلیه جهات خارج می‌‌گردد که خود باعث می‌‌شود گیاه بصورت پایه‌‌های متعدد در آمده، تا محل رویش خود را به کلی فرا گیرد. انتشار عمومی گیاه گزنه در نقاط مرطوب ایران خصوصاً نواحی شمالی، غربی و مرکزی مانند اصفهان، شاهرود، بسطام و کاشان است (زرگری، 1376).
2-3- اندام‌های دارویی
برگ‌‌ها، ریشه، دانه و شیرابۀ گیاه بخش دارویی این گیاه را تشکیل می‌‌دهند (زرگری، 1376). گلدهی آن از اواسط اردیبهشت تا شهریور‌‌ماه می‌‌باشد و بهترین زمان برداشت و جمع‌‌آوری برگ‌‌‌‌های این گیاه از اردیبهشت‌‌ تا شهریور‌‌ماه می‌‌باشد (فارماکوپه گیاهی ایران، 1381).
2-4- مواد متشکله و آثار فارماکولوژیکی
گزنه دارای تانن، موسیلاژ، اسید فورمیک، ماده مومی، نوعی گلیکوزید با اثر قرمز کنندگی پوست، نیتراتپتاسیم و کلسیم، ترکیبات آهن‌‌دار، گوگرد و نوعی ماده رنگی به نام اورتی‌‌سین در سر شاخه هوایی می‌‌باشد (زرگری، 1376). در برگ گیاه گزنه، کلروفیل، گزانتوفیل، لوکوآنتوسیانیدین، فلاوون و فلاونول موجود است که فلاوون و فلاونول به میزان کمتری از لوکوآنتوسیانیدین در این گیاه است. تری‌‌ترپن‌‌ها و استرول‌‌ها شامل بتاسیتوسترول در گیاه موجود است. اسید فرمیک نیز در برگ وجود دارد. برگ‌‌های تازه گزنه حاوی سکرتین می‌‌باشد. همین‌‌طور دارای 5/1 درصد کلروفیل خالص است. برگ خشک گزنه 5/7 درصد کلروفیل دارد. اسیدهای فنلی نیز در این گیاه وجود دارد که شامل کافئیک اسید، فرولیک اسید، سیناپیک اسید، اسکولتین و کافئوئیل مالیک اسید و کلروژنیک اسید می‌‌باشد. تری گلیسیرید، دی گلیسیرید و فسفولیپید‌‌های مختلفی هم از این گیاه جدا شده است. سیتوکنین‌‌های عمده گزنه شامل زآتین، زآتین نوکلئوتید، ایزو پنتیل آدنین، ایزو پنتیل آدنوزین، ایزو پنتیل آدنین نوکلئوتید و دی هیدرو زآتین می‌‌باشد. همچنین ترکیبات ایندولی همراه با هیستامین و 5- هیدروکسی تریپتامین و اسید‌‌هایی از جمله اسید آسکوربیک، سالیسیلیک اسید و عناصری مانند ازت، گوگرد، فسفر، پتاسیم، منیزیم، کلسیم، و عناصر نادر مانند آهن، روی، مولیبدن و مس موجود است (فارماکوپه گیاهی ایران، 1381).
ترکیبات فنلی موجود در گزنه که شامل کافئیک اسید، فرولیک اسید، سیناپیک اسید، فیستین و میریستین می‌‌باشند. بر باکتری‌‌هایی مثل اشریشیاکلی، پروتئوس ‌‌ولگاریکوس، کلبسیلا و پسودوموناس اثر دارد و عصاره این گیاه بر سالمونلا و پروتئوس که در مقابل آنتی‌‌بیوتیک‌‌ها مقاوم است، خاصیت آنتی‌‌بیوتیکی دارد. همچنیین باعث وقفه در رشد چندین مخمر، کپک، قارچ و باکتری شده است. اثرات ضد قارچی بعضی ترکیبات موجود در گزنه نیز تائید شده است. گزنه دارای اثرات مدری است. اثرات دیورتیک این گیاه با افزایش دفع کلر و اوره همراه است و ثابت شده که مصرف 14 روزه این گیاه موجب کاهش وزن بدن و نیز کاهش فشار سیستولیک می‌‌گردد (محمودی و همکاران، 2007). گزنه بصورت خوراکی به عنوان مدر، پایین آورنده قند خون و اسید اوریک و به صورت موضعی در درمان برخی از بیماری‌‌های پوستی و مو از جمله اگزما، بیماری‌‌های التهابی و حتی در درمان ریزش مو مورد استفاده قرار می‌‌گیرد (محمودی و همکاران، 2007). اعتقاد بر این است که جوشانده گیاه و خیسانده ریشه آن در الکل بصورت لوسیون در رشد موی سر موثر است. همچنین عصاره ریشه گزنه در بعضی حالات هیپرتروف غده پروستات را بهبود می‌بخشد (آزاد بخت، 1378). از دیگر کاربردهای دارویی گزنه می‌‌توان به درمان آرتریت روماتید، درمان عفونت مثانه و مجاری ادراری، بزرگ شدگی ‌‌پروستات، حساسیت فصلی و درمان اکنه اشاره کرد (جولیا و همکاران، 2007).
2-5- محیط و مواد موثره گیاهان دارویی
پراکنش و استقرار گیاهان اصولاً تحت تاثیر شرایط محیط و عوامل داخلی گیاه صورت می‌‌گیرد. مهم‌‌ترین عوامل موثر بر ترکیبات شیمیایی ثانویه گیاهان عوامل ژنتیکی، محیطی و اثرات متقابل آن‌ها ست. عوامل ژنتیکی مربوط به ژنوم گیاه است. از عوامل محیطی و اکولوژیکی مؤثر می‌‌توان عوامل آب و هوایی، جغرافیایی و ادافیکی (خاکی) را نام برد. عوامل آب و هوایی مانند دما، بارندگی، طول روز، نور خورشید، تبخیر و تعرق و باد، نقش مهمی در تولید متابولیت‌‌های ثانویه این گیاهان دارند. ارتفاع از سطح دریا، درصد شیب و جهت آن، عرض جغرافیایی، پوشش اراضی، نزدیکی به منابع آبی به طور مستقیم یا غیر مستقیم به واسطه تأثیر بر سایر عوامل بوم شناسی بر سنتز ترکیبات ثانویه به خصوص اسانس در گیاهان موثر هستند. خصوصیات خاک مثل بافت خاک، مواد آلی، آهک، شوری و اسیدیته از فاکتورهای محیطی می‌‌باشند که باید مورد مطالعه قرار گیرند. در صورتیکه گیاه اهلی شده باشد عوامل مدیریتی نیز تاحدودی بر درصد ترکیبات ثانویه گیاهان دارویی موثر است (قاسمی، 1389). از مهمترین عوامل محیط رویش گیاهان که تاثیر بسیار عمده‌‌ای بر کمیت و کیفیت مواد موثره آن‌ها می‌‌گذارند، نور، درجه‌‌حرارت، آبیاری و ارتفاع محل می‌‌باشد (امید بیگی، 1384). بر پایه تحقیقات انجام شده، عوامل محیطی محل رویش گیاهان دارویی در سه محـور زیـر بر آن‌ها تاثیـر می‌‌گـذارد: 1- تاثیر بر مقدار کلی ماده موثره گیاهان دارویی؛ 2- تاثیر بر عناصر تشکیل دهنده مواد موثره؛ 3- تاثیر بر مقدار تولید وزن خشک گیاه (امیدبیگی، 1384).
به‍طور‌‌ کلی مواد مؤثره گیاهان دارویی که حاصل سوخت‌‌و‌‌ساز (متابولیسم) ثانویه است به ‍عنوان ترکیبــات ثانویه معروف می‌‌باشند. این ترکیبات عموماً وزن مولکولی کمتر از 1000 داشته و به ‍مقدار کمی در سلول ذخیره شده و عمدتاً در سلول‌های تخصصی و در مرحله خاصی از چرخه زندگی گیاه تولیـد می‌شوند. گیـاهان دارای این نوع مکانیـسم‌ها، نسبت به سایر گیاهان از سازگاری و بقای طولانی‌‌تری برخوردارند (تایز و زایگر، 1379). مهـم‍ترین آن‌ها آلــکالوئیدها، گلیکوزیدها، روغن‌‌های فرار (اسانس‌ها)، فنلها، تانن‌ها، فلاونوئیدها و غیره هستند. تولید این ترکیبات برای گیاه گران و هزینه‍بر می‌باشند، ولی گیاه این ترکیبات را بیهوده تولید نمی‌کند و اهـداف خاصی جهت تولید، ترشح و ذخیره آن‌ها دارد که مهم‍ترین این وظایف به شرح زیر است:
– دفع عوامل بیماریزا
– دفع آفات و حیـوانات گیاه‍خوار
– افزایش توان رقابتی گیاه بر سر منابع مانند نور، آب و مواد غذایی
– جلب حشرات و پرندگان گردهافشان
– رفع تنشهای غـیرزنده و حفاظت در برابر اشعۀ ماوراء بنفش (قاسمی، 1389).
2-6- فنل و فلاونوئید
ترکیبات فنلی به یک گروه وسیع و متنوعای از ترکیبات شیمیایی اطلاق میشود که این ترکیبات می‌‌توانند به روش‌‌های مختلفی طبقه‌‌بندی شوند. هاربورن و سیموندس این ترکیبات را به گروه‌‌هایی بر اساس تعداد کربن‌‌های موجود در مولکول طبقه‌بندی کردند (جدول 2-1) (ورمریس و نیکولسون، 2006).
ترکیبات فنولی در طی رشد و نمو با هدایت عوامل ژنتیکی و در پاسخ به محرکهای محیطی از جمله آلودگی، زخم و تابش فرابنفش ساخته میشوند که از میان آنها میتوان به لیگنینها، لیگنانها، فنلهای ساده و اسیدهای فنلی و فلاونوئیدها اشاره کرد. این ترکیبات بخش جدایی ناپذیری در رژیم غذایی بشر بوده و به دلیل ویژگیهای آنتیاکسیدانی قوی و ضدسرطانی، بسیار مورد توجه است (قربانی و همکاران، 1390؛ محمد و همکاران، 2001؛ دینکا و همکاران، 2004؛ اسکین و رابینسون، 2000).
ترکیبات فنولی دارای خواص متعددی از جمله خواص آنتی باکتریال، ضدقارچ، ضدویروس، ضددیابت، ضدالرژی و ضدالتهاب هستند. اما بیشتر به منظور فعالیت‌های ضدویروسی و آنتی‌اکسیدانیشان شهرت دارند به خصوص در بعضی از اسیدهای فنولیکی مانند اسیدکلرژنیک، اسیدگالیک و اسیدکافئیک (دیمیتری جویک و همکاران، 2010).
فلاونوئیدها دسته‌‌ای از ترکیبات طبیعی هستند که در سلسله گیاهان گسترش وسیعی دارند. آن‌ها به عنوان یکی از بزرگترین گروه ترکیبات طبیعی شناخته می‌‌شوند. تا به امروز متجاوز از 4000 فلاونوئید شناخته شده است که به طور وسیعی در برگ‌‌ها، دانه‌‌ها، پوسته و گل‌‌های گیاهی وجود دارند. به‌‌طور کلی فلاونوئیدها بزرگترین گروه ترکیبات طبیعی فنلی در گیاهان هستند و به دلیل حضور آن‌ها در تقریبا همه گروه‌‌های گیاهی، در بیشتر مطالعات مربوط به عصاره‌‌های گیاهی مورد بررسی قرار می‌‌گیرند (مدیکا و همکاران، 2004).

جدول 2-1- طبقهبندی ترکیبات فنلی (ورمریس و نیکولسون، 2006).

فلاونوئیدها به عنوان یکی از گستردهترین متابولیتهای ثانویه در گیاهان هستند که فعالیتهای مختلفی را بر عهده دارند. آنها دارای اثرات و عملکرد بسیار مفیدی بر سلامتی انسان هستند که دارای شش زیر گروه میباشند: فلاوونها، ایزو فلاوونها، فلاونولها، فلاونون، آنتوسیانین‌‌ها و آنتوسیانیدین. فلاونوئیدها معمولاً در واکوئل گیاهان به صورت گلیکوزید تجمع مییابند. فلاونها مخصوصا کامپفرول و کوئرستین در بسیاری از گونههای گیاهی وجود دارد که برای جوانهزنی گرده و رشد لوله گرده ضروری است (جاکولا و هوتولا، 2010؛ کاسیمیر و مین، 2008).
فلاونوئیدها ترکیبات دیفنیل پروپانوئیدهایی هستند که تقریبا در همه گیاهان یافت می‌‌شوند و نقش‌‌های فراوانی برای این ترکیبات شناخته شده است، در گیاهان عالی، فلاونوئیدها دفاع در برابر نور ماورابنفش، پاتوژن‌‌ها و علف‌‌خوران را سبب می‌‌شوند. نقش‌‌های ویژه‌‌ آن‌ها در گیاهان، در ایجاد رنگ و تثبیت نیتروژن در گیاهانی است که دارای زندگی همزیستی‌‌اند. اثرات سلامت فلاونوئیدها بیشتر در نتیجه خاصیت آنتی‌‌اکسیدانی و توانایی کلات‌‌کنندگی آن‌ها ست. مطالعات زیادی انجام شده است تا موثر بودن فلاونوئیدها به عنوان، عوامل ضدقارچی، ضدباکتری، ضدویروسی، ضداشتعال، آنتی‌‌اکسیدانت، متعادل کننده ایمنی، بازدارنده آنزیمی و عوامل موتاژنی سمی به اثبات رساند (مدیکا و همکاران، 2004).
روتین نوعی فلاونوئید است، روتین در پیشگیری و درمان افزایش فشار خون و سایر نارسائیهای قلبی و عروقی مورد استفاده قرار میگیرد و همچنین به عنوان یک آنتی اکسیدان قوی مطرح است (افشار و همکاران، 1376).
2-7- بررسی تاثیر اکوتیپ و ارتفاع روی خصوصیات مورفولوژیکی و میزان عملکرد
عملکرد، میزان و کیفیت مواد ثانویه یک گیاه در رویشگاه‌‌ها و مناطق مختلف تغییر می‌‌یابد، دلیل این امر نوسان فعالیت‌‌های متابولیکی گیاه تحت تاثیر عوامل مختلف محیطی است، نتیجه تاثیر طولانی عوامل محیطی، تشکیل جمعیت‌‌های تازه زیرگونه‌‌ای یا اکوتیپ‌‌های مشتق از یک گونه گیاهی خاص است (امیدبیگی، 1388). تفاوت مورفولوژیکی و بیوشیمیایی بین اکوتیپ‌‌های گیاهی به اثبات رسیده است و این اختلافات می‌‌تواند به منظور انتخاب بهترین کمیت و کیفیت مورد استفاده قرار گیرد (آواتو و همکاران، 1998؛ برادلی و همکاران، 1996). در دهه اخیر در کشورهای مطرح دنیا در زمینه تولید گیاهان دارویی مانند مجارستان، ایتالیا و اسلواکی بررسی تنوع ژنتیکی بر اساس خصوصیات مورفولوژیکی و ترکیبات ثانویه به منظور به کارگیری در برنامه‌‌های به‌‌نژادی صورت گرفته است و اکوتیپ‌‌های برتر نسبت به ارقام اصلاح شده شناسایی گردیده‌‌اند (من و استابا، 1986). در ارزیابی خصوصیات گیاهشناسی، درصد و اجزای اسانس اکوتیپ‌‌های آویشن کرمانی توسط مکی‌‌زاده‌‌تفتی و همکاران (1389)، نتایج نشان داد که بیشترین ارتفاع بوته، قطر بوته، تعداد شاخساره، طول و عرض برگ، وزن تر و وزن خشک بوته مربوط به اکوتیپ کرمان و کمترین مربوط به اکوتیپ شاهرود بود، ولی تعداد شاخساره در بوته، طول برگ و عرض برگ در هیچ یک از اکوتیپ‌‌ها با اکوتیپ دیگری اختلاف معنی‌‌داری نداشت. عسکرزاده و همکاران (1387) در مقایسه 8 اکوتیپ زیرهکوهی از نقاط مختلف ایران در شرایط مزرعه به منظور بررسی عملکرد کمی و کیفی گزارش کردند که بیشترین عملکرد تکبوته مربوط به اکوتیپ منطقه خواجه خراسان و کمترین عملکرد مربوط به اکوتیپ کوه باقران بیرجند بود. نتایج مطالعه‌‌ای روی بررسی مورفولوژی، فنولوژی و برخی مشخصات کیفی چند اکوتیپ علف باغ از مناطق مختلف ایران و یک اکوتیپ خارجی در شرایط آزمایشگاه نشان داد که بالاترین ارتفاع بوته مربوط به اکوتیپ همدان و کمترین مربوط به اکوتیپ کرج، بیشترین میزان وزنتر متعلق به اکوتیپ خارجی و کمترین متعلق به اکوتیپ همدان بود در حالیکه بیشترین وزن خشک در اکوتیپ اردبیل و کمترین در اکوتیپ خارجی مشاهده شد (علیزاده و جعفری، 2011). به منظور بررسی اجزای عملکرد، مورفولوژی اکوتیپ‌‌های بومی یونجه کشور ترکیه آزمایشی توسط سینگ در سال 2002 انجام شد و نتایج این آزمایش بدین صورت بود که بالاترین ارتفاع بوته متعلق به اکوتیپ محمودی و کوتاهترین متعلق به اکوتیپ ارسیس3 بود، اکوتیپ قاسم‌‌اوغلو بیشترین تعداد ساقه و اکوتیپ‌‌های الاکوی و کایرباسی کمترین تعداد ساقه را داشتند، بیشترین تعداد غلاف در اکوتیپ محمودی و کمترین در اکوتیپ گلگورن مشاهده شد.
2-8- بررسی تاثیر اکوتیپ و ارتفاع بر میزان متابولیتهای ثانویه
اصولاً مواد ثانویه به اقتضای ساختار طبیعی (وراثت) و هم تحت تاثیر تهییج‌‌های غیرطبیعی(تنشی) در گیاه ساخته می‌‌شوند به‌طوری‌که حضور برخی از این مواد در تعدادی از افراد یک گونه، به‌طور مستثنی از افراد دیگر ممکن است به منزله نشانه فعالیت ژن‌‌های خاص سازگاری آن افراد نسبت به تنش‌‌های محیطی مشخصی به شمار آید و افراد مذکور را به عنوان یک جمعیت زیرگونه‌‌ای متفاوت از بقیه که نسبت به تنش‌‌های محیطی مشخصی پاسخ شیمیایی ویژه‌‌ای دارند معرفی کند (فیتر و هی، 1987). طی مطالعه‌‌ای با هدف بررسی توده‌‌های محلی مرزه تابستانه نتایج نشان داد که تنوع قابل توجهی از نظر صفات بیوشیمیایی بین توده‌‌ها وجود دارد، میانگین بازده اسانس توده‌های مختلف بین 57/0 و 9/2 درصد متنوع بود که کمترین مقدار آن در توده ارومیه و بیشترین آن متعلق به توده اهواز بود، توده‌‌های اراک، نیشابور، مریوان و اهواز به ترتیب با میزان کارواکرول 3/83، 3/83، 9/76 و 67 درصد در گروه توده‌های غنی از کارواکرول قرار گرفتند (هادیان، 1387).
نتایج تحقیقی با موضوع ارزیابی درصد و اجزای اسانس چندین اکوتیپ‌‌ آویشن کرمانی از مناطق مختلف کشور با ارتفاع مختلف نشان داد که بازده اسانس بر حسب حجم اسانس در 100 گرم سرشاخه خشک در اکوتیپ کرمان- راین، 5/2 درصد، در اکوتیپ کرمان- سیرچ، 9/1 درصد، در اکوتیپ یزد، 2 درصد، در اکوتیپ شاهرود، 8/1 درصد و در اکوتیپ اصفهان، 5/1 درصد بود. همچنین در بررسی میزان ترکیبات غالب اسانس، بیشترین میزان کارواکرول در اکوتیپ کرمان- راین و بیشترین میزان تیمول در اکوتیپ شاهرود مشاهده شد (مکی‌‌زاده‌‌تفتی و همکاران، 1389). زینلی و همکاران (1386) در بررسی ژنوتیپ‌‌های مختلف دو گونه نعناع لانگیفولیا و اسپیکاتا پس از استخراج اسانس، شناسایی و تعیین مقدار اجزای اسانس با استفاده از دستگاه کروماتوگرافی گازی، گزارش کردند که توده‌‌های مختلف از لحاظ میزان اسانس و ترکیبات اسانس با هم اختلاف قابل‌‌ توجهی داشتند، این محققین اختلاف در میزان اسانس را مربوط به بالا بودن تعداد برگ و ارتفاع زیاد در تیمارهای با اسانس بالا اعلام کرد و پیشنهاد کردند که از این فاکتورها می‌‌توان به عنوان معیار انتخاب در بین ژنوتیپ‌ها در جهت افزایش عملکرد اسانس استفاده نمود. نری و همکاران (2009) در آزمایشی به منظور بررسی خصوصیات بیوشیمیایی اکوتیپ‌‌های مختلف شاه‌‌بلوط شیرین مناطق مختلف ایتالیا به این نتیجه رسیدند که بالاترین میزان ساکارز در اکوتیپ وال‌‌کاستلانا و کمترین در اکوتیپ کاستل‌‌دل‌‌ریو بود درحالیکه بیشترین میزان پروتئین در اکوتیپ کاستل‌‌دل‌‌ریو و کمترین میزان در اکوتیپ وال‌‌کاستلانا مشاهده شد، همچنین درصد اسید مالیک، پلی‌‌فنل‌‌ها و خواص آنتی‌‌اکسیدانتی در اکوتیپ کاستل‌‌دل‌‌ریو به طور معنی‌‌داری بالاتر از اکوتیپ وال‌‌کاستلانا بود. طی مطالعه‌‌ای مقایسه‌‌ای اکوتیپ‌‌های مختلف سیر از مناطق مختلف کشور از لحاظ میزان ماده آلیسین مورد مقایسه قرار داده شدند و نشان داده شد که اختلاف در میزان آلیسین در بین اکوتیپ‌‌ها نسبتاً زیاد بود بهطوری که بالاترین میزان (13 درصد) در اکوتیپ گرگان و کمترین میزان (61/1 درصد) در اکوتیپ تالش یک بود، و اکوتیپ‌‌های تارم 1، تربت‌‌جام، بهشهر و تالش 2 از لحاظ میزان آلیسین با هم اختلاف معنی‌‌داری نداشتند.
همتی و همکاران (1386) با بررسی تاثیر اقلیم و اندامهای مختلف روی برخی فلاونویید‌‌های درختچه سرخ ولیک، نشان دادند که اثرات متقابلی بین مکان و صفات وجود دارد و آن‌ها به این نتیجه رسیدند که میزان کوئرستین در اندام کل گیاه سرخ ولیک در کلاردشت مازندران بیشتر از گرگان بود. در بررسی دیگری که جایمند و همکاران (1388) با استفاده از استخراج و اندازهگیری ترکیب‌‌های فلاونوئیدی کامفرول و کوئرستین در گلبرگ ده ژنوتیپ از گل محمدی در مناطق غربی ایران انجام دادند دریافتند که بهترین اکشن‌‌ها از نظر میزان ترکیب‌‌های کامفرول و کوئرستین به ترتیب شامل آذربایجان غربی، ایلام و اردبیل بودند.
یکی از محققان در سال 1973 نسبت به کاشت گونه‌‌ای گل انگشتانه‌‌ در چهار نقطه که از نظر ارتفاع متفاوت بودند (بین 660 تا 1840 متر ارتفاع از سطح دریا) اقدام نموده و پس از مطالعات لازم به این نتیجه رسید که کاشت این گیاه در ارتفاعات بالا بویژه سبب کاهش برخی کلیکوزیدها می‌‌گردد (امیدبیگی، 1384). در تحقیقاتی که در سال 1975 در اتیوپی روی گونه‌‌ای از ریحان انجام گرفت معلوم گردید که در ارتفاعات پایین مقدار لینالول موجود در اسانس گیاه مذکور افزایش می‌‌یابد، در حالی که کاشت این گیاه در ارتفاعات باعث افزایش تولید اوژنول موجود در اسانس می‌‌گردد (امید بیگی، 1384).
تجلی و همکاران (2002) با بررسی تأثیر ارتفاع و اندامها بر روی فنول و فلاونوئید گیاه Carateagus Microphylla بیان داشتند که این گیاه در ارتفاع 1000 متری، دارای بیشترین سطح فنول و فلاونوئید نسبت به گیاهان رشد یافته در ارتفاعات پست بوده است. قاسمی و همکاران (2010) با بررسی تاٌثیر فاکتورهای محیطی بر روی فعالیت آنتی اکسیدان و میزان فنول و فلاونوئید کل در گیاه گردو Juglans Regia به این نتیجه رسیدند که بیشترین میزان فنول و فلاونوئید در منطقه آبعلی با بیشترین ارتفاع و کمترین میانگین دمای روزانه بدست آمد.
گاریما کیشر و همکاران (2010) با بررسی تأثیر ارتفاعهای مختلف روی میزان فعالیتهای آنتی‌کسیدانی و مقدار فنول و فلاونوئید کل در گیاه Tartar Buckwhat در هیمالیای غربی نشان دادند که مقدار فنول و فلاونوئید با افزایش ارتفاع افزایش مییابد.
سپهری‌‌فر و حسنلو (1388) با بررسی مقایسه‌‌ای مقدار ترکیبات فنلی، آنتوسیانینی و فلاونوئیدی در عصاره متانولی برگ و میوه گیاه قره‌‌قاط جمعآوری شده از استان‌های اردبیل، گیلان و مازندران دریافتند که بیشترین مقدار ترکیبات فنلی و آنتوسیانین مربوط به میوه قره‌‌قاط منطقه کلاردشت مازندران و بیشترین مقدار ترکیبات فلاونوئیدی بر حسب کوئرستین مربوط به برگ منطقه ماسوله گیلان می‌‌باشد.
نتایج مطالعه‌‌ای اسمل کرویک و همکاران (2006) مشخص کرد که اختلاف معنی داری در بعضی ترکیبات ثانویه موجود در اسانس گونه‌های مختلف گل راعی نظیرHypericum maculatum, Hypericum olympicum, Hypericum perforatum جمعآوری شده در سالهای متفاوت از بعضی مناطق با تنوع فصلی وجود دارد. همچنین گزارش شد که صفات ژنتیکی و عوامل اکولوژیکی از مهمترین عوامل مؤثر در نوع و میزان ترکیبات ثانویه موجود در اسانس گل گونه‌های گل راعی هستند.

-104361-473572

3- مواد و روش‌ها
3-1- مواد گیاهی
در این تحقیق از گزنه‌های خودرو در ارتفاعات مختلف استان‌های مازندران و گلستان استفاده شد.
3-2- وسایل و دستگاههای مورد استفاده
کلروفیلسنج: جهت اندازهگیری میزان کلروفیل برگ
خطکش
ترازوی دیجیتال
آسیاب برقی
دستگاه موقعیت سنج (GPS)
سانتریفوژ آزمایشگاهی
دستگاه اسپکتروفتومتر
دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)
3-3- مواد شیمیایی
مواد شیمیایی مورد استفاده در این تحقیق عبارت بودند از: متانول، معرف فولین سیوکالته، کربنات سدیم، کلرید آلومینیوم، استات پتاسیم، تیوسولفات سدیم، استاندارد اسید گالیک، کوئرستین، کلروژنیک اسید، کافئیک اسید، روتین، استونیتریل، اسید استیک و اسیتو نیتریل.
تمامی مواد شیمیایی و معرفها از شرکت مرک و حلالها با بالاترین خلوص تهیه شدند.
3-4- آمادهسازی گیاه گزنه
اجرای این پژوهش شامل دو مرحله می‌‌باشد. مرحله اول: شناسایی مکان رویش و جمعآوری گیاه گزنه، پس از انتخاب مناطق در زمستان سال 1390 در زمان گلدهی گیاه گزنه (بهار سال 91) جهت جمعآوری به زیستگاه‌‌های مورد نظر در استان مازندران و گلستان مراجعه شد. سپس تعداد چندین نمونه کامل گیاهی به طور تصادفی از هر منطقه جمعآوری و پس از بررسی برخی صفات مورفولوژیکی، اقدام به خشکاندن اندام‌‌های گیاه (برگ، ساقه، گل و ریشه) بصورت جداگانه در شرایط خشک، سایه و تهویه مناسب شد (شکل 3-1). اندام‌‌های خشک شده بصورت جداگانه با استفاده از آسیاب برقی به پودر تبدیل شده و از الک با مش 18 عبور داده شد. نمونه‌‌های خشک شده در پاکت‌‌های مخصوص و نایلونی به منظور جلوگیری از نفوذ رطوبت در داخل آن بسته‌بندی شدند. و تا زمان آزمایش در فریزر 18- درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند.

شکل 3-1- الف- رویشگاه گزنه در منطقه چهارباغ گرگان، ب- فیروزجاه بابل، پ- خشک کردن گزنه
در زمان مراجعه به زیستگاه گزنه، از هر منطقه که گیاه مورد نظر جمعآوری شد با استفاده از دستگاه موقیعتسنج GPS اقدام به تعیین موقعیت جغرافیایی منطقه از نظر ارتفاع از سطح دریا، طول و عرض جغرافیایی گردید. برای بررسی خصوصیات اقلیمی زیستگاه‌‌ها بر اساس نزدیکترین ایستگاه هواشناسی به زیستگاه، آمار بلندمدت از پارامتر‌‌های هواشناسی مانند متوسط درجه‌‌حرارت و متوسط بارندگی تهیه شد (جدول 3-1). جهت تعیین مهمترین خصوصیات خاکشناسی از هر زیستگاه نمونه خاک تصادفی از عمق صفر تا 30 سانتی‌متر برداشته شده و به آزمایشگاه خاکشناسی دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان برای آزمون خاک انتقال داده شد. بافت خاک، ماده آلی خاک، شوری و اسیدیته خاک از مهمترین خصوصیات خاکشناسی مورد مطالعه بود (جدول 3-2). مرحله دوم: عصاره‌‌گیری و آنالیز بیوشیمیایی، جهت عصاره‌‌گیری و استخراج ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی از حلال متانول استفاده شد و برای آنالیز بیوشیمیایی ترکیبات فنلی(اسیدکلروژنیک و اسید کافئیک) و فلاونوئیدی (روتین) از روش کروماتوگرافی مایع (HPLC) استفاده شد.
3-5- صفات مورفولوژیکی مورد مطالعه گیاه گزنه
به منظور ارزیابی برخی صفات ریخت‌شناسی از هر منطقه پنج نمونه کامل گیاهی در فصل گلدهی گیاه انتخاب و 13 صفت کمی رویشی و زایشی(طول برگ، عرض برگ، نسبت طول به عرض برگ، تعداد برگ در بوته، تعداد گره، فاصله گره، اندازه گلآذین، تعداد گلآذین در بوته، قطر ساقه، قطر ریشه، طول ریشه، ارتفاع گیاه و میزان کلروفیل) با پنج تکرار برای هر صفت بررسی شد.
3-6- صفات بیوشیمیایی مورد مطالعه گیاه گزنه
فنل و فلاونوئید کل، اسید کلروژنیک، اسید کافئیک و روتین.

جدول 3-1- مشخصات جغرافیایی و هواشناسی رویشگاههای مورد مطالعه گیاه گزنه

جدول 3-2- مشخصات خاک رویشگاههای مورد مطالعه گیاه گزنه

3-7- استخراج عصاره متانولی
به منظور تهیه عصاره متانولی، ابتدا نمونه‌‌ها (برگ، ریشه، ساقه و گل) بصورت جداگانه در دمای طبیعی (دمای اتاق) خشک شد، سپس با آسیاب برقی به خوبی پودر و از الک شماره 18 گذرانده شد. نمونه‌‌های الک شده توزین شده و مقدار یک‌‌ گرم از هر نمونه به ارلن100 میلی‌‌لیتری انتقال یافته و با 10 سی‌‌سی متانول 80 درصد (نسبت 1 به 10) مخلوط شد. سپس نمونهها به مدت 24 ساعت روی همزن قرار داده شد، بعد به مدت 5 دقیقه در 3000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس عصاره خالص رویی برای اندازه‌‌گیری فنل کل و محتوی فلاونوئید نمونه‌ها مورد استفاده قرار گرفت.
3-7-1- اندازه‌گیری فنل کل
مقدار کل ترکیبات فنلی موجود در عصاره گیاه گزنه توسط رنگ سنجی به روش فولین سیو کالتو (ابراهیم‌‌زاده و همکاران، 2008) با کمی تغییر مورد بررسی قرار گرفت. در این روش مقدار کل ترکیبات فنلی بر اساس یک ترکیب فنلی که اغلب مواقع اسید گالیک میباشد انتخاب و نتایج آن به صورت اکیوالانت اسید گالیک بیان میگردد. ابتدا 20 میکرولیتر از عصاره متانولی برداشته شده و با 16/1 میلی‌‌لیتر آب مقطر و 100 میکرولیتر فولین سیوکالتیو مخلوط شد. بعد از 8-1 دقیقه استراحت، 300 میکرولیتر کربنات‌‌سدیم یک مولار (6/10 گرم در 100 میلی‌‌لیتر آب مقطر) به محلول افزوده شده و به مدت 30 دقیقه در حمام بخار oC40 در تاریکی قرار گرفت. برای تهیه شاهد، متانول خالص جایگزین عصاره متانولی گردید. سپس محلول حاصل در طول موج 760 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت گردید. برای رسم منحنی کالیبراسیون از غلظت‌‌های متفاوت گالیکاسید (50، 100، 200، 250، 350 میلی‌‌گرم بر لیتر) در متانول: آب (50:50) استفاده گردید. در معادله خطی حاصل به‌‌جای Y، عدد قرائت شده در مقابل بلانک قرار داده شد و به این ترتیب X به‌‌دست آمد. این مقدار برای یک گرم در لیتر محاسبه شد و فنل کل بر حسب میلی‌‌گرم گالیک اسید در یک گرم نمونه خشک بدست آمد (شکل 3-2).

شکل 3-2- نمودار استاندارد گالیک اسید3-7-2- اندازه‌‌گیری محتوی فلاونوئیدی
برای محاسبه محتوای فلاونوئید از روش آلومینیوم کلراید (ابراهیم‌‌زاده و همکاران، 2008) استفاده شد؛ به این صورت که 5/0 میلی‌‌لیتر از عصاره متانولی با 5/1 میلی‌‌لیتر متانول، 1/0 میلی‌‌لیتر آلومینیوم کلرید 10درصد در اتانول (10 گرم آلومینیوم کلرید در 100 میلی‌‌لیتر اتانول و آبمقطر)، 1/0 میلی‌‌لیتر استاتپتاسیم یکمولار (41/2 گرم در 10 میلی‌‌لیتر آب مقطر) و 8/2 میلی‌‌لیتر آبمقطر مخلوط شد. برای تهیه شاهد، متانول خالص جایگزین عصاره متانولی گردید. محلول حاصل 30 دقیقه در تاریکی قرار داده شده و سپس در طول موج 415 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت شد. جهت رسم منحنی استاندارد از غلظت‌‌های مختلف استاندارد کوئرستین (10، 50، 100 و 200 میلی‌‌گرم بر لیتر) استفاده شد. از معادله خط بدست آمده برای تعیین غلظت فلاونوئید کل استفاده گردید (شکل 3-3).

شکل 3-3- نمودار استاندارد کوئرستین
3-8- اندازه‌‌گیری اسید کلروژنیک و اسید کافئیک با استفاده از دستگاه HPLC
3-8-1- آمادهسازی نمونه
به منظور تعیین نوع ترکیبات فنلی موجود در عصاره از روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا استفاده شد. برای این منظور جهت آماده‌‌سازی نمونه، یک گرم نمونه (برگ، ریشه، ساقه و گل) پودر شده با دقت 001/0 توزین گردید و در 10 میلی‌لیتر متانول خالص (1: 10) مخصوص HPLC همگن شد، و به مدت 10 دقیقه در اولتراسوند قرار داده شد (لوله محتوی محلول کاملاً به وسیله فویل آلومینیومی در برابر نور محافظت گردید) و به مدت 12 ساعت روی همزن قرار داده شد، سپس به مدت 10 دقیقه در دور 3500 سانتریفیوژ گردید. بخش فوقانی محلول بعد از گذشتن از فیلتر سرنگی، به ظروف مخصوص HPLC منتقل گردید و آماده تزریق به دستگاه HPLC شد. مشخصات دستگاه به شرح زیر بود:
مدل دستگاه: مرک- هیتاچی ال- 7100
دتکتور: دیود اری هیتاچی ال- 2450
آون ستون: هیتاچی ال-2300
نوع ستون: آر پی- 18 با ابعاد 6/4 250 میلی‌متر و اندازه ذرات 5 میکرومتر
فاز متحرک مورد استفاده در این بررسی شامل 1 میلیلیتر اسیداستیک، 89 میلیلیتر آب مقطر دیونیزه شده و 10 میلیلیتر استونیتریل با سرعت جریان یک میلیلیتر در دقیقه و دمای 25 درجه سانتی‌‌گراد بود. با مقایسه زمان تأخیر و سطح زیر منحنی نمونه با نمونه‌‌های استاندارد، میزان اسید کافئیک و اسید کلروژنیک تعیین و در نهایت بر اساس میلی‌‌گرم بر گرم وزن خشک برگ یا دیگر اندام خشک بیان گردید. (تراجیتنبرگ و همکاران، 2008؛ سانتوز-گامز و همکاران، 2003).
3-8-2- تهیه نمودار کالیبراسیون اسید کلروژنیک و اسید کافئیک
به منظور رسم منحنی‌‌های استاندارد از استاندارد‌‌های اسید کلروژنیک با غلظت‌‌های 10، 20، 50، 100، 150 و 200 و برای اسید کافئیک با غلظت‌‌های 20، 25، 50، 100،


تاثیر ارتفاع روی خصوصیات مورفولوژیکی و برخی مواد ثانویه گیاه گزنه(Urtica dioica) در استان‌های مازندران و گلستان پایان نامه ها
قیمت: 11200 تومان

این نوشته در پایان نامه ها ارسال شده است. افزودن پیوند یکتا به علاقه‌مندی‌ها.

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *